JP4826860B2 - 光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置、それに用いられるセンサユニット、および光電流を用いた被検物質の特異的検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、光電流を用いて、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合性を有する被検物質を特異的に検出する方法、それに用いられるセンサユニット及び測定装置に関する。

生体試料中のＤＮＡを解析する遺伝子診断法が、各種病気の新たな予防および診断法として、有望視されている。このようなＤＮＡ解析を簡便かつ正確に行う技術として、以下のものが提案されている。

被検体ＤＮＡを、これと相補的な塩基配列を有し、かつ蛍光物質を標識されたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、その際の蛍光シグナルを検出する、ＤＮＡの分析方法が知られている（例えば、特開平７−１０７９９９号公報（特許文献１）および特開平１１−３１５０９５号公報（特許文献）２参照）。この方法にあっては、ハイブリダイゼーションによる二本鎖ＤＮＡの形成を色素の蛍光により検出する。

また、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを、これに相補性を有する一本鎖の核酸プローブとハイブリダイゼーションさせた後、インターカレータ等の二本鎖認識体を添加して電気化学的に検出する方法が知られている（例えば、特許第２５７３４４３号公報（特許文献３）および表面科学Vol. 24, No. 11. Pp. 671-676, 2003（非特許文献１）参照）。

一方、近年、ダイオキシンを始めとする外因性内分泌撹乱物質（環境ホルモン）の生殖系および神経系等への障害が社会問題化している。現在、外因性内分泌撹乱毒性の検出は様々な方法によって行われているが、そのような物質はわずか１０ｐｐｔレベル程度の極めて低い濃度で毒性を示す。このため、そのような低濃度範囲における外因性内分泌撹乱物質の検出方法が望まれている。

特に、外因性内分泌撹乱物質は、受容体等のタンパク質を介して標的ＤＮＡに結合し、それにより当該ＤＮＡの発現等に影響を与え、毒性を生じる。すなわち、外因性内分泌撹乱物質は、ＤＮＡに直接的に結合するのではなく、受容体等のタンパク質を介して間接的ＤＮＡに結合する。そのため、ＤＮＡ結合性を用いたプレスクリーニング等の従来の方法にあっては、その結合の評価は容易ではない。

増感色素を用いて光から電気エネルギーを発生させるものとして太陽電池が知られている（例えば、特開平１−２２０３８０号公報（特許文献４）参照）。この太陽電池は、多結晶の金属酸化物半導体を有し、かつその表面積に広範囲にわたり増感色素の層が形成されてなるものである。

さらに、このような太陽電池の特性を生物化学的な分析に応用しようとする試みとして、色素の光励起により生じる光電流を被検物質（ＤＮＡ、蛋白などの生体分子）の検出に利用する提案がなされている（例えば、特開２００２−１８１７７７号公報（特許文献５）参照）。このような色素の光励起により生じる光電流を利用して被検物質の検出を行う方法において、その測定精度の向上が依然として求められており、本発明者らの知る限りでは、いわゆるノイズ電流の原因の特定と効率のよいその影響の排除が求められていた。

また、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化し、一本鎖に変性された遺伝子を含む検体と反応させた後、遺伝子とハイブリダイズした前記核酸プローブに二本鎖認識体を結合しこれを電気化学測定によって検出することによって前記目的遺伝子の存在を確認する遺伝子検出装置が知られている（例えば、特開２０００−８３６４７号公報（特許文献６）参照）。ここで、電気化学測定は、作用電極および対電極を電解液に浸し、リニアスイープボルタンメトリーによる酸化電流を測定することにより行われている。この方法によれば制度の高い被検物質の検出が可能とされているが、作用電極において被検物質を補足するスポットは単一であることが必要であり、複数の試料の効率のよい測定が可能となる手法が依然として求められている。

特開平７−１０７９９９号公報 特開平１１−３１５０９５号公報 特許第２５７３４４３号公報 特開平１−２２０３８０号公報 特開２００２−１８１７７７号公報 特開２０００−８３６４７号公報

表面科学Vol. 24, No. 11. Pp. 671-676,2003

本発明者らは、今般、 被検物質の特異的検出に色素の光励起により生じる光電流を利用する方法において、作用電極と対電極に電解質含有体が接触した際に生じる電流を放電することにより、効率よく、高精度での被検物質の検出が可能になるとの知見を得た。さらに本発明者らは、同一の作用電極の複数の箇所において、被検物質を捉え、色素の光励起により生じる光電流を利用して被検物質を特異的に検出する際に、直前の検出箇所に生じた電流を放電することにより、さらに効率よく、短時間で、高精度での被検物質の検出が可能になるとの知見を得た。本発明はこれら知見に基づくものである。

従って、本発明は、効率よく、高精度での被検物質の検出が可能な、光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置および光電流を用いた被検物質の特異的検出方法の提供をその目的としている。

そして、本発明による測定装置は、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた、被検物質の特異的検出に用いられる測定装置であって、作用電極、対電極、及び電解質含有体を含んでなるセンサユニットと、前記作用電極に光を照射する単一又は複数の光源と、前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と、充電電流および直前の検出スポット由来の光電流を放電させるための放電機構と、前記センサユニットを電流計又は放電機構に接続するスウィッチング機構とを備えてなり、被検物質の特異的検出が、光照射のタイミング及び電流計及び放電機構への接続のタイミングを制御して行なわれることを特徴とするものである。
さらに、本発明によれば、上記装置の好ましい態様として、前記作用電極と前記対電極とを電解質含有体に接触させたときに前記センサユニットを前記放電機構に接続し、センサユニットを形成させた際に生じる充電電流を放電し、前記充電電流を放電させた後に、前記センサユニットを前記電流計に接続し、前記作用電極上に形成した単一又は複数の検出スポットに順次光を照射し、検出スポットに結合した前記増感色素由来の光電流を検出するよう制御された測定装置が提供される。
さらに、本発明のより好ましい態様として、上記装置において、複数の検出スポットの光電流検出を行う場合、一つの検出スポットの光電流の検出の後に、前記センサユニットを前記放電機構に接続し、直前に光電流の検出が行われた検出スポット由来の光電流を放電させた後に、再びセンサユニットを前記電流計に接続し、検出スポットに光を照射し、検出スポットに結合した前記増感色素由来の光電流を検出するよう制御された装置が提供される。
さらに、本発明による被検物質の特異的検出方法は、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を表面に坦持した単一又は複数の検出スポットを備えた作用電極と、対電極とを用意し、前記作用電極に、前記被検物質を含む可能性ある試料液を接触させて、前記被検物質を作用電極に結合させ、ここで、前記増感色素は、前記被検物質が前記プローブ物質に結合したときに、作用電極にともに固定されるものであり、次いで、前記作用電極に光を照射し、前記作用電極と対電極との間に流れる前記増感色素由来の光電流を検出し、前記被検物質の存在を検出する方法において、前記作用電極と前記対電極とを電解質含有体に接触させたときに生じる充電電流を放電し、前記充電電流を放電させた後に、前記作用電極上に形成した単一又は複数の検出スポットに順次光を照射し、検出スポットに結合した色素由来の光電流を検出することを特徴とする。
本発明の好ましい態様によれば、上記方法において、複数の検出スポットの光電流検出を行う場合、一つの検出スポットの光電流の検出の後に、当該検出スポット由来の光電流を放電させた後に、別の検出スポットに光を照射し、該検出スポットに結合した前記増感色素由来の光電流を検出する方法が提供される。

本発明によれば、ノイズである充電電流及び前の検出スポット由来の光電流を放電させることにより、披検物質の特異的検出における検出精度を向上させ、また、検出時間を大幅に短縮することが可能となる。

本発明における光電流検出時のセンサセルの一例を示す図である。 センサユニット形成時に生じる充電電流の一例を示したグラフである。 複数の検出スポットを設けた作用電極の配置の一例を示す図である。 直前の検出スポット由来のノイズ電流を示したグラフである。 電解質含有シートを使用し、光源をXY移動機構に設置した測定装置の基本構成を示す概念図である。 電解質含有シートを使用し、複数の光源又は光照射部を有する測定装置の基本構成を示す概念図である。 電解質含有シートを使用し、複数の光源又は光照射部をXY移動機構に設置した測定装置の基本構成を示す概念図である。 電解質含有シートを使用し、センサセルをXY移動機構に設置した測定装置の基本構成を示す概念図である。 電解質含有シートを使用し、複数の光源又は光照射部を有し、センサセルをXY移動機構に設置した測定装置の基本構成を示す概念図である。 電解液を使用した測定装置の基本構成を示す概念図である。 基準点及び複数の検出スポットを設けた作用電極の配置の一例を示す図である。 図５の測定装置により、図１１の配置で検出スポットを設けた作用電極を電流検出した際のタイミングチャートを示す。 図６の測定装置により、図１１の配置で検出スポットを設けた作用電極を電流検出した際のタイミングチャートを示す。 図７に示す測定装置の光源とXY移動機構の構成及び作用電極上に形成される検出スポットの配置の一例を示す。 作用電極上に形成させた検出スポットへの光照射方法及び電流検出方法のフローチャートに示す。 本発明の電解質含有シート使用時の第一の態様によるセンサユニットの断面図よび分解図を示す。 本発明の電解質含有シート使用時の第二の態様によるセンサユニットの断面図および分解図を示す。 本発明の電解質含有シート使用時の第二の態様によるセンサユニットの断面図および分解図を示す。 本発明の電解質含有シート使用時の第二の態様によるセンサユニットの断面図および分解図を示す。 本発明の電解液使用時のフロー型センサユニットを用いた測定装置の一例を示す。 本発明の電解液使用時のフロー型センサユニットの一例を示す。 被検物質が一本鎖の核酸であり、プローブ物質が前記核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図であり、（ａ）は被検物質が予め増感色素で標識されてなる場合を、（ｂ）は二本鎖の核酸にインターカレーション可能な増感色素を添加した場合をそれぞれ示す。 被検物質がリガンドであり、媒介物質が受容体蛋白質分子であり、プローブ物質が二本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図である。 実施例に使用した測定装置のセンサユニットの分解斜視図を示す。 実施例に使用した測定装置のセンサユニットの断面図を示す。 実施例において得られた、各検出スポットに光照射した際に得られる光電流値の経時変化を示す図である。 実施例において得られた、各検出スポット由来電流とベース電流の差分を、各プローブＤＮＡについて整理した図であり、平均および標準偏差（エラーバーは±１ＳＤ）を示している。 図１４に示す測定装置の光源及び作用電極上に形成される検出スポットの配置の詳細を示す図である。

