JP3515381B2 - 塩基配列検出装置および方法 - Google Patents
塩基配列検出装置および方法Info
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- JP3515381B2 JP3515381B2 JP25657198A JP25657198A JP3515381B2 JP 3515381 B2 JP3515381 B2 JP 3515381B2 JP 25657198 A JP25657198 A JP 25657198A JP 25657198 A JP25657198 A JP 25657198A JP 3515381 B2 JP3515381 B2 JP 3515381B2
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- Japan
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- electrode
- electrode pattern
- solution
- sample holding
- holding container
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に存在する
特定の遺伝子を特異的に検出するための塩基配列検出装
置および塩基配列検出方法に関する。
特定の遺伝子を特異的に検出するための塩基配列検出装
置および塩基配列検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子工学の発展により医療分野
では遺伝子による病気の診断や予防が可能となってきて
いる。これらは遺伝子診断と呼ばれ、病気の原因となる
ヒトの遺伝子欠陥・変化を検出することにより発症前や
きわめて初期の段階で診断や予測ができる。また感染し
たウィルスや病原菌の遺伝子を検出することにより正確
な診断が可能になる。
では遺伝子による病気の診断や予防が可能となってきて
いる。これらは遺伝子診断と呼ばれ、病気の原因となる
ヒトの遺伝子欠陥・変化を検出することにより発症前や
きわめて初期の段階で診断や予測ができる。また感染し
たウィルスや病原菌の遺伝子を検出することにより正確
な診断が可能になる。
【０００３】従来用いられている一般的な遺伝子検出法
は次の通りである。まず、試料から遺伝子を抽出し、必
要があれば適当な制限酵素で切断した後電気泳動および
サザンブロットを行う。次に、目的とする遺伝子に対し
て相補的な塩基配列を有する核酸プローブ（通常は放射
性同位元素でラベルされている）を、ブロットされた遺
伝子とハイブリダイズさせる。続いて低温でＸ線フィル
ムに感光させることによりハイブリダイズされた核酸プ
ローブを検出し目的とする遺伝子の存在を確認する。
は次の通りである。まず、試料から遺伝子を抽出し、必
要があれば適当な制限酵素で切断した後電気泳動および
サザンブロットを行う。次に、目的とする遺伝子に対し
て相補的な塩基配列を有する核酸プローブ（通常は放射
性同位元素でラベルされている）を、ブロットされた遺
伝子とハイブリダイズさせる。続いて低温でＸ線フィル
ムに感光させることによりハイブリダイズされた核酸プ
ローブを検出し目的とする遺伝子の存在を確認する。
【０００４】この方法では放射性同位元素を使用するた
め診断場所が限定され、試薬の取り扱いにも十分注意し
なければならない。この点を改善するため安全なラベル
剤の開発も進められているが、いずれにしても遺伝子検
出までに少なくとも２〜３日間を要し、操作も繁雑かつ
複雑であるという問題点がある。
め診断場所が限定され、試薬の取り扱いにも十分注意し
なければならない。この点を改善するため安全なラベル
剤の開発も進められているが、いずれにしても遺伝子検
出までに少なくとも２〜３日間を要し、操作も繁雑かつ
複雑であるという問題点がある。
【０００５】近年では光学的なアフィニティセンサとし
てＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を利用したセンサが実
用化されつつあるが、まだ感度は不十分である。
てＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を利用したセンサが実
用化されつつあるが、まだ感度は不十分である。
【０００６】これらの問題点に鑑み本発明者らは先に特
許第2573443 号において電極の表面に核酸プローブを固
定化し、検体とハイブリダイズ反応を行った後二本鎖認
識体を添加し電気化学的検出を行う方法を開示した。
許第2573443 号において電極の表面に核酸プローブを固
定化し、検体とハイブリダイズ反応を行った後二本鎖認
識体を添加し電気化学的検出を行う方法を開示した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上記特許第2573443 号