測定装置及び特異的検出方法
本発明による装置および検出方法の基本的な特徴をまず図面を用いて説明する。被検物質の特異的検出に色素の光励起により生じる光電流を利用する際、図１に示すように、作用電極と対電極の間に電解質含有体を充填させる。電解質は、光照射により励起された色素に電子を供与するための還元剤（電子供与剤）として機能できる物質であり、電解質を充填させた際に、作用電極と対電極の間に電位差が生じ、光電流検出初期の段階では図２のＡに示すような充電電流が発生する。これらノイズである充電電流の影響が大きいと、披検物質の特異的検出の精度が低下してしまう。本発明にあっては、この充電電流を測定前に放電させることを特徴とする。この問題を回避するために、充電電流が低下し、ベース電流が安定するまで待った後に、光電流検出することが考えられるが、本発明によればこのような待ち時間は必要ではなく、高精度の測定が直ちに可能となる。

さらに、本発明にあっては、図３に示すように作用電極１上に複数の検出スポット２０を設け、各検出スポットに順次光を照射し、光電流検出する場合、直前の検出スポット由来の光電流値を放電させることを特徴とする。この電流が放電されないと（図４、B参照）、精度良い検出ができない。この問題を回避するために、十分な時間光非照射スポットで待機した後に、光電流の検出を行うことが考えられるが、本発明によれば、短時間で複数の検出スポットの測定が可能となる点で極めて有利である。

本発明による測定装置を図面を用いてさらに説明する。図５〜図１０は、本発明による、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた披検物質の特異的検出に用いられる測定装置の一例を示すものである。図５〜図９には電解質含有体として、電解質含有シートを用いた際の一例を示し、図１０には電解質含有体として、電解液を用いた際の一例を示す。図５は電解質含有体として、電解質含有シート２を用いる装置の構成であって、作用電極１、電解質含有シート２、対電極３、が含まれるセンサユニット７と、作用電極１と対電極３との間を流れる電流を測定する電流計４と、光源８、と、光源８を作用電極１に対してXY方向に移動させるXY移動機構９と、充電電流及び直前の検出スポット由来の光電流を放電させるための放電機構１１と、センサユニット７を放電機構１１又は電流計４に接続させるスウィッチング機構１０と、を有し、光源８、XY移動機構９、電流計４、およびスウィッチング機構１０を制御し、さらに電流計４からの電流信号の受信を、インターフェースボード６を介して行なうコンピューター５が含まれる。コンピューター５は電気信号に基づいて被検物質の存在、型、および濃度の少なくとも一種を決定するような制御演算手段を備え、さらに測定装置には制御演算手段で得られた結果を表示する表示装置１３をさらに備えてもよい。また、測定装置が、測定のための条件の入力が行われる入力装置１２をさらに備えてもよい。さらに、電流計から得られた電気信号、制御演算手段で得られた結果、測定のための条件を記憶する記憶装置１４を備えてもよい。なお、コンピューター５は外部取り付けのＰＣを用いてもよいし、あるいは、装置内に組み込まれたマイコンを用い、入力装置１２、表示装置１３、および記憶装置１４も測定装置内に組み込んでもよい。入力装置１２、表示装置１３、および記憶装置１４の機能を装置内組込みのマイコンと外部取り付けのＰＣに適宜振り分けて機能させることもできる。

図１１に作用電極１上に形成される検出スポット２０の配置の一例を示す。図１１に示す検出スポットの配置の場合、検出スポットへの光の照射順は、基準点２０−１に光照射し基準となる電流値を取得し、一行目の一列目のスポット２０−２から最終スポット２０−４まで順に検出スポットに光を照射して電流を取得することとなる。

図１２に、図５の測定装置により、図１１の配置で検出スポットを設けた作用電極を電流検出する際のタイミングチャートを示す。まずセンサユニット７は電流計４に接続され、光源８を点灯させ、作用電極１と対電極３間に流れる電流値を検出終了まで保存するための記憶装置１４を起動させる。その後、スウィッチング機構１０により、センサユニット７は放電機構１１に接続され、センサユニット７を形成させた際に生じる充電電流を放電させた後に、再び電流計４に接続され、XY移動機構９により光源８が基準点２０−１に光照射可能となる地点に移動し、基準点２０−１由来の電流が発生する。なお、基準点での電流取得は作用電極間の再現性を確認するために行なうものであるため、異なる配置、異なる種類の溶液をスポットした基板であっても、基準点にスポットする溶液種、濃度は一定にしておくことが望ましい。ただし、基準点を設けなくても作用電極上に設けられた検出スポットの電流検出が可能であることはいうまでもない。

基準点由来の電流値が記憶装置１４に保存された後、XY移動機構９により、光源８が一行目の一列目のスポット２０−２に光照射可能となる地点に移動する前に、スウィッチング機構１０により、センサユニット７は放電機構１１に接続され、センサユニット７に充電した基準点由来の電流を放電させ、再びスウィッチング機構１０により、センサユニット７は電流計４に接続される。その後、一行目の一列目のスポット２０−２に光が照射され、スポット２０−２由来の電流値が記憶装置１４に保存される。

スポット２０−２由来の電流値が記憶装置１４に保存された後、XY移動機構９により、光源８が一行目の二列目のスポット２０−３に光照射可能となる地点に移動する前に、スウィッチング機構１０により、センサユニット７は放電機構１１に接続され、センサユニット７に充電したスポット２０−２由来の電流を放電させ、再びスウィッチング機構１０により、センサユニット７は電流計４に接続される。その後、一行目の二列目のスポット２０−３に光が照射され、スポット２０−３由来の電流値が記憶装置１４に保存される。これらステップを最終スポット２０−４の電流検出まで繰り返し、全ての検出スポット由来の電流値が記憶装置１４に保存される。

充電電流の放電は、時間による制御が好ましい。すなわち、一定時間放電回路に接続させた後に電流計に再接続するといった、プログラムをコンピューター５に制御させる構成とした方が好ましい。このような放電の制御は、作用電極と対電極とを電解質含有体に接触させたときに生じる充電電流の放電においても、放電直前の検出スポット由来の光電流の放電においても同様に適用可能である。

作用電極上の検出スポットの増感色素由来の電流を検出する基本原理について説明する。まず、被検物質を含む試料液と、作用電極と、対電極とを用意する。本発明に用いる作用電極は、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を表面に備えた電極である。すなわち、プローブ物質は、被検物質と直接、特異的に結合する物質のみならず、被検物質を受容体蛋白質分子等の媒介物質に特異的に結合させて得られる結合体と特異的に結合可能な物質であってよい。次いで、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により増感色素を作用電極に固定させる。増感色素は、光励起に応じて作用電極に電子を放出可能な物質であり、被検物質あるいは媒介物質に予め標識させておくか、あるいは被検物質およびプローブ物質の結合体にインターカレーション可能な増感色素を用いる場合には試料液に単に添加すればよい。

そして、作用電極と対電極とを電解質媒体に接触させた後、上述したような方法により、作用電極に光を照射して増感色素を光励起させると、光励起された増感色素から電子受容物質へ電子移動が起こる。この電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出することにより、被検物質を高い感度で検出することができる。また、この検出電流は試料液中の被検試料濃度との高い相関関係を有しているので、測定された電流量または電気量に基づき被検試料の定量測定を行うことができる。

図６に示す測定装置は、複数の光源又は光照射部８を有し、光源のXY移動機構を有しないこと以外は図５に示す測定装置と同様の構成で、図６の測定装置は各検出スポットに対応した複数の光源又は光ファイバなどで光源から連結させた複数の光照射部を有している。各検出スポットに対応した光源又は光照射部の光照射のタイミングはコンピューター５によって制御され、各検出スポットに光照射した際に得られる電流を測定することにより、各検出スポットの電流値を取得する。

図１３に図６の測定装置により、図１１の配置で検出スポットを設けた作用電極を電流検出した際のタイミングチャートを示す。まずセンサユニット７は電流計４に接続され、作用電極１と対電極３間に流れる電流値を検出終了まで保存するための記憶装置１４を起動させる。その後、スウィッチング機構１０により、センサユニット７は放電機構１１に接続され、センサユニット７を形成させた際に生じる充電電流を放電させた後に、再び電流計４に接続され、光源８−０を点灯させ、基準点２０−１由来の電流が発生し、基準点由来の電流値が記憶装置１４に保存された後、光源８−０を消灯させると共に、スウィッチング機構１０により、センサユニット７は放電機構１１に接続され、センサユニット７に充電した基準点由来の電流を放電させ、再びスウィッチング機構１０により、センサユニット７は電流計４に接続される。そして、光源８−１を点灯させ、一行目の一列目のスポット２０−２に光が照射され、スポット２０−２由来の電流値が記憶装置１４に保存される。

スポット２０−２由来の電流値が記憶装置１４に保存された後、光源８−１を消灯させると共に、スウィッチング機構１０により、センサユニット７は放電機構１１に接続され、センサユニット７に充電したスポット２０−２由来の電流を放電させ、再びスウィッチング機構１０により、センサユニット７は電流計４に接続される。その後、光源８−２を点灯させ、一行目の二列目のスポット２０−３に光が照射され、スポット２０−３由来の電流値が記憶装置１４に保存される。これらステップを最終スポット２０−４の電流検出まで繰り返し、全ての検出スポット由来の電流値が記憶装置１４に保存され、測定された電流量または電気量に基づき被検試料の定量測定を行う。

図７に示す測定装置は、複数の光源又は光照射部８とXY移動機構９を併せもつこと以外は図５に示す測定装置と同様の構成で、図７の測定装置は複数の光源又は光ファイバなどで光源から連結させた複数の光照射部とXY移動機構９を併せ持つことで、全検出スポットに光を順に照射できるような構成となっており、各検出スポットに対応した光源又は光照射部の光照射のタイミング及びXY移動機構９の移動のタイミングはコンピューター５によって制御され、各検出スポットに光照射した際に得られる電流を測定することにより、各検出スポットの電流値を取得する。

図１４に図７に示す測定装置の光源８とXY移動機構９の構成及び作用電極１上に形成される検出スポットの配置の一例を示す。図１４に示す作用電極には３行×４列の検出スポットが配置されており、光源８−A、光源８−B、光源８−Cの順に点灯した後に、XY移動機構９が２列目の検出スポット位置に移動し、再び光源８−A、光源８−B、光源８−Cの順に点灯して、最終列の検出スポットまで光が照射できるように光源が点灯及び消灯する構成となっている。ただし、本例において、XY移動機構９は、１軸のみ、すなわち行方向のみ、の移動機構である。本発明において、XY移動機構とは、複数整列した検出スポットの行方向及び／又は列方向に、光源等の対象物を平行移動させる機構を意味する。

図１４のように、検出スポットの列または行と同数の光源と１軸の移動機構とを有する構成の装置は、２軸のXY移動機構を有する装置と比べ、装置形状を小型化できるという利点を有する。

また、図１４に示す測定装置における光照射方法の他の一態様として、光源８−Ａが点灯した後に、１軸の移動機構により、１列目、２列目、３列目、４列目の検出スポットに順に移動し、光照射及び光電流検出され、その後、光源８−Ａが消灯及び光源８−Ｂが点灯した後に、４列目の検出スポットに光照射され、３列目、２列目、１列目、と順に光照射及び光電流検出され、さらにその後光源８−Bが消灯及び光源８−Ｃが点灯した後に、１列目の検出スポットに光照射され、２列目、３列目、４列目、と順に光照射及び光電流検出がされる方法も考えられる（図２８参照）。この光照射方法は光強度が安定するまでに時間を要するレーザーなどを光源として用いる際に、特に有効で、以下の表１に各検出スポットへの光照射方法のフローチャートの一例を示す。表１のような光照射方法および電流検出方法を用いると、安定した光強度のレーザー光を短時間で各検出スポットに照射することができ、高い精度で電流を検出可能となる。

図８に示す測定装置は、光源８に対し、センサセル７がXY移動機構９により移動すること以外は図５に示す測定装置と同様の構成となっている。同様に図９に示す測定装置は、複数の光源又は光照射部８とXY移動機構９を併せもち、センサセル７がXY移動機構９により移動すること以外は図５に示す測定装置と同様の構成となっており、各検出スポットに対応した光源又は光照射部の光照射のタイミング及びXY移動機構９の移動のタイミングはコンピューター５によって制御され、各検出スポットに光照射した際に得られる電流を測定することにより、各検出スポットの電流値を取得する。

図１０に示す測定装置は、電解質含有体として、電解液を用いる測定装置で、測定装置に含まれるセンサユニットには、作用電極、対電極、前記作用電極及び前記対電極に送液する溶液が接触するように設けられた流路が含まれる。なお、送液する溶液は電解液２’、作用電極上のプローブ物質と特異的に反応する反応物質が含まれる反応溶液、洗浄液などで、作用電極１と対電極３の間に供給及び排出され、測定装置にはさらに溶液を送液する際に用いるポンプ１６、さらに送液する溶液の制御に必要なバルブ１７を備えており、ポンプ１６、バルブ１７はコンピューター５によって制御されている。また、これら測定装置はポンプ１６、バルブ１７を有し、それらがコンピューター５によって制御され、センサユニット７内に溶液を送液するための流路が形成されていること以外は図５に示す測定装置と同様の構成であってよい。また、作用電極１上の検出スポットへの光の照射方法及び電流検出方法は、上述した図５〜図１０のいずれの方法も用いることができる。また、図１０に示す測定装置において、バルブ１７は必ずしも備えなくても良い。バルブを備えない態様にあっては、溶液の切り替えは手動で行い、送液はコンピューター５がポンプ１６を制御することにより行うことが好ましい。

以上説明した作用電極上に形成させた検出スポットへの光照射方法及び電流検出方法を図１５のフローチャートに示す。本発明による測定装置及び特異的検出方法は、種々の光照射方法及びセンサユニット構成において、光照射のタイミング及び電流計及び放電機構への接続のタイミングを制御して、精度良い検出を可能としている。

電解質含有シート使用時のセンサユニット
本発明の電解質含有シート使用時の第一の態様によるセンサユニットは、作用電極と対向して設けられる対電極と、作用電極および対電極の間に挟持される電解質含有シートとを備えてなり、作用電極および対電極の各電極表面が電解質含有シートと接触してなるものである。すなわち、作用電極の表側（被検物質が固定化されている側）と対電極の導電面（白金など）が対向し、電解質含有シートと接触する配置になっている。図１６に第一の態様によるセンサユニットの断面図よび分解図を示す。図１６に示されるセンサユニット１１０にあっては、作用電極１１１が対電極１１２の上方に位置し、作用電極１１１および対電極１１２の間に電解質含有シート１１３が挟持される。また、センサユニット１１０は、対電極１１２を支持する支持基材１１４を備える。センサユニット１１０の最上部には、支持基材１１４に向かって、作用電極１１１、電解質含有シート１１３、および対電極１１２を互いに密着させるように下方に押さえる押さえ部材１１５が設けられる。
このセンサユニットにあっては、各部品が積み上げられる順序は図示例に限定されず、図１６に示される順序と逆の順序で上下逆さとなるように積み上げられてもよく、この場合には、作用電極を支持する支持基材と、支持基材に向けて、対電極、電解質含有シート、および作用電極を互いに密着させるように押さえる押さえ部材とがさらに設けられる構成とすればよい。また、図示例では各部材が水平に配置されているが、各部材を立てた状態で配置してもよい。押さえ部材１１５には、光励起のための光を通すための開口部または透光部をさらに備えてなるのが好ましい。

本発明の電解質含有シート使用時の第二の態様によるセンサユニットは、作用電極および対電極が同一平面上にパターニングされてなる電極ユニットと、作用電極および対電極の各電極表面に接触して設けられる電解質含有シートとを備えてなる。図１７〜１９に第二の態様によるセンサユニットの断面図および分解図を示す。図１７に示されるセンサユニット１２０にあっては、電極ユニット１２１と対向して対向部材１２２が設けられ、電極ユニット１２１および対向部材１２２の間に電解質含有シート１２３が挟持される。すなわち、対向部材１２２上に置かれた電解質含有シート１２３上に、被検物質を固定化した側が下になるように電極ユニット１２１が配置される。また、センサユニット１２０には、対向部材１２２に向けて、電極ユニット１２１および電解質含有シート１２３を互いに密着させるように押さえる押さえ部材２４が設けられる。一方、図１８に示されるセンサユニット１３０にあっては、電極ユニット１３１には電極ユニットを支持する支持基材１３４がさらに設けられ、対向部材１３２が、支持基材１３４に向けて、電解質含有シート１３３および電極ユニット１３１を互いに密着させるように押さえる押さえ部材として機能する。すなわち、支持基材１３４上に、被検物質を固定化した側が上になるように電極ユニット１３１が置かれ、電極ユニット１３１上に電解質含有シート１３３が配置される。これらセンサユニットにあっては、各部品が積み上げられる順序は図示例に限定されず、図１７および１８に示される順序と逆の順序で上下逆さとなるように積み上げられてもよい。また、図示例では各部材が水平に配置されているが、各部材を立てた状態で配置してもよい。押さえ部材１２４，１３２は、光励起のための光を通すための１つ以上の開口部または透光部をさらに備えてなるのが好ましい。なお、図１８に示されるセンサユニット１３０では照射光が電解質含有シートを通過することになるので、着色性を有する電解質等を使用する場合には光強度の減衰が問題とならないように、光源や電解質濃度を適宜調整するのが好ましい。一方、図１９に示されるセンサユニット１４０にあっては、電極ユニット１４１には電極ユニットを支持する支持基材１４４が設けられるとともに、支持基材１４４に向けて、電極ユニット１４１を密着させるように押さえる押さえ部材１４２が設けられる。この押さえ部材１４２は、電極ユニット１４１の端部ないしその近傍のみを覆い、電極ユニット１４１上に十分な開放部分を確保するように構成されるのが好ましく、これにより電解質含有シート１４３の電極ユニット１４１上への載置がし易くなる。また、押さえ部材１４２の電極ユニット１４１に接触する部分をコンタクトプローブ１４７で構成するのが好ましい。こうして押さえ部材１４２により保持される電極ユニット１４１上の、好ましくは押さえ部材１４２で覆われない開放部分に、電解質含有シート１４３が載置される。

図１６および１９に示されるセンサユニット１１０，１４０において、光源（図示せず）からの光は作用電極１１１ないし電極ユニット１４１の裏側より照射され、透明な作用電極１１１ないし電極ユニット１４１を透過して作用電極１１１ないし電極ユニット１４１の表面に到達する。一方、図１７および１８に示されるセンサユニット１２０，１３０にあっては、光源からの光は押さえ部材１２４，１３２の開口部を通過して電極ユニット１２１，１３１の表面に到達する。こうして作用電極に到達した光による増感色素の光励起により発生する光電流値は電流計で検出されることができる。作用電極および対極を電流計に接続する手段は限定されるものではなく、例えば、リード線を直接接続する、あるいは図示例のようにコンタクトプローブ１１７，１２７，１３７，１４７を介して接続することなどの手段を採用することができる。特に、測定毎に着脱する作用電極については、コンタクトプローブを用いることで作用電極の着脱が容易になるという利点がある。

電解液使用時のフロー型センサユニット
本発明の電解液使用時のフロー型センサユニットを用いた測定装置の一例を図２０に示す。図２０に示されるフロー型測定用センサユニット５１は、測定時には、光源５２と、電解液タンク５３と、洗浄液タンク５４と、供給ポンプ５５と、電流計５６と、排出ポンプ５７とを組み合わせて使用される。フロー型測定用センサユニット５１は、作用電極５８と、対電極５９とを備えてなり、作用電極５８および対電極５９に接触するように、電解液、洗浄液、反応溶液を収容しかつ流すことができる流路が形成される。すなわち、供給ポンプ５５により測定用センサユニット５１内に供給された電解液、洗浄液、反応溶液は、作用電極５８および対電極５９に接触しながら流路を通過した後、排出ポンプ５７により測定用センサユニット５１外に排出されるように構成されている。

本発明の電解液使用時のフロー型センサユニットは、被検物質が増感色素と共に固定された作用電極を、対電極と共に電解液に接触させ、作用電極に光を照射して増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出する。作用電極および対電極の相対的な位置関係は、互いに電気的に短絡することなく、なおかつ電解質媒体に接触しさえしていれば限定されるものではなく、互いに対向させて配置してもよいし、あるいは同一平面上に互いに離間させて配置してもよい。なお、作用電極および対電極が同一平面上に互いに離間させて配置される場合には、作用電極と対電極との間の電気的な短絡を防止するために絶縁基板上に両電極が設けられるのが望ましい。