における自動遺伝子検出装置では電極を浸すための反応
槽が多数あり電極の移動が必要であるのに加え、電極を
浸すためには電極表面での反応に十分な量以上の試料お
よび試薬量が必要であった。また溶液中でのプローブ固
定化およびハイブリダイゼーション反応では電極表面以
外の絶縁膜上にも非特異的に吸着してしまい、後にセル
フハイブリダイゼーションを起こしてしまうためにセン
サの感度が低くなってしまうといった問題があった。
における自動遺伝子検出装置では電極を浸すための反応
槽が多数あり電極の移動が必要であるのに加え、電極を
浸すためには電極表面での反応に十分な量以上の試料お
よび試薬量が必要であった。また溶液中でのプローブ固
定化およびハイブリダイゼーション反応では電極表面以
外の絶縁膜上にも非特異的に吸着してしまい、後にセル
フハイブリダイゼーションを起こしてしまうためにセン
サの感度が低くなってしまうといった問題があった。
【０００８】本発明はこのような問題点を解決した検出
装置を提供することを目的とするものである。
装置を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明は、特定の塩基配列を検出するためものであっ
て、電極パターンと、この電極パターンが形成された基
板と、この基板上に配置され、前記電極パターンに下端
が接触するとともに、この接触部分の内径が前記電極パ
ターンとほぼ同じか若干大きい漏斗状の孔を有する樹脂
製の試料資料保持容器とを備え、この試料資料保持容器
により前記電極パターン上に核酸プローブ溶液、検体試
料資料溶液、二本鎖認識溶液あるいは洗浄液を滴下され
るすることを特徴とする塩基配列検出装置である。ま
た、本発明は電極パターンと、この電極パターンが形成
された基板と、この基板上に配置され、前記電極パター
ンに下端が接触するとともに、この接触部分の内径が前
記電極パターンとほぼ同じか若干大きい漏斗状の孔を有
する試料保持容器とを用い、検出すべき目的塩基配列に
対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブ
溶液を前記試料保持容器に供給して前記電極パターンに
固定化し、予め一本鎖に変性された塩基配列を含む検体
溶液を前記試料保持容器に供給して前記電極パターンに
固定化された核酸プローブとハイブリタイゼーション反
応させ、その後前記塩基配列とハイブリタイズした前記
核酸プローブに二本鎖認識体溶液を前記試料資料保持容
器に供給して前記核酸プローブに結合させ、その後電気
化学測定を行うことを特徴とする塩基配列検出方法であ
る。
に本発明は、特定の塩基配列を検出するためものであっ
て、電極パターンと、この電極パターンが形成された基
板と、この基板上に配置され、前記電極パターンに下端
が接触するとともに、この接触部分の内径が前記電極パ
ターンとほぼ同じか若干大きい漏斗状の孔を有する樹脂
製の試料資料保持容器とを備え、この試料資料保持容器
により前記電極パターン上に核酸プローブ溶液、検体試
料資料溶液、二本鎖認識溶液あるいは洗浄液を滴下され
るすることを特徴とする塩基配列検出装置である。ま
た、本発明は電極パターンと、この電極パターンが形成
された基板と、この基板上に配置され、前記電極パター
ンに下端が接触するとともに、この接触部分の内径が前
記電極パターンとほぼ同じか若干大きい漏斗状の孔を有
する試料保持容器とを用い、検出すべき目的塩基配列に
対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブ
溶液を前記試料保持容器に供給して前記電極パターンに
固定化し、予め一本鎖に変性された塩基配列を含む検体
溶液を前記試料保持容器に供給して前記電極パターンに
固定化された核酸プローブとハイブリタイゼーション反
応させ、その後前記塩基配列とハイブリタイズした前記
核酸プローブに二本鎖認識体溶液を前記試料資料保持容
器に供給して前記核酸プローブに結合させ、その後電気
化学測定を行うことを特徴とする塩基配列検出方法であ
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明における遺伝子検出装置で
は電極パターンを持つ基板上に核酸プローブを固定化す
る反応、固定化された核酸プローブと検体とをハイブリ
ダイズさせる反応、電極基板上でハイブリダイズした遺
伝子に二本鎖認識体を添加・挿入する反応、挿入された
二本鎖認識体を電気化学的に検出する工程をすべて電極
上で行うことができる。従来、上記反応は反応槽に電極
を浸し反応液と反応させることにより行なわれていた
が、この場合反応槽を多数用意しておかなければなら
ず、反応液も電極を十分浸せるだけの量が必要でありこ
れは電極表面に吸着させるに十分な量に比較すると過剰
な量の反応液が必要となってしまっていた。また電極は
電気化学的検出において反応面積のばらつきがあっては