図２１にセンサユニットの一例を示す。図２１のセンサユニットは基板３０上に対電極２３が設けられ、この基板３０には電解液または洗浄液の供給孔３１および排出孔３２が形成され、対電極２３上には電解液を収容する空間２４を有する絶縁スペーサ２５が配置され、この絶縁スペーサ２５上に作用電極２２が設けられ、この作用電極２２の空間２４に臨む面に複数の電子受容層２７が離間して形成されている。

そして、対電極２３と干渉しないように前記基板３０を貫通して作用電極用接点３３が設けられている。この作用電極用接点３３は電子受容層２７に結合したプローブを電気的接点とすることで電極の取り出しを行っている。

また、前記作用電極２２の上には押え部材３４が設けられ、この押え部材３４には前記複数の電子受容層２７のそれぞれに対応した位置に貫通孔３５が形成されている。この貫通孔３５を介して、光源２８からの光が作用電極２２に照射される。そして、作用電極２２および対電極２３間には電流計３６が接続され、光照射により系内を流れる光電流が電流計により測定される。

電解質含有シート
本発明に用いる電解質含有シートは、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出において電解質媒体として用いられるシート状の電解質含有体である。そして、この電解質含有シートは、含水性基材と、含水性基材中に含有される電解質とを含んでなる。

本発明において電解質は、含水性基材中を自由に移動して増感色素、作用電極、および対電極との間で電子の授受に関与できるものであれば限定されず、幅広い種類の電解質が使用可能である。好ましい電解質は、光照射により励起された色素に電子を供与するための還元剤（電子供与剤）として機能できる物質であり、そのような物質の例としては、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、ヨウ化カルシウム（ＣａＩ_２）、ヨウ化リチウム（ＬｉＩ）、ヨウ化アンモニウム（ＮＨ_４Ｉ）、テトラプロピルアンモニウムヨージド（ＮＰｒ_４Ｉ）、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_３）、ヒドロキノン、Ｋ_４［Ｆｅ（ＣＮ）_６］・３Ｈ_２Ｏ、フェロセン−１，１’−ジカルボン酸、フェロセンカルボン酸、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）、トリエチルアミン、チオシアネートアンモニウム、ヒドラジン（Ｎ_２Ｈ_４）、アセトアルデヒド（ＣＨ_３ＣＨＯ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＴＭＰＤ）、Ｌ−アスコルビン酸、亜テルル酸ナトリウム（Ｎａ２ＴｅＯ３）、塩化鉄(II)四水和物（ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ）、ＥＤＴＡ、システイン、トリエタノールアミン、トリプロピルアミン、ヨウ素を含むヨウ化リチウム（Ｉ／ＬｉＩ）、トリス(2-クロロエチル)リン酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタノールアミン、二酸化チオ尿素、（ＣＯＯＨ）_２、ＨＣＨＯ、およびこれらの組合せが挙げられ、より好ましくは、ＮａＩ、ＫＩ、ＣａＩ_２、ＬｉＩ、ＮＨ_４Ｉ、テトラプロピルアンモニウムヨージド（ＮＰｒ_４Ｉ）、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３）、および亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_３）、およびこれらの混合物であり、さらに好ましくは、テトラプロピルアンモニウムヨージド（ＮＰｒ_４Ｉ）である。

（１）ゲルシート
本発明の好ましい態様によれば、含水性基材が、天然ゲルおよび合成ゲルから選択される少なくとも一種を含んでなるゲルマトリクスであって、該ゲルマトリクス中に前記電解質が分散されてなるのが好ましい。すなわち、この態様にあっては、電解質含有シートはゲルシートとして構成される。

本発明の好ましい態様によれば、ゲルシートは、１００ｇ／ｃｍ^２以上のゲル強度を有するのが好ましく、より好ましくは１２０ｇ／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１５０ｇ／ｃｍ^２以上である。このようなゲル強度であると、ゲルシートを単独で取り扱いやすくなるので、作用電極と対電極の間に容易に挟み込んだり、取り外したりでき、その結果、センサユニット構造および検出手順を大幅に簡素化できる。

本発明においてゲルシートの形態としては、作用電極および対電極との良好な密着性が確保されるように各電極との接触部分が平滑平面とされているのが好ましい。したがって、作用電極と対電極との間に挟み込んで使用する場合には、密着性に影響しないように均一な厚みを有する形態とするのが好ましい。一方、作用電極および対電極が同一平面状にパターニングされてなる電極ユニットを使用する場合には、少なくとも電極ユニットと接触する片側面のみが平滑平面とされていればよく、厚さや厚さの均一性は特段問題とならない。

本発明の好ましい態様によれば、ゲルシートは０．１〜１０ｍｍの厚さを有するのが好ましく、より好ましくは０．５〜３ｍｍ、さらに好ましくは１〜３ｍｍの厚さを有する。このような厚さであるとゲルシートを単独で取り扱うのに適した強度が得られやすいので、作用電極と対電極の間に容易に挟み込んだり、取り外したりでき、あるいは持ち運んだりすることができ、その結果、センサユニット構造および検出手順を大幅に簡素化できる。また、光電流測定に悪影響を与えることもない。

本発明においてゲルマトリクスは、天然ゲルおよび合成ゲルから選択される少なくとも一種を含んでなり、適度な強度と電極への密着性を示すゲルであれば限定されない。これらのゲルは、一般的なゲルと同様、ゲル化剤が水等の溶媒と共にゲル化することにより形成されることができる。ゲルマトリクス中におけるゲル化剤の濃度は、光電流測定に大きな影響を与えることはないため、単独取り扱いを可能とする強度確保の観点からゲル化剤の種類に応じて適宜決定されてよい。

本発明の好ましい態様によれば、ゲルマトリクスが、多糖類および蛋白質を主成分とする天然ゲルを含んでなるのが好ましい。このような天然ゲルの好ましい例としては、アガロース、アルギン酸、カラギーナン、ローストビーンガム、ジェランガム、ゼラチン、およびそれらの混合物のゲルが挙げられ、より好ましくはアガロースのゲルである。好ましいアガロースの添加量は０．５〜２５重量％である。

本発明の別の好ましい態様によれば、ゲルマトリクスが、合成ゲルを含んでなるのが好ましい。好ましい合成ゲルの例としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、ＰＶＡ添加ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキサイド、Ｎ−アルキル変性（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−（イソ）プロピルアクリルアミド、Ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシプロピルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシブチルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸、ｔ−ブチル（メタ）アクリルアミドスルホン酸、スルホプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、（ポリ）アルキレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、グリセリン（メタ）アクリレート、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、エチレンビス（メタ）アクリルアミド、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、グリセリントリ（メタ）アクリレート、テトラアリロキシエタン、およびそれらの混合物のゲルが挙げられ、より好ましくはポリアクリルアミドのゲルである。

本発明の好ましい態様によれば、本発明のゲルシートは、（１）電解質およびゲル化剤を水に加えて加熱溶解してゲルを作製した後、所望のシート形状に加工する方法、あるいは（２）ゲル化剤のみでゲルを形成して所望のシート形状に加工した後、電解質溶液中に浸漬させてゲル中に電解質を分散させる方法により、製造されることができる。特に、ゲル化剤は使用する電解質との組合せによっては、混合、加熱、あるいは冷却によってゲル化しない場合があり、そのような場合であっても上記（２）の方法によれば、ゲルシートを作製することができる。

（２）吸水性シート
本発明の別の好ましい態様によれば、含水性基材が、吸水性基材であるのが好ましい。すなわち、この態様にあっては、電解質含有シートは吸水性シートとして構成される。そして、電解質媒体として吸水性シートを使用した場合、電解液を使用した場合と同等の検出感度および検出精度が得られる。すなわち、吸水性シートの使用により、光電流を精度よく検出することができる。

本発明の好ましい態様によれば、吸水性シートは、２０％以上の含水率を有するのが好ましく、より好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは４０％以上である。このような含水率であると、光電流を検出した際に高い光電流を検出することができ、検出感度が向上する。含水率は（１ｍｍ３
辺りの含水量）／（吸水性基材の密度）より求める。なお、ここで言う含水率は光電流を検出する際の吸水性シートの含水率であって、後述するように、保管時に上記含水率を満たしていなくてもよい。

本発明の吸水性シートの形態としては、作用電極および対電極との良好な密着性が確保されるように各電極との接触部分が平滑平面とされているのが好ましい。したがって、作用電極と対電極との間に挟み込んで使用する場合には、密着性に影響しないように均一な厚みを有する形態とするのが好ましい。一方、作用電極および対電極が同一平面状にパターニングされてなる電極ユニットを使用する場合には、少なくとも電極ユニットと接触する片側面のみが平滑平面とされていればよく、厚さや厚さの均一性は特段問題とならない。

本発明の好ましい態様によれば、吸水性シートは０．０１〜１０ｍｍの厚さを有するのが好ましく、より好ましくは０．１〜３ｍｍの厚さを有する。このような厚さであると吸水性シートを単独で取り扱うのに適した強度が得られやすいので、作用電極と対電極の間に容易に挟み込んだり、取り外したりでき、あるいは持ち運んだりすることができ、その結果、センサユニット構造および検出手順を大幅に簡素化できる。また、光電流測定に悪影響を与えることもない。

本発明において吸水性基材は、綿、麻、ウール、絹、セルロースなどの天然繊維；ろ紙、製紙などに用いられるパルプ繊維；レーヨンなどの再生繊維；ろ紙などに用いられるガラス繊維；フェルト、スポンジなどに用いられる合成繊維から選択される少なくとも一種の繊維を含んでなるのが好ましく、適度な強度、含水量、電極への密着性を示す吸水性基材であれば限定されない。なお、本発明の吸水性基材に用いる繊維の加工方法は特定の加工方法に限定されない。

本発明の好ましい態様によれば、吸水性基材の好ましい例としては、ろ紙、メンブレンフィルター、ガラスフィルター、ろ布などが挙げられ、より好ましくはろ紙、メンブレンフィルターである。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の電解質含有吸収性シートは、（１）所望のシート形状に加工し、水ベースの電解液に浸漬した後、使用する、あるいは（２）所望のシート形状に加工し、電解液に浸漬し、乾燥させた後、使用直前に水を滴下して使用することもできる。

電解液
本発明において用いられる電解液は、電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒と、所望により添加物とを含んでなる。電解質は電解質含有シートに用いられるものと同様で、溶媒は、非プロトン性溶媒、プロトン性溶媒、またはそれらの混合物である。すなわち、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒系のものや、非プロトン性の極性溶媒を用いることができる。非プロトン性の極性溶媒としては、アセトニトリルなどのニトリル類、炭酸プロピレンや炭酸エチレンなどのカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノンや３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩などの複素環化合物やジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホランなどを用いることができる。電解質媒体に含まれる溶媒は、複数の種類を混合して用いることができ、実使用上、検出対象に応じて溶媒組成を適宜変更可能である。

光源
本発明において、用いられる光源としては、標識色素を光励起できる波長の光を照射できるものであれば限定されず、好ましい例としては、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色、青、緑、赤）、レーザー（ＣＯ_２レーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光を用いることができ、より好ましくは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色、青、緑、赤）、太陽光等を挙げることができる。また、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみを照射してもよい。

本発明の好ましい態様によれば、互いに異なる光波長で励起可能な二種以上の増感色素を用いて複数種類の被検物質を個別に検出する場合、光源から波長選択手段を介して特定波長の光を照射することにより、複数の色素を個別に励起することが可能である。波長選択手段の例としては、分光器、色ガラスフィルター、干渉フィルタ、バンドパスフィルタ等が挙げられる。また、増感色素の種類に応じて異なる波長の光を照射可能な複数の光源を用いてもよく、この場合の好ましい光源の例としては、特定波長の光が照射されるレーザー光やLEDを用いてもよい。また、作用極に光を効率よく照射するため、石英、ガラス、液体ライトガイドを用いて導光してもよい。

被検物質およびプローブ物質
本発明における被検物質としては、特異的な結合性を有する物質であれば限定されず、種々の物質であってよい。このような被検物質であれば、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を作用電極表面に担持させておくことにより、被検物質をプローブ物質に直接または間接的に特異的に結合させて検出することが可能となる。

すなわち、本発明にあっては、被検物質およびプローブ物質として互いに特異的に結合可能なものを選択することができる。すなわち、本発明の好ましい態様によれば、特異的な結合性を有する物質を被検物質とし、被検物質と特異的に結合する物質をプローブ物質として作用電極に担持させるのが好ましい。これにより、作用電極上に被検物質を直接、特異的に結合させて検出することができる。この態様における、被検物質およびプローブ物質の組合せの好ましい例としては、一本鎖の核酸および核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸の組合せ、ならびに抗原および抗体の組合せが挙げられる。

本発明のより好ましい態様によれば、被検物質を一本鎖の核酸とし、プローブ物質を核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸とするのが好ましい。この態様における被検物質の作用電極への特異的結合の工程を図２２（ａ）および（ｂ）に示す。これらの図に示されるように、被検物質としての一本鎖の核酸１は、作用電極６３上に担持されたプローブ物質としての相補性を有する一本鎖の核酸６４とハイブリダイズされて、二本鎖の核酸６７を形成する。

一本鎖の核酸を被検物質とする場合、プローブ物質である核酸と相補性部分を有していればよく、被検物質を構成する塩基対の長さは限定されないが、プローブ物質が核酸に対して１５ｂｐ以上の相補性部分を有するのが好ましい。本発明の方法によれば、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐの塩基対を有する比較的鎖長の長い核酸であっても、高感度にプローブ物質と被検物質の核酸同士の特異的結合形成を光電流として検出することができる。

被検物質としての一本鎖の核酸を含む試料液は、末梢静脈血のような血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞等の、核酸を含有する各種検体試料から、公知の方法により核酸を抽出して作製することができる。このとき、検体試料中の細胞の破壊は、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて担体を振動させることにより行なうことができる。また、核酸抽出溶液を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。核酸溶出溶液の例としては、ＳＤＳ、Triton-X、Tween-20のような界面活性剤、サポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液が挙げられる。これらの溶液を用いて核酸を溶出する場合、３７℃以上の温度でインキュベ−トすることにより反応を促進することができる。

本発明のより好ましい態様によれば、被検物質とする遺伝子の含有量が微量である場合には、公知の方法により遺伝子を増幅した後検出を行なうのが好ましい。遺伝子を増幅する方法としては、ポリメラ−ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）等の酵素を用いる方法が代表的であろう。ここで、遺伝子増幅法に用いられる酵素の例としては、ＤＮＡポリメラ−ゼ、Ｔａｑポリメラ−ゼのようなＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラ−ゼ、ＲＮＡポリメラ−ゼＩのようなＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラ−ゼ、Ｑβレプリカ−ゼのようなＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラ−ゼが挙げられ、好ましくは温度を調節するだけで連続して増幅を繰り返すことができる点で、Ｔａｑポリメラ−ゼを用いるＰＣＲ法である。

本発明の好ましい態様によれば、上記増幅時に特異的に核酸を増感色素で標識することが出来る。一般的には、ＤＮＡにアミノアリル修飾ｄUTPを取り込ませることにより行うことができる。この分子は未修飾の dUTP と同じ効率で取り込まれる。次のカップリング段階において、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）により活性化された蛍光色素が修飾 dUTP と特異的に反応し、均一に増感色素で標識された被検物質が得られる。

本発明の好ましい態様によれば、上記のようにして得られた核酸の粗抽出液あるいは精製した核酸溶液をまず９０〜９８℃、好ましくは９５℃以上の温度で熱変性を施し、一本鎖核酸を調製することができる。

本発明にあっては、被検物質とプローブ物質が間接的に特異的に結合するものであってもよい。すなわち、本発明の別の好ましい態様によれば、特異的な結合性を有する物質を被検物質とし、この被検物質と特異的に結合する物質を媒介物質として共存させ、この媒介物質と特異的に結合可能な物質をプローブ物質として作用電極に担持させるのが好ましい。これにより、プローブ物質に特異的に結合できない物質であっても、媒介物質を介して作用電極上に間接的に特異的に結合させて検出することができる。この態様における、被検物質、媒介物質、およびプローブ物質の組合せの好ましい例としては、リガンド、このリガンドを受容可能な受容体蛋白質分子、およびこの受容体蛋白質分子と特異的に結合可能な二本鎖の核酸の組合せが挙げられる。リガンドの好ましい例としては、外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）が挙げられる。外因性内分泌撹乱物質とは、受容体蛋白質分子を介してＤＮＡに結合し、その遺伝子発現に影響して毒性を生じる物質であるが、本発明の方法によれば、被検物質によりもたらされる受容体等のタンパク質のＤＮＡに対する結合性を簡便にモニタリングすることができる。この態様における被検物質の作用電極への特異的結合の工程を図２３に示す。図２３に示されるように、被検物質としてのリガンド７０は、まず、媒介物質である受容体蛋白質分子７１に特異的に結合する。そして、リガンドが結合された受容体蛋白質分子７３が、プローブ物質としての二本鎖の核酸７４に特異的に結合する。

本発明によれば、１つのプローブ物質に対し、異なる入手経路に由来する複数の同一被検物質を同時に反応させ、サンプルの由来による被検物質量の差異を判断することにより、目的とする入手経路に由来する被検物質を定量することも可能である。具体的な適用例としては、マイクロアレイ上での競合的ハイブリダイゼーションによる発現プロフィール解析が挙げられる。これは、細胞間での特定遺伝子の発現パターンの差異を解析するため、別々の蛍光色素で標識された被検物質を、同一プローブ物質に対して競合的にハイブリダイゼーションを行わせるものである。本発明においては、このような手法を用いることにより、細胞間での発現差異解析が電気化学的に行えるという、従来に無い利点が得られる。

増感色素
本発明にあっては、被検物質の存在を光電流で検出するために、増感色素の共存下、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させて、該結合により増感色素を作用電極に固定させる。そのために、本発明にあっては、図２２（ａ）および図２３に示されるように被検物質６１あるいは媒介物質７１に予め増感色素６２で標識しておくことができる。また、図２２（ｂ）に示されるように被検物質およびプローブ物質の結合体６７（例えばハイブリダイゼーション後の二本鎖核酸）にインターカレーション可能な増感色素６８を用いる場合には、試料液に増感色素を添加することにより、プローブ物質に増感色素を固定させることができる。

本発明の好ましい態様によれば、被検物質が一本鎖の核酸の場合、被検物質１分子につき増感色素を一つ標識するのが好ましい。一本鎖の核酸における標識位置は、容易に被検物質とプローブ物質の特異的な結合を形成させる観点から、一本鎖の核酸の５’’末端または３’末端のいずれかの位置とするのが好ましく、標識工程をさらに簡便にする観点から被検物質の５’末端とするのがさらに好ましい。

また、本発明の別の好ましい態様によれば、被検物質１分子あたりの増感色素担持量を高める為、被検物質１分子につき増感色素を２つ以上標識するのが好ましい。これにより、電子受容物質の形成された作用電極における単位比表面積あたりの色素担持量をより多くすることができ、より高感度に光電流応答を観測することができる。

本発明に用いる増感色素は、光励起に応じて作用電極に電子を放出可能な物質であり、光源の照射による光励起状態への遷移が可能であり、かつ励起状態から作用電極に電子注入できる電子状態を採りうるものであればよい。したがって、用いる増感色素は、作用電極、特に電子受容層との間において上記電子状態をとることができるものであればよいことから、多種の増感色素が使用可能であり、高価な色素を使用する必要がない。

複数の被検物質の個別検出を行う態様にあっては、各々の被検物質に標識する増感色素は、それぞれ異なる波長の光で励起できるものであればよく、例えば、照射光の波長を選択することにより各被検物質を個別に励起できればよい。例えば、複数の被検物質に対応する複数の増感色素を用い、各増感色素毎に異なる励起波長の光を照射すると、複数のプローブが同一スポット上であっても個別に信号を検出することが可能となる。本発明において、被検物質の数は限定されないが、光源から照射される光の波長と増感色素の吸収特性を考慮すると、１〜５種類が適当であろう。この態様において使用可能な増感色素は、照射光の波長領域内において光励起しさえすればよく、必ずしもその吸収極大が該波長領域にある必要はない。なお、特定波長における増感色素の光吸収反応の有無は、紫外可視スペクトロフォトメーター（例えば、島津製作所社製、ＵＶ−３１５０）を用いて測定することができる。