正確な検出ができないため絶縁膜を用いて電極露出部面
積を一定にする必要があった。さらにこの場合に、電極
表面以外の絶縁膜上にも非特異的に核酸プローブもしく
は検体遺伝子が吸着してしまい、後にセルフハイブリダ
イゼーションを起こしてしまうためにセンサの感度が低
くなってしまうといった問題もあった。また溶液に電極
を浸けた場合に測定中に絶縁膜表面をつたわって端子部
に液が上がってきてしまうことがあり正確な測定ができ
ないこともあった。本発明では電極上に樹脂製のテーパ
ー穴を持つ試料保持容器を密着させることにより、上記
反応をすべて電極上で行うことを特徴としている。電極
上で反応を行うことにより必要以上の反応液を消費する
ことはなく、反応槽も必要がない。また反応溶液は電極
部以外の部分に接触することがないため電極以外の部分
に対する非特異吸着による検出感度減少を防ぐことがで
きる。また、電極には絶縁膜をつける必要がなく電極製
造プロセスの短縮・コストの低減ができる。この場合、
電極面積は電極自体のパターンを作っておくことにより
正確に一定に保つことができる。このようにすべての反
応を電極上で行うことにより従来の問題点を解決するこ
とができる。
は電極パターンを持つ基板上に核酸プローブを固定化す
る反応、固定化された核酸プローブと検体とをハイブリ
ダイズさせる反応、電極基板上でハイブリダイズした遺
伝子に二本鎖認識体を添加・挿入する反応、挿入された
二本鎖認識体を電気化学的に検出する工程をすべて電極
上で行うことができる。従来、上記反応は反応槽に電極
を浸し反応液と反応させることにより行なわれていた
が、この場合反応槽を多数用意しておかなければなら
ず、反応液も電極を十分浸せるだけの量が必要でありこ
れは電極表面に吸着させるに十分な量に比較すると過剰
な量の反応液が必要となってしまっていた。また電極は
電気化学的検出において反応面積のばらつきがあっては
正確な検出ができないため絶縁膜を用いて電極露出部面
積を一定にする必要があった。さらにこの場合に、電極
表面以外の絶縁膜上にも非特異的に核酸プローブもしく
は検体遺伝子が吸着してしまい、後にセルフハイブリダ
イゼーションを起こしてしまうためにセンサの感度が低
くなってしまうといった問題もあった。また溶液に電極
を浸けた場合に測定中に絶縁膜表面をつたわって端子部
に液が上がってきてしまうことがあり正確な測定ができ
ないこともあった。本発明では電極上に樹脂製のテーパ
ー穴を持つ試料保持容器を密着させることにより、上記
反応をすべて電極上で行うことを特徴としている。電極
上で反応を行うことにより必要以上の反応液を消費する
ことはなく、反応槽も必要がない。また反応溶液は電極
部以外の部分に接触することがないため電極以外の部分
に対する非特異吸着による検出感度減少を防ぐことがで
きる。また、電極には絶縁膜をつける必要がなく電極製
造プロセスの短縮・コストの低減ができる。この場合、
電極面積は電極自体のパターンを作っておくことにより
正確に一定に保つことができる。このようにすべての反
応を電極上で行うことにより従来の問題点を解決するこ
とができる。
【００１１】以下具体的に遺伝子検出の手順を説明す
る。
る。
【００１２】まず電極パターンを持つ基板上に、テフロ
ン等の核酸の吸着の少ない樹脂製のテーパー穴を持つ漏
斗状の試料保持容器を密着させる。このとき電極と接触
する部分の内径は電極パターンとほぼ同じか若干大きく
しておくことが望ましい。これは電極全体に反応液を接
触させるためであり、かつ電極以外の部分への接触をで
きるだけ少なくするためである。なおテーパーの角度は
規定される必要はないが反応に十分な液量が保持でき、
かつ反応液を上部から滴下したときに気泡がのこって電
極に接触できないことのないようにしなければならな
い。また電極はガイドにより固定しておくことにより正
確に電極部に試料容器がずれのないように密着できるよ
うにする。電極面積が非常に小さく、より位置あわせの
正確さが必要な場合には密着時に試料容器位置を微調整
する機構があることが望ましい。また、樹脂製の試料保
持容器はこれをはめ込むための穴を複数もつブロックに
取り付けることにより一度に複数の測定を行うことが可
能である。電極についても複数の電極パターンを１枚の
基板上もしくはフィルム上に持つことにより基板のセッ
ト、位置合わせも簡単に行える。
ン等の核酸の吸着の少ない樹脂製のテーパー穴を持つ漏
斗状の試料保持容器を密着させる。このとき電極と接触
する部分の内径は電極パターンとほぼ同じか若干大きく
しておくことが望ましい。これは電極全体に反応液を接
触させるためであり、かつ電極以外の部分への接触をで
きるだけ少なくするためである。なおテーパーの角度は
規定される必要はないが反応に十分な液量が保持でき、
かつ反応液を上部から滴下したときに気泡がのこって電
極に接触できないことのないようにしなければならな
い。また電極はガイドにより固定しておくことにより正