増感色素の具体例としては、金属錯体や有機色素が挙げられる。金属錯体の好ましい例としては、銅フタロシアニン、チタニルフタロシアニン等の金属フタロシアニン；クロロフィルまたはその誘導体；ヘミン、特開平１−２２０３８０
号公報や特表平５−５０４０２３ 号公報に記載のルテニウム、オスミウム、鉄及び亜鉛の錯体（例えばシス−ジシアネート−ビス（２、２’−ビピリジル−４、４’−ジカルボキシレート）ルテニウム（II））があげられる。有機色素の好ましい例としては、メタルフリーフタロシアニン、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン系色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、インジゴ系色素等が挙げられる。また、増感色素の別の好ましい例としては、アマシャムバイオサイエンス社製のＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ｃｙ９；モルキュラープローブ社製のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０；Ｄｙｏｍｉｃｓ社製のＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹＱ−６６０、ＤＹＱ−６６１が挙げられる。

二本鎖核酸にインターカレーション可能な増感色素の好ましい例としては、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイドが挙げられる。このような増感色素を用いる場合、核酸のハイブリダイゼーション後に試料液に添加するだけで増感色素で標識された二本鎖核酸が形成されるので、予め一本鎖の核酸を標識する必要が無い。

作用電極およびその製造
本発明に用いられる作用電極は、上記プローブ物質を表面に備えた電極であり、プローブ物質を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電極である。したがって、作用電極の構成および材料は、使用される増感色素との間で上記電子移動が生じるものであれば限定されず、種々の構成および材料であってよい。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極が増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面にプローブ物質が備えられてなるのが好ましい。また、本発明のより好ましい態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、この導電性基材上に電子受容層が形成されてなるのが好ましい。この態様の電極は図２２および図２３に示される。図２２および図２３に示される作用電極６３は、導電性基材６５と、この導電性基材６５上に形成され、電子受容物質を含んで成る電子受容層６６とを備えてなる。そして、電子受容層６６の表面にプローブ物質６４が担持される。

本発明における電子受容層６６は、プローブ物質６４を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる。すなわち、電子受容物質は、光励起された標識色素からの電子注入が可能なエネルギー準位を取り得る物質であることができる。ここで、光励起された標識色素からの電子注入が可能なエネルギー準位（Ａ）とは、例えば、電子受容性材料として半導体を用いる場合には、伝導帯（コンダクションバンド：CB）を意味する。すなわち、本発明に用いる電子受容物質は、このＡの準位が、増感色素のLUMOのエネルギー準位よりも卑な準位、換言すれば、増感色素のＬＵＭＯのエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有するものであればよい。

電子受容物質としては、シリコン、ゲルマニウムなどの単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バリウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドミウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマスの硫化物半導体；カドミウム、鉛のセレン化物半導体；カドミウムのテルル化物半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化物半導体；ガリウムヒ素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物の化合物半導体が挙げられる。なお、上記の列挙した半導体は、真性半導体および不純物半導体のいずれであってもよい。

一方、本発明の好ましい態様によれば、電子受容物質は酸化物半導体を用いる。より好ましくは、TiO₂、ZnO、SnO₂、Fe₂O₃、WO₃、Nb₂O₅、Ta₂O₃、In₂O₃、チタン酸ストロンチウムであり、最も好ましくはTiO₂、インジウム−スズ複合酸化物（ＩＴＯ）またはフッ素がドープされた酸化スズ（ＦＴＯ）をもちいることができる。ＩＴＯおよびＦＴＯは電子受容層のみならず導電性基材としても機能する性質を有するため、これらの材料を使用することにより導電性基材を用いることなく電子受容層のみで作用電極として機能させることができる。

電子受容物質として半導体を用いる場合、その半導体は単結晶および多結晶のいずれであってもよいが、多結晶体が好ましく、さらに緻密なものよりも多孔性を有するものが好ましい。これにより、比表面積が大きくなり、被検物質および増感色素を多く吸着させて、より高い感度で被検物質を検出することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が多孔性を有しており、各孔の径が３〜１０００ｎｍであるのが好ましく、より好ましくは、１０〜１００ｎｍである。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容層を導電性基材上に形成した状態での表面積は、投影面積に対して１０倍以上であることが好ましく、さらに１００倍以上であることが好ましい。この表面積の上限には特に限定されないが、通常１０００倍程度であろう。電子受容層を構成する電子受容物質の微粒子の粒径は、投影面積を円に換算したときの直径を用いた平均粒径で一次粒子として５〜２００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは８〜１００ｎｍであり、さらに好ましくは２０〜６０ｎｍである。また、分散物中の電子受容性物質の微粒子（二次粒子）の平均粒径としては０．０１〜１００μｍであることが好ましい。また、入射光を散乱させて光捕獲率を向上させる目的で、粒子サイズの大きな、例えば３００ｎｍ程度の電子受容物質の微粒子を併用して、電子受容層を形成してもよい。

凹凸構造によって、電子受容層６６の表面積を大きくしてプローブ分子を多く固定化することで検出感度を上げることができる。生体分子の大きさが０．１〜２０ｎｍ程度であるため、凹凸構造により形成される細孔径は２０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下が好ましい。凹凸構造により生じる空間の入口がそれ以下であれば、比表面積は増大するが生体分子とプローブとの結合ができず、検出信号は低下する。凹凸が粗ければ表面積もあまり増えないため信号強度もそれ程上がらない。生体分子のセンシングに好適な、より好ましい範囲は５０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下である。

本発明の好ましい態様によれば、凸構造として、ナノスケールの柱（ピラー）を表面に規則正しく並べたピラー構造を採用するのが好ましい。その製法としては種々、知られているが、ナノメートルスケールの孔を有する陽極酸化アルミナを鋳型として用いる方法が一般的である。鋳型にセラミックのゾルを充填、熱処理した後に、エッチングによりアルミナの鋳型を除去する方法や、充填したセラミックのゾルを鋳型より離型した後に熱処理する方法がある。ピラー状のナノ構造体を製造する方法としては、特開２００４−１３０１７１で示された透明基体、透明導電層上にナノ構造体を製造する方法が挙げられる。ここでは、陽極酸化アルミナの鋳型にチタニアゾルを充填し、３００〜４００℃の熱処理を行った後に鋳型をエッチングによって除去する方法が採られている。その結果、ナノ構造体としてチタニアのナノチューブやナノワイアが形成される。

本発明の好ましい態様によれば、凹構造として、セラミック成分を含む無機‐有機ハイブリッド前駆体を焼成し、有機物の酸化分解により気相となるために生じる気孔を採用するのが好ましい。無機‐有機ハイブリッド前駆体は、有機金属化合物（金属アルコキシド）の酸化とそれに続く重縮合反応によって生じる金属‐酸素のネットワーク構造と有機ポリマーなどが共存するものである。また、市販の酸化チタン粒子（たとえばテイカ株式会社製アナターゼ型結晶、商品名ＡＭＴ−６００（平均粒径３０ｎｍ）など）や酸化チタン分散液に有機ポリマーなどを添加する方法もある。これらの組成については種々の提案がなされており、たとえば特開平１０‐２１２１２０ではグライム系溶剤（ＨＯ‐（‐ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ‐）_ｎ‐Ｒ、ｎは１〜１０、Ｒはアルキル基あるいはアリール基）に酸化チタン粒子を分散させ、さらに分散助剤として有機ポリマーを加える組成が提案されている。この組成の分散液を適当な方法（ディップコーティング法、スプレーコーティング法、スピナーコーティング法、ブレードコーティング法、ローラーコーティング法、ワイパーバーコーティング法、リバースロールコーティング法）によって支持体上に塗布し、２００〜８００℃で焼成した場合、１ｃｍ^２（厚さ１μｍ）あたり４０〜５０ｃｍ^２の比表面積が達成されている。また、特開２００１‐２３３６１５ではテトラアルコキシチタンとエチレンオキサイド、プロピレンオキサイド、エチレンオキサイドブロックコポリマーと安定化剤と溶剤とからなるゾル溶液を基板上に滴下し、基板を高速回転させることで溶剤を蒸発させ、ゲル化させることで得られる三次元構造を有する有機無機複合チタニア薄膜を、高温焼結させてブロックコポリマーを除去することで微細な三次元凹構造を達成している。さらに、有機ポリマーとしてオリゴ糖（トレハロース）を用いる方法も開示されており（特開２００４‐８３３７６）、気孔率が３８〜５６％のセラミック多孔質膜が得られている。

このように、セラミックの微細な凹凸構造制御方法は種々提案されており、本技術に適したセラミック電極材料に応用することで、比表面積の大きい電極材料の創製が可能である。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、電子受容層が導電性基材上に形成されてなるのが好ましい。本発明に使用可能な導電性基材としては、チタン等の金属のように支持体そのものに導電性があるもののみならず、ガラスもしくはプラスチックの支持体の表面に導電材層を有するものであってよい。この導電材層を有する導電性基材を使用する場合、電子受容層はその導電材層上に形成される。導電材層を構成する導電材の例としては、白金、金、銀、銅、アルミニウム、ロジウム、インジウム等の金属；炭素、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス；およびインジウム−スズ複合酸化物、酸化スズにフッ素をドープしたもの、酸化スズにアンチモンをドープしたもの、酸化亜鉛にガリウムをドープしたもの、または酸化亜鉛にアルミニウムをドープしたもの等の導電性の金属酸化物が挙げられ、より好ましくは、インジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）、酸化スズにフッ素をドープした金属酸化物（ＦＴＯ）である。ただし、前述した通り、電子受容層自体が導電性基材としても機能する場合にあっては導電性基材は省略可能である。また、本発明において、導電性基材は、導電性を確保できる材料であれば限定されず、それ自体では支持体としての強度を有しない薄膜状またはスポット状の導電材層も包含するものとする。

本発明の好ましい態様によれば、導電性基材が実質的に透明、具体的には、光の透過率が１０％以上であるのが好ましく、より好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上である。これにより、作用電極の裏側（すなわち導電性基材）から光を照射させて、作用電極（すなわち導電性基材および電子受容層）を透過した光が増感色素を励起するようにセルを構成することができる。また、本発明の好ましい態様によれば、導電材層の厚みは、０．０２〜１０μｍ程度であるのが好ましい。さらに、本発明の好ましい態様によれば、導電性基材の表面抵抗が１００Ω／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは４０Ω／ｃｍ^２以下であるのが好ましい。導電性基材の表面抵抗の下限は特に限定されないが、通常０．１Ω／ｃｍ^２程度であろう。

導電性基材上への電子受容層の好ましい形成方法の例としては、電子受容物質の分散液またはコロイド溶液を導電性支持体上に塗布する方法、半導体微粒子の前駆体を導電性支持体上に塗布し空気中の水分によって加水分解して微粒子膜を得る方法（ゾル−ゲル法）、スパッタリング法、CVD法、PVD法、蒸着法などが挙げられる。電子受容物質としての半導体微粒子の分散液を作成する方法としては、前述のゾル−ゲル法の他、乳鉢ですり潰す方法、ミルを使って粉砕しながら分散する方法、あるいは半導体を合成する際に溶媒中で微粒子として析出させそのまま使用する方法等が挙げられる。このときの分散媒としては水または各種の有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル等）が挙げられる。分散の際、必要に応じてポリマー、界面活性剤、酸、もしくはキレート剤などを分散助剤として使用してもよい。

電子受容物質の分散液またはコロイド溶液の塗布方法の好ましい例としては、アプリケーション系としてローラ法、ディップ法、メータリング系としてエアーナイフ法、ブレード法等、またアプリケーションとメータリングを同一部分でできるものとして、特公昭５８−４５８９号公報に開示されているワイヤーバー法、米国特許２６８１２９４号、同２７６１４１９号、同２７６１７９１号等に記載のスライドホッパ法、エクストルージョン法、カーテン法、スピン法、スプレー法が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が半導体微粒子からなる場合、電子受容層の膜厚が０．１〜２００μｍであるのが好ましく、より好ましくは０．１〜１００μｍであり、さらに好ましくは１〜３０μｍ、最も好ましくは２〜２５μｍである。これにより、単位投影面積当たりのプローブ物質および固定される増感色素量を増加して光電流量を多くするとともに、電荷再結合による生成した電子の損失をも低減することができる。また、導電性基材１ｍ^２当たりの半導体微粒子の塗布量は０．５〜４００ｇであるのが好ましく、より好ましくは５〜１００ｇである。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容物質がインジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）または酸化スズにフッ素をドープした金属酸化物（ＦＴＯ）を含んでなる場合、電子受容層の膜厚が１ｎｍ以上であるのが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ〜１μｍである。

本発明の好ましい態様によれば、半導体微粒子を導電性基材上に塗布した後に加熱処理を施すのが好ましい。これにより、粒子同士を電気的に接触させ、また、塗膜強度の向上や支持体との密着性を向上させることができる。好ましい加熱処理温度は、４０〜７００℃であり、より好ましくは１００〜６００℃である。また、好ましい加熱処理時間は１０分〜１０時間程度である。

また、本発明の別の好ましい態様によれば、ポリマーフィルムなど融点や軟化点の低い導電性基材を用いる場合にあっては、熱による劣化を防止するため、高温処理を用いない方法により膜形成を行うのが好ましく、そのような膜形成方法の例として、プレス、低温加熱、電子線照射、マイクロ波照射、電気泳動、スパッタリング、ＣＶＤ、ＰＶＤ、蒸着等の方法が挙げられる。

こうして得られた作用電極の電子受容層の表面にはプローブ物質が担持される。作用電極へのプローブ物質の担持は公知の方法に従い行うことができる。本発明の好ましい態様によれば、プローブ物質として一本鎖の核酸を用いる場合には、作用電極表面に酸化層を形成させておき、この酸化層を介して核酸プローブと作用電極とを結合させることにより行うことができる。このとき、核酸プローブの作用電極への固定化は、核酸の末端に官能基を導入することにより行うことができる。これにより、官能基が導入された核酸プローブはそのまま固定化反応により担体上に固定化されることができる。核酸末端への官能基の導入は、酵素反応もしくはＤＮＡ合成機を用いて行なうことができる。酵素反応において用いられる酵素としては、例えば、タ−ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ−ゼ、ポリＡポリメラ−ゼ、ポリヌクレオチドカイネ−ス、ＤＮＡポリメラ−ゼ、ポリヌクレオチドアデニルトランスフェラ−ゼ、ＲＮＡリガ−ゼを挙げることができる。また、ポリメラ−ゼチェインリアクション（ＰＣＲ法）、ニックトランスレ−ション、ランダムプライマ−法により官能基を導入することもできる。官能基は、核酸のどの部分に導入されてもよく、３'末端、５'末端もしくはランダムな位置に導入することができる。

本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブの作用電極への固定化のため官能基として、アミン、カルボン酸、スルホン酸、チオール、水酸基、リン酸等が好適に使用できる。また、本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブを作用電極に強固に固定化するためには、作用電極と核酸プローブの間を架橋する材料を使用することも可能である。そのような架橋材料の好ましい例としては、シランカップリング剤、チタネートカップリング剤や、ポリチオフェン、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン等の導電性ポリマーが挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、核酸プロ−ブの固定化を物理吸着という、より簡単な操作で効率よく行うことも可能である。電極表面への核酸プロ−ブの物理吸着は、例えば、以下のように行なうことができる。まず、電極表面を、超音波洗浄器を用いて蒸留水およびアルコ−ルで洗浄する。その後、電極を核酸プロ−ブを含有する緩衝液に挿入して核酸プロ−ブを担体表面に吸着させる。

また、核酸プローブの吸着後、ブロッキング剤を添加することにより、非特異的な吸着を抑制することができる。使用可能なブロッキング剤としては、核酸プローブが吸着していない電子受容層表面のサイトを埋めることができ、かつ電子受容物質に対して化学吸着あるいは物理吸着等により吸着可能な物質であれば限定されないが、好ましくは化学結合を介して吸着可能な官能基を有する物質である。例えば、酸化チタンを電子受容層として用いる場合における好ましいブロッキング剤の例としては、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基、水酸基、アミノ基、ピリジル基、アミド等の酸化チタンに吸着可能な官能基を有する物質が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極上にプローブ物質が互いに分離された複数の領域毎に区分されて担持されてなり、光源による光照射が各領域に対して個別に行われるのが好ましい。これにより、複数の試料を一枚の作用電極上で測定することができるので、ＤＮＡチップの集積化等が可能となる。本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上にプローブ物質が担持された、互いに分離された複数の領域がパターニングされており、光源から照射される光でスキャニングしながら、各領域の試料について被検物質の検出または定量を一度の操作で連続的に行うことが好ましい。

本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域に複数種類のプローブ物質を担持させることができる。これにより、領域の個数に、各領域毎のプローブ物質の種類数を乗じた数の、多数のサンプルの測定を同時に行うことができる。

本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域毎に異なるプローブ物質を担持させることができる。これにより、区分された領域の数に相当する種類数のプローブ物質を担持させることができるので、多種類の被検物質の測定を同時に行うことができる。

対電極
本発明に用いられる対電極は、電解質媒体に接触させた場合に作用電極との間に電流が流れることができるものであれば特に限定されず、ガラス、プラスチック、セラミックス等の絶縁性の支持体に、金属もしくは導電性の酸化物を蒸着したものが使用可能である。また、対電極としての金属薄膜を５μｍ以下、好ましくは３ｎｍ〜３μｍの範囲の膜厚になるように、蒸着やスパッタリングなどの方法により形成して作成することもできる。対電極に使用可能な材料の好ましい例としては、白金、金、パラジウム、ニッケル、カーボン、ポリチオフェン等の導電性ポリマー、酸化物、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス等が挙げられ、より好ましくは、白金、カーボンであり、最も好ましくは白金である。これらの材料は電子受容層の形成方法と同様の方法により薄膜形成が可能である。

本発明による装置および方法を用いて、ｐ５３遺伝子の一塩基多型の検出を行った。作用電極側に完全一致プローブ、一塩基変異鎖プローブ、および完全不一致プローブを固定化した。それぞれの塩基配列は下記の通りとした。
完全一致（ＰＭ）プローブ： 5'-AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3'（配列番号１）
一塩基変異鎖（ＳＮＰ）プローブ：
5'-AGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGC-3'（配列番号２）
完全不一致（ＭＭ）プローブ： 5'-GCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCT-3'（配列番号３）

これらのプローブとハイブリダイゼーションさせるターゲットＤＮＡの塩基配列は下記の通りとした。
ターゲットＤＮＡ： 5'-Cy3-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT-3'（配列番号４）

作用電極用のガラス基材として、フッ素をドープした酸化スズ（F-SnO₂：FTO）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、U膜、シート抵抗：12Ω/□、形状：75mm×26mm）を用意した。このガラス基材をアセトン中で15分間、続いて超純水中で15分間超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。このガラス基材を5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させた。その後、水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪を水を入れ替えて3回行った。ガラス基材を取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させた後、ガラス基材を無水メタノールに浸漬させて脱水した。

95%メタノール5%超純水を溶媒として、3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）を0.2vol%となるように加え、室温下で5分間の攪拌を行って、カップリング処理用の溶液を調製した。このカップリング処理用溶液に上記ガラス基材を浸漬させ、ゆっくりと15分間振盪させた。次いで、ガラス基材を取り出し、メタノール中での３分間の振盪を水を入れ替えて3回行い、余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を行った。その後、ガラス基材を110℃で30分間保持してカップリング剤をガラス基材に結合させた。ガラス基材を室温下で冷却した後、1０μMに調製し、95℃で10分間保持した後、直ちに氷上に移して10分間保持してDNAを変性させた完全一致鎖、一塩基変異鎖、完全不一致鎖のプローブDNA（２５mer）を、マイクロアレイヤー（フィルジェン株式会社製LT-BA、スポットピン径=1.5mm）にて、3スポットずつスポットの中心間隔が５ｍｍとなるようスポットした。その後、95℃で３分保持して溶媒を蒸発させ、UVクロスリンカー（UVP社CL-1000型）で120mJの紫外光を照射して、プローブDNAをガラス基材に固定化した。それから、ガラス基材を0.2％SDS溶液中で5分間×3回振盪させ、さらに超純水で5分間×３回振盪させた。このガラス基材を沸騰水に2分間浸漬させて取り出した後、空気を吹き付けて残水を飛散させた。続いて、ガラス基材を4℃の無水エタノールに1分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残留エタノールを飛散させた。こうして、プローブＤＮＡ固定化作用電極を得た。さらに、ターゲットDNAを2％NaCl-0.05%SDS溶液にて濃度が１００nＭになるように調製し、95℃で10分間保持した後に、プローブを固定した電極を設置した自動ハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions製Hyb-4）に１３０μｌ送液した。自動ハイブリダイゼーション装置での処理は、45℃にて3分間ターゲットDNAをハイブリダイゼーション反応させた後、2ｘSSC-0.2％SDS溶液により28℃で3分間洗浄し、さらに水により28℃で1分間洗浄させた。こうして、電流検出用の作用電極を得た。