確に電極部に試料容器がずれのないように密着できるよ
うにする。電極面積が非常に小さく、より位置あわせの
正確さが必要な場合には密着時に試料容器位置を微調整
する機構があることが望ましい。また、樹脂製の試料保
持容器はこれをはめ込むための穴を複数もつブロックに
取り付けることにより一度に複数の測定を行うことが可
能である。電極についても複数の電極パターンを１枚の
基板上もしくはフィルム上に持つことにより基板のセッ
ト、位置合わせも簡単に行える。
【００１３】このようにして電極上に密着した試料保持
容器にまず最初に核酸プローブが必要量滴下される。核
酸プローブおよび電極材料に関しては上記特許第２５７
３４４３号に示した通りである。通常、プローブは電極
とプローブ溶液との接触により電極上に吸着するように
なっているが、より吸着を確実なものにするためにプロ
ーブ溶液中の溶媒（通常は水）を蒸発させてプローブを
電極上に乾固させる方法が極めて有効である。蒸発は加
熱もしくは乾燥空気などを当てることによる風乾などの
方法でよい。
容器にまず最初に核酸プローブが必要量滴下される。核
酸プローブおよび電極材料に関しては上記特許第２５７
３４４３号に示した通りである。通常、プローブは電極
とプローブ溶液との接触により電極上に吸着するように
なっているが、より吸着を確実なものにするためにプロ
ーブ溶液中の溶媒（通常は水）を蒸発させてプローブを
電極上に乾固させる方法が極めて有効である。蒸発は加
熱もしくは乾燥空気などを当てることによる風乾などの
方法でよい。
【００１４】電極へのプローブの固定化の後、吸着して
いないプローブを除去するために洗浄液を滴下し、攪拌
もしくは振盪を行う。このとき温度も３５〜５０℃程度
でコントロールする。攪拌もしくは振盪は、上部からご
く小さなスクリューなどの攪拌子を液中に挿入して行う
か試料保持容器および電極を一体として全体を振盪する
機構を備えておく。また温度については樹脂製の試料保
持容器はヒーターを内蔵した金属ブロックに取りつける
形になっておりヒーターにより温度調整することができ
る。もしくは赤外線ランプを照射することにより温度調
整することも可能である。
いないプローブを除去するために洗浄液を滴下し、攪拌
もしくは振盪を行う。このとき温度も３５〜５０℃程度
でコントロールする。攪拌もしくは振盪は、上部からご
く小さなスクリューなどの攪拌子を液中に挿入して行う
か試料保持容器および電極を一体として全体を振盪する
機構を備えておく。また温度については樹脂製の試料保
持容器はヒーターを内蔵した金属ブロックに取りつける
形になっておりヒーターにより温度調整することができ
る。もしくは赤外線ランプを照射することにより温度調
整することも可能である。
【００１５】洗浄終了後、洗浄液は上部から排出用の管
を液中に挿入し吸引排出を行う。完全に排出できずに電
極上もしくは試料保持容器に液滴が残ってしまう場合に
はエアーブローにより飛ばしてしまうとよい。
を液中に挿入し吸引排出を行う。完全に排出できずに電
極上もしくは試料保持容器に液滴が残ってしまう場合に
はエアーブローにより飛ばしてしまうとよい。
【００１６】次に電極上に、あらかじめ熱変性により一
本鎖の状態にしてある遺伝子を含む検体試料が滴下され
る。プローブ固定化の時と同様の手段により、温度コン
トロールを行いながら攪拌もしくは振盪し、プローブと
検体とのハイブリダイゼーション反応を行う。このとき
検体を含む試料液が蒸発乾固してしまわないように試料
保持容器上部は蓋をしてある状態であることが望まし
い。ハイブリダイゼーション反応後、検体を吸引排出
し、上記プローブ固定化後の洗浄と同様にして電極表面
・試料保持容器内の未反応物を洗浄除去する。洗浄液を
排出した後、二本鎖認識体を滴下しプローブと結合した
検体遺伝子に対して結合させる。二本鎖認識体との結合
反応の後、電極表面・試料保持容器内の未反応物を洗浄
除去しこの後、電気化学測定を行う。
本鎖の状態にしてある遺伝子を含む検体試料が滴下され
る。プローブ固定化の時と同様の手段により、温度コン
トロールを行いながら攪拌もしくは振盪し、プローブと
検体とのハイブリダイゼーション反応を行う。このとき
検体を含む試料液が蒸発乾固してしまわないように試料
保持容器上部は蓋をしてある状態であることが望まし
い。ハイブリダイゼーション反応後、検体を吸引排出
し、上記プローブ固定化後の洗浄と同様にして電極表面
・試料保持容器内の未反応物を洗浄除去する。洗浄液を
排出した後、二本鎖認識体を滴下しプローブと結合した
検体遺伝子に対して結合させる。二本鎖認識体との結合
反応の後、電極表面・試料保持容器内の未反応物を洗浄
除去しこの後、電気化学測定を行う。
【００１７】測定はまず試料保持容器内に電解液を注入
する。その後、上部から電極を電解液中にプローブ固定
化電極とは接触しないように挿入する。またプローブ固
定化電極の端子部は電気化学測定の装置と接続される。