この作用電極を図５に示した構成の測定装置に設置した。なお、今回使用した測定装置のセンサユニットの分解斜視図を図２４に、断面図を図２５に示す。センサユニット８０には対電極８２、作用電極８３に電気的に接続するコンタクトプローブ９０、作用電極８３の位置決め用の位置決めピン８４、作用電極８３を位置決めピン８４に押し当てるために設けられた付勢部材８５、検出スポットへの光照射用の開口部８７、対電極８２に電気的に接続するコンタクトプローブ９０が設けられており、電解質含有シート８８を対電極上に載置した後、作用電極８３を位置決めピン８４に沿って表面が電解質含有シート８８に接触するように設置して、その後上部部材８６を下部部材８１に重ね合わせた。なお、電解質含有シート８８の電解質にはテトラプロピルアンモニウムヨージド（ＮＰｒ_４Ｉ）を用い（濃度は０．４Ｍ）、これを水に溶解して電解液を作製し、26mm×20mmに切った厚さ0.9mmのろ紙を浸漬させて、軽く水切りをし、電解質含有シート８８を得た。

センサユニット８０の上部にあるXYステージに取り付けた光源（波長：532nm、光径：約０．２ｍｍ、出力５０ｍＷ）を作用電極上のプローブDNA固定化スポットに順次３秒ずつ照射し、各スポット照射時に観察される光電流を記録した。また、今回の測定では、センサユニットと電流計を接続した後に放電回路に接続することにより、センサユニットを形成させた際に生じる充電電流を光電流検出開始前に放電させた。さらに各検出スポットの光電流値の計測前に、計測対象の検出スポットに対応するセンサユニットの開口部と直前に計測した検出スポットに対応する開口部との間で光源を１秒間停止させ、放電回路に接続し、前の検出スポット由来の電流を放電させた後に計測対象の検出スポットへ移動させるようにXYステージを制御した。両開口部の間で観察される電流値（すなわち、光が遮られて作用電極に照射されない状態での電流値）をベース電流値とし、各スポット由来の光電流値とその直前のベース電流値との差分を観察値とした。

得られた電流波形を図２６に、各スポット由来の光電流値とその直前のベース電流値との差分を各プローブＤＮＡについてまとめた結果（N=3）を図２７に示す。なお、各スポット由来の光電流値及びベース電流値は、各中心部の点5点の平均をそれぞれ値として算出している。得られた図２６の電流波形を見ると、光電流検出初期の充電電流を抑え、さらに直前の検出スポット由来の光電流値をリフレッシュすることができたため、図２７から明らかなように、一塩基の違い（ＰＭとＳＮＰｓで観察される電流値の差）を統計学的に有意に分別することができた。

Claims (24)

1. 増感色素の光励起により生じる光電流を用いた、被検物質の特異的検出に用いられる測定装置であって、
   作用電極、対電極、及び電解質含有体を含んでなるセンサユニットと、
   前記作用電極に光を照射する単一又は複数の光源と、
   前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と、
   充電電流および直前の検出スポット由来の光電流を放電させるための放電機構と、
   前記センサユニットを電流計又は放電機構に接続するスウィッチング機構とを備えてなり、
   被検物質の特異的検出が、光照射のタイミング及び電流計及び放電機構への接続のタイミングを制御して行なわれることを特徴とする、測定装置。
2. 前記作用電極と前記対電極とを電解質含有体に接触させたときに前記センサユニットを前記放電機構に接続し、センサユニットを形成させた際に生じる充電電流を放電し、
   前記充電電流を放電させた後に、前記センサユニットを前記電流計に接続し、前記作用電極上に形成した単一又は複数の検出スポットに順次光を照射し、検出スポットに結合した前記増感色素由来の光電流を検出するよう制御された、請求項１に記載の測定装置。
3. 複数の検出スポットの光電流検出を行う場合、一つの検出スポットの光電流の検出の後に、前記センサユニットを前記放電機構に接続し、直前に光電流の検出が行われた検出スポット由来の光電流を放電させた後に、再びセンサユニットを前記電流計に接続し、検出スポットに光を照射し、検出スポットに結合した前記増感色素由来の光電流を検出するよう制御された、請求項1または２に記載の装置。
4. 前記電解質含有体が電解質含有シートである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定装置。
5. 前記電解質含有体が電解液であり、
   前記センサユニットが、前記電解液が流れ、かつ前記作用電極及び前記対電極に前記電解液が接触するように設けられた流路を有し、さらに
   前記電解液を前記センサユニットの流路に送液するポンプと、を備えてなる、請求項１に記載の測定装置。
6. 前記電解液の送液を制御するバルブをさらに備えてなる、請求項５に記載の測定装置。
7. 前記電流計、前記光源、前記放電機構、前記スウィッチング機構を制御し、また前記電流計からの電流信号の受信を、インターフェースボードを介して行なうコンピューターをさらに備えてなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定装置。
8. 前記電流計、前記光源、前記放電機構、前記スウィッチング機構、ポンプを制御し、また前記電流計からの電流信号の受信を、インターフェースボードを介して行なうコンピューターをさらに備えてなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定装置。
9. 前記電流計、前記光源、前記放電機構、前記スウィッチング機構、ポンプ、バルブを制御し、また前記電流計からの電流信号の受信を、インターフェースボードを介して行なうコンピューターをさらに備えてなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定装置。
10. 前記前記コンピューターが、電気信号に基づいて、被検物質の存在、型、および濃度の少なくとも一種を決定する制御演算手段を備えてなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の測定装置。
11. 前記作用電極として、前記被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を表面に担持した単一又は複数の検出スポットを有するものを用い、
    前記作用電極の表面に、前記被検物質を含む試料液および前記増感色素を接触させて、前記特異的結合を介して前記増感色素を前記作用電極に固定させ、
    前記作用電極と前記対電極を電解質含有体に接触させ形成したセンサユニットを放電機構に接続し、センサユニットを形成させた際に生じる充電電流を電流検出開始前に放電し、前記充電電流を放電させた後に、前記センサユニットを電流計に接続し、前記作用電極上に形成した単一又は複数の検出スポットに順次光を照射し、各検出スポットに結合した色素由来の光電流を検出するよう制御された、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の測定装置。
12. 前記作用電極として、その表面の複数の検出スポットに、前記被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を坦持した単一又は複数の検出スポットを有するものを用い、
    前記作用電極の表面に、前記被検物質を含む試料液および前記増感色素を接触させて、前記特異的結合を介して前記増感色素を前記作用電極に固定させ、
    前記センサユニットを形成させた際に生じる充電電流を光電流検出開始前に放電するステップと、前記充電電流を放電させた後に、センサユニットを電流計に接続し、各検出スポットの光電流検出の前に、センサユニットを放電機構に接続し、直前の検出スポット由来の光電流を放電させた後に、再びセンサユニットを電流計に接続し、検出スポットに光を照射し、検出スポットに結合した色素由来の光電流を検出するよう制御され、複数の検出スポット数における特異的検出が可能とされた、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の測定装置。
13. 前記被検物質が一本鎖の核酸であり、前記プローブ物質が前記核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸である、請求項１１または１２に記載の測定装置。
14. 前記被検物質が抗原であり、前記プローブ物質が前記抗原に対して特異的な結合を有する抗体である、請求項１１または１２に記載の測定装置。
15. 前記プローブ物質に前記被検物質を結合させる手段が、増感色素の共存下、被検物質を含む試料液を作用電極に接触させることであり、
    更に前記試料液が、予め前記増感色素で標識されてなる、前記被検物質と特異的に結合可能な媒介物質をさらに含んでなり、該媒介物質と前記被検物質との結合物が前記プローブ物質に特異的に結合する、請求項１１または１２に記載の測定装置。
16. 前記被検物質がリガンドであり、前記媒介物質が受容体蛋白質分子であり、前記プローブ物質が二本鎖の核酸である、請求項１５に記載の測定装置。
17. 前記被検物質が外因性内分泌攪乱物質である、請求項１５または１６に記載の測定装置。
18. 光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるセンサユニットであって、
    作用電極と対向して設けられる対電極と、作用電極および対電極の間に挟持される電解質含有シートとを備え、作用電極および対電極の各電極表面が電解質含有シートと接触してなる、請求項４に記載の測定装置に用いられる、センサユニット。
19. 光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるセンサユニットであって、
    作用電極および対電極が同一平面上にパターニングされてなる電極ユニットと、作用電極および対電極の各電極表面に接触して設けられる電解質含有シートとを備えて、作用電極および対電極の各電極表面が電解質含有シートと接触してなる、請求項４に記載の測定装置に用いられるセンサユニット。
20. 光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるセンサユニットであって、
    作用電極と、対電極とを備えてなり、前記作用電極および前記対電極に接触するように、電解液、洗浄液、反応溶液を収容しかつ流すことができる流路が形成されてなる、請求項５に記載の測定装置に用いられるセンサユニット。
21. 光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるセンサユニットであって、
    作用電極および対電極が同一平面上にパターニングされてなる電極ユニットを備えてなり、
    前記作用電極および前記対電極に接触するように、電解液、洗浄液、反応溶液を収容しかつ流すことができる流路が形成されてなる、請求項５に記載の測定装置に用いられるセンサユニット。
22. 被検物質の特異的検出方法であって、
    被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を表面に坦持した単一又は複数の検出スポットを備えた作用電極と、
    対電極とを用意し、
    前記作用電極に、前記被検物質を含む可能性ある試料液を接触させて、前記被検物質を作用電極に結合させ、ここで、前記増感色素は、前記被検物質が前記プローブ物質に結合したときに、作用電極にともに固定されるものであり、
    次いで、前記作用電極に光を照射し、前記作用電極と対電極との間に流れる前記増感色素由来の光電流を検出し、前記被検物質の存在を検出する方法において、
    前記作用電極と前記対電極とを電解質含有体に接触させたときに生じる充電電流を放電し、
    前記充電電流を放電させた後に、前記作用電極上に形成した単一又は複数の検出スポットに順次光を照射し、検出スポットに結合した色素由来の光電流を検出することを特徴とする、方法。
23. 複数の検出スポットの光電流検出を行う場合、一つの検出スポットの光電流の検出の後に、当該検出スポット由来の光電流を放電させた後に、別の検出スポットに光を照射し、該検出スポットに結合した前記増感色素由来の光電流を検出する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記増感色素が、前記プローブ物質に結合されたものであるか、前記試料中の被検物質に結合されたものであるか、あるいは前記被検物質と前記プローブとに共に特異的に結合可能な媒介物質に結合されたものである、請求項２２または２３に記載の方法。

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