これで電気化学測定を行えば電気化学応答のある二本鎖
認識体からの信号を観測してプローブと結合した目的の
検体遺伝子の存在量を測定することができる。
する。その後、上部から電極を電解液中にプローブ固定
化電極とは接触しないように挿入する。またプローブ固
定化電極の端子部は電気化学測定の装置と接続される。
これで電気化学測定を行えば電気化学応答のある二本鎖
認識体からの信号を観測してプローブと結合した目的の
検体遺伝子の存在量を測定することができる。
【００１８】測定終了後は電解液を排出する。上記樹脂
製の試料保持容器は一つの検体に対する一連の反応（プ
ローブ固定、ハイブリダイゼーション、二本鎖認識体結
合）では同一のものを使用し交換は必ずしも必要ではな
いが、別の検体を測定する場合には電極とともに交換す
るようにしディスポーザブルとするのが望ましい。
製の試料保持容器は一つの検体に対する一連の反応（プ
ローブ固定、ハイブリダイゼーション、二本鎖認識体結
合）では同一のものを使用し交換は必ずしも必要ではな
いが、別の検体を測定する場合には電極とともに交換す
るようにしディスポーザブルとするのが望ましい。
【００１９】これらの手順はすべて自動的に行うことが
でき、プローブ・検体・二本鎖認識体・洗浄液滴下用お
よび排出用の管、エアノズルを備え、またコンピュータ
に接続されることにより滴下量や時間、温度をプログラ
ムできるようにすることができる。
でき、プローブ・検体・二本鎖認識体・洗浄液滴下用お
よび排出用の管、エアノズルを備え、またコンピュータ
に接続されることにより滴下量や時間、温度をプログラ
ムできるようにすることができる。
【００２０】
【実施例】以下に本発明の実施の形態を実施例を用いて
説明する。
説明する。
【００２１】（実施例１）図１に示すように、本実施例で測定に用いた電極２はガ
ラス基板１上に図示のような形状で 金のスパッタ膜によ
りパターンをつくったものであり、電極部５、リード部
４および端子部３を持つ。電極部５は円形で直径は２ｍ
ｍ、リード部４の幅は２０μｍである。これに密着させ
るための試料保持容器は図２に示す形状のものであり、
ヒーター８および熱電対９を組み込んだアルミブロック
６に試料保持用の樹脂（テフロン）製の容器７をはめ込
んだものである。容器７はアルミブロック６の上部に取
り付けられたスライド式の板１１で押さえられるように
なっており、この板１１を更にスライドすることにより
蓋ができるようになっている。容器７を形成するテーパ
ーの角度は６０度であり、電極５と接する部分はアルミ
ブロック７より下に出るようになっており内径２．２ｍ
ｍのものを使用した。電極５はガイド１３により、振盪
機１２上に設置された試料台１０の定位置に置かれ、試
料台１０上に設置された試料保持容器７をはめ込んだア
ルミブロック６と密着させた。
ラス基板１上に図示のような形状で 金のスパッタ膜によ
りパターンをつくったものであり、電極部５、リード部
４および端子部３を持つ。電極部５は円形で直径は２ｍ
ｍ、リード部４の幅は２０μｍである。これに密着させ
るための試料保持容器は図２に示す形状のものであり、
ヒーター８および熱電対９を組み込んだアルミブロック
６に試料保持用の樹脂（テフロン）製の容器７をはめ込
んだものである。容器７はアルミブロック６の上部に取
り付けられたスライド式の板１１で押さえられるように
なっており、この板１１を更にスライドすることにより
蓋ができるようになっている。容器７を形成するテーパ
ーの角度は６０度であり、電極５と接する部分はアルミ
ブロック７より下に出るようになっており内径２．２ｍ
ｍのものを使用した。電極５はガイド１３により、振盪
機１２上に設置された試料台１０の定位置に置かれ、試
料台１０上に設置された試料保持容器７をはめ込んだア
ルミブロック６と密着させた。
【００２２】次にプローブ固定化のために、上方からプ
ローブ溶液１０μｌを滴下した。核酸プローブはリン酸
緩衝液中に大腸菌１６ｓ−ｒＤＮＡ用の２０塩基のもの
（配列は[5’−CTGGACGAAGACTGACGCTC-3’］）を１μｇ
／ｍｌ懸濁させたものを用いた。滴下したプローブ溶液
は乾燥空気を液が飛散しない程度の強さで上方から当て
ることにより電極上で乾燥させた。吸着していないプロ
ーブを除去するために洗浄液（２ｘＳＳＣ／１ｍＭ−Ｅ
ＤＴＡ）を２５０μｌ滴下、上部のスライド式の蓋をし
た後４３℃、１５０ｒｐｍで１５分間振盪を行った。洗
浄液は上方から排出管を電極に接触しないように挿入
し、吸い上げて排出した。この後もう一度同様にして洗
浄を１５分間行った。
ローブ溶液１０μｌを滴下した。核酸プローブはリン酸
緩衝液中に大腸菌１６ｓ−ｒＤＮＡ用の２０塩基のもの
（配列は[5’−CTGGACGAAGACTGACGCTC-3’］）を１μｇ
／ｍｌ懸濁させたものを用いた。滴下したプローブ溶液
は乾燥空気を液が飛散しない程度の強さで上方から当て
ることにより電極上で乾燥させた。吸着していないプロ
ーブを除去するために洗浄液（２ｘＳＳＣ／１ｍＭ−Ｅ
ＤＴＡ）を２５０μｌ滴下、上部のスライド式の蓋をし
た後４３℃、１５０ｒｐｍで１５分間振盪を行った。洗
浄液は上方から排出管を電極に接触しないように挿入
し、吸い上げて排出した。この後もう一度同様にして洗
浄を１５分間行った。
【００２３】次に電極５上に、あらかじめ熱変性により
一本鎖の状態にしてある大腸菌ｒＤＮＡを含む溶液を滴
下（５μｌ）した。上部のスライド式の蓋１１をした
後、４０℃で１時間振盪しハイブリダイゼーション反応
を行った。反応後、反応液を吸引排出し、電極５表面・
試料保持容器７内の未反応物を洗浄除去するために洗浄
液（２ｘＳＳＣ／１ｍＭ−ＥＤＴＡ）を２５０μｌ滴下
し、上部のスライド式の蓋１１をした後３５℃、１５０
ｒｐｍで３０分間振盪を行った。
一本鎖の状態にしてある大腸菌ｒＤＮＡを含む溶液を滴
下（５μｌ）した。上部のスライド式の蓋１１をした
後、４０℃で１時間振盪しハイブリダイゼーション反応
を行った。反応後、反応液を吸引排出し、電極５表面・
試料保持容器７内の未反応物を洗浄除去するために洗浄
液（２ｘＳＳＣ／１ｍＭ−ＥＤＴＡ）を２５０μｌ滴下
し、上部のスライド式の蓋１１をした後３５℃、１５０
ｒｐｍで３０分間振盪を行った。
【００２４】洗浄液を排出後、二本鎖認識体としてヘキ
スト33258 （１μＭ）を１０μｌ電極上に滴下し結合し
た遺伝子に対する挿入反応を行った。室温で５分間振盪
後、リン酸緩衝液２５０μｌにより洗浄（５分間振盪、
室温）した。
スト33258 （１μＭ）を１０μｌ電極上に滴下し結合し
た遺伝子に対する挿入反応を行った。室温で５分間振盪
後、リン酸緩衝液２５０μｌにより洗浄（５分間振盪、
室温）した。
【００２５】この後、速やかに電解液３００μｌを滴
下、対極として白金電極（図示せず。）を電解液中に挿
入し、また基板電極５の端子部も電気化学測定装置に接
続した。そしてリニアスイープボルタンメトリーにより
ヘキスト33258 の酸化電流を測定した。
下、対極として白金電極（図示せず。）を電解液中に挿
入し、また基板電極５の端子部も電気化学測定装置に接
続した。そしてリニアスイープボルタンメトリーにより
ヘキスト33258 の酸化電流を測定した。
【００２６】定量測定を行った結果、試料中の大腸菌ｒ
ＤＮＡを１０11copy/ml まで検出することができた。
ＤＮＡを１０11copy/ml まで検出することができた。
【００２７】（実施例２）図３に示すように、
本実施例では複数の電極パターン２
をガラス基板１上に持つものを使用した。パターン２は
実施例１と同様に金スパッタ膜でできた電極部・リード
部・端子部を持ち、電極部の直径は３００μｍ、リード
部の幅は１０μｍのものが２ｍｍピッチで向かい合わせ
に１０個ずつ合計２０個並んだものである。これに密着
させるための試料保持容器７は図４に示す形状のもので
あり、ヒーターおよび熱電対（図示せず。）を組み込ん
だアルミブロック６に試料保持用の樹脂（テフロン）製
の容器を電極位置に合わせてはめ込んだものである。テ
ーパーの角度は約６０度であり、電極と接する部分の内
径は３５０μｍである。電極はガイドにより、振盪機上
に設置された試料台の定位置に置かれ試料保持容器をは
め込んだアルミブロック６と密着させた。
をガラス基板１上に持つものを使用した。パターン２は
実施例１と同様に金スパッタ膜でできた電極部・リード
部・端子部を持ち、電極部の直径は３００μｍ、リード
部の幅は１０μｍのものが２ｍｍピッチで向かい合わせ
に１０個ずつ合計２０個並んだものである。これに密着
させるための試料保持容器７は図４に示す形状のもので
あり、ヒーターおよび熱電対（図示せず。）を組み込ん
だアルミブロック６に試料保持用の樹脂（テフロン）製
の容器を電極位置に合わせてはめ込んだものである。テ
ーパーの角度は約６０度であり、電極と接する部分の内
径は３５０μｍである。電極はガイドにより、振盪機上
に設置された試料台の定位置に置かれ試料保持容器をは
め込んだアルミブロック６と密着させた。
【００２８】次にプローブ固定化のために、上方からプ
ローブ溶液１μｌを滴下した。核酸プローブはリン酸緩
衝液中にＨＢＶ用の２０塩基のもの（配列は［５’-CGT
CCCGTCGGCGCTGAATC-３’］）を２５０ｎｇ／ｍｌ懸濁さ
せたものを用いた。を使用した。乾燥空気をあてること
によりプローブ溶液を電極上で乾燥させた後、吸着して
いないプローブの除去のため実施例１と同様に洗浄液
（２ｘＳＳＣ／１ｍＭ−ＥＤＴＡ）２５０μｌで洗浄を
２回行った。
ローブ溶液１μｌを滴下した。核酸プローブはリン酸緩
衝液中にＨＢＶ用の２０塩基のもの（配列は［５’-CGT
CCCGTCGGCGCTGAATC-３’］）を２５０ｎｇ／ｍｌ懸濁さ
せたものを用いた。を使用した。乾燥空気をあてること
によりプローブ溶液を電極上で乾燥させた後、吸着して
いないプローブの除去のため実施例１と同様に洗浄液
（２ｘＳＳＣ／１ｍＭ−ＥＤＴＡ）２５０μｌで洗浄を
２回行った。
【００２９】次に電極上に、ＨＢＶ遺伝子を組み込んだ
プラスミド（ｐＹＲＢ２５９）を含む溶液を滴下（１μ
ｌ）した。上部のスライド式の蓋１１をした後、４３℃
で１時間振盪しハイブリダイゼーション反応を行った。
反応後、反応液を吸引排出し、電極表面・試料保持容器
７内の未反応物を洗浄除去するために洗浄液（２ｘＳＳ
Ｃ／１ｍＭ−ＥＤＴＡ）を２５０μｌ滴下し、上部のス
ライド式の蓋１１をした後３５℃、１５０ｒｐｍで３０
分間振盪を行った。洗浄液を排出後、二本鎖認識体とし
てヘキスト33258 （１μＭ）を１μｌ電極上に滴下し結
合した遺伝子に対する挿入反応を行った。室温で５分間
振盪後、リン酸緩衝液２５０μｌにより洗浄（５分間振
盪、室温）した。
プラスミド（ｐＹＲＢ２５９）を含む溶液を滴下（１μ
ｌ）した。上部のスライド式の蓋１１をした後、４３℃
で１時間振盪しハイブリダイゼーション反応を行った。
反応後、反応液を吸引排出し、電極表面・試料保持容器
７内の未反応物を洗浄除去するために洗浄液（２ｘＳＳ
Ｃ／１ｍＭ−ＥＤＴＡ）を２５０μｌ滴下し、上部のス
ライド式の蓋１１をした後３５℃、１５０ｒｐｍで３０
分間振盪を行った。洗浄液を排出後、二本鎖認識体とし
てヘキスト33258 （１μＭ）を１μｌ電極上に滴下し結
合した遺伝子に対する挿入反応を行った。室温で５分間
振盪後、リン酸緩衝液２５０μｌにより洗浄（５分間振
盪、室温）した。
【００３０】この後、速やかに電解液３００μｌを滴
下、対極として白金電極を電解液中に挿入し、また基板
電極の端子部も電気化学測定装置に接続した。そしてリ
ニアスイープボルタンメトリーによりヘキスト33258 の
酸化電流を測定した。
下、対極として白金電極を電解液中に挿入し、また基板
電極の端子部も電気化学測定装置に接続した。そしてリ
ニアスイープボルタンメトリーによりヘキスト33258 の
酸化電流を測定した。
【００３１】定量測定を行った結果、試料中のＨＢＶ遺
伝子を１０4 〜１０8copy/mlの範囲で検出することがで
きた。
伝子を１０4 〜１０8copy/mlの範囲で検出することがで
きた。
【００３２】
【発明の効果】以上説明したように本発明によれば核酸
プローブを用いた遺伝子検出を簡便かつ高感度に行うこ
とができる。本発明による自動遺伝子検出装置は遺伝子
診断や細菌検出などに有用である。
プローブを用いた遺伝子検出を簡便かつ高感度に行うこ
とができる。本発明による自動遺伝子検出装置は遺伝子
診断や細菌検出などに有用である。
【図１】本発明の核酸プローブ固定用電極を示す図であ
る。
る。
【図２】本発明の試料保持容器を示す図である。
【図３】本発明の核酸プローブ固定用電極を示す図であ
る。
る。
【図４】本発明の試料保持容器を示す図である。
１ ガラス基板
２ 金スパッタ膜電極パターン
３ 端子部
４ リード部
５ 遺伝子センサ電極
６ アルミブロック
７ 樹脂容器
８ ヒーター線
９ 熱電対
１０ 試料台
１１ 蓋
１２ 振盪機
１３ センサガイド
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 石森 義雄
神奈川県川崎市幸区小向東芝町１番地
株式会社東芝 研究開発センター内
(56)参考文献 特開 平７−51099（ＪＰ，Ａ)
特許2573443（ＪＰ，Ｂ２)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12M 1/00 - 3/10
C12Q 1/00 - 1/70
G01N 27/00 - 33/98
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (4)
- 【請求項１】 電極パターンと、この電極パターンが形
成された基板と、この基板上に配置され、前記電極パタ
ーンに下端が接触するとともに、この接触部分の内径が
前記電極パターンとほぼ同じか若干大きい漏斗状の孔を
有する試料保持容器とを備え、この試料保持容器により
前記電極パターン上に核酸プローブ溶液、検体試料溶
液、二本鎖認識溶液あるいは洗浄液を滴下されることを
特徴とする塩基配列検出装置。 - 【請求項２】 請求項１の塩基配列検出装置において試
料攪拌手段、温度コントロール手段および電気化学測定
手段を備え、プローブ固定化、ハイブリダイゼーション
反応、二本鎖認識体結合および塩基配列検出を電極上で
行う塩基配列検出装置。 - 【請求項３】 電極パターンと、この電極パターンが形
成された基板と、この基板上に配置され、前記電極パタ
ーンに下端が接触するとともに、この接触部分の内径が
前記電極パターンとほぼ同じか若干大きい漏斗状の孔を
有する試料保持容器とを用い、検出すべき目的塩基配列
に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プロー
ブ溶液を前記試料保持容器に供給して前記電極パターン
に固定化し、予め一本鎖に変性された塩基配列を含む検
体溶液を前記試料保持容器に供給して前記電極パターン
に固定化された核酸プローブとハイブリタイゼーション
反応させ、その後前記塩基配列とハイブリタイズした前
記核酸プローブに二本鎖認識体溶液を前記試料保持容器
に供給して前記核酸プローブに結合させ、その後電気化
学測定を行うことを特徴とする塩基配列検出方法。 - 【請求項４】 前記試料保持容器に供給された溶液は次
の溶液が供給される前に前記試料保持容器の上部から排
出用の管を用いて吸引排出され、その後前記試料保持容
器は、この試料保持容器に洗浄液が供給されて洗浄され
ることを特徴とする請求項３記載の塩基配列検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25657198A JP3515381B2 (ja) | 1998-09-10 | 1998-09-10 | 塩基配列検出装置および方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25657198A JP3515381B2 (ja) | 1998-09-10 | 1998-09-10 | 塩基配列検出装置および方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000083647A JP2000083647A (ja) | 2000-03-28 |
| JP3515381B2 true JP3515381B2 (ja) | 2004-04-05 |
Family
ID=17294496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25657198A Expired - Lifetime JP3515381B2 (ja) | 1998-09-10 | 1998-09-10 | 塩基配列検出装置および方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3515381B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001092572A1 (fr) * | 2000-06-01 | 2001-12-06 | Nisshinbo Industries, Inc. | Ensemble et procede de determination du type de hla |
| ES2253551T3 (es) * | 2001-07-25 | 2006-06-01 | Posco | Metodo de deteccion de la hibridacion de acidos nucleicos. |
| JP4057967B2 (ja) * | 2002-07-31 | 2008-03-05 | 株式会社東芝 | 塩基配列自動解析装置 |
| US7745203B2 (en) | 2002-07-31 | 2010-06-29 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Base sequence detection apparatus and base sequence automatic analyzing apparatus |
| US7396677B2 (en) | 2003-11-07 | 2008-07-08 | Nanosphere, Inc. | Method of preparing nucleic acids for detection |
| JP4826860B2 (ja) | 2009-03-18 | 2011-11-30 | Ｔｏｔｏ株式会社 | 光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置、それに用いられるセンサユニット、および光電流を用いた被検物質の特異的検出方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2573443B2 (ja) | 1990-09-28 | 1997-01-22 | 株式会社東芝 | 遺伝子検出法 |
-
1998
- 1998-09-10 JP JP25657198A patent/JP3515381B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2573443B2 (ja) | 1990-09-28 | 1997-01-22 | 株式会社東芝 | 遺伝子検出法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000083647A (ja) | 2000-03-28 |
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