JP2002139491A - ２本鎖ｄｎａの分析方法 - Google Patents
２本鎖ｄｎａの分析方法Info
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- JP2002139491A JP2002139491A JP2000332249A JP2000332249A JP2002139491A JP 2002139491 A JP2002139491 A JP 2002139491A JP 2000332249 A JP2000332249 A JP 2000332249A JP 2000332249 A JP2000332249 A JP 2000332249A JP 2002139491 A JP2002139491 A JP 2002139491A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ２本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分
析するための方法においてその反応速度を促進する方法
を提供すること。 【解決手段】 検体中の２本鎖ＤＮＡの分析方法であっ
て、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質
と該検体とを接触させる工程、（２）検体中の２本鎖Ｄ
ＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方
に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が
固定された支持体と該検体との間にかける工程、及び
（３）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡ
を測定する工程、を含む上記の分析方法。
析するための方法においてその反応速度を促進する方法
を提供すること。 【解決手段】 検体中の２本鎖ＤＮＡの分析方法であっ
て、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質
と該検体とを接触させる工程、（２）検体中の２本鎖Ｄ
ＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方
に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が
固定された支持体と該検体との間にかける工程、及び
（３）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡ
を測定する工程、を含む上記の分析方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、検体中に存在する
２本鎖核酸（特には、２本鎖ＤＮＡ）を分析する方法に
関し、検体中に存在する２本鎖核酸の存在量を定量する
方法にも関する。また、本発明は、遺伝子解析に応用さ
れた場合、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）
等の遺伝子多型の分析及び解析にも利用できる。また、
本発明は、検体中に存在するウイルス、菌体などに由来
する外来遺伝子群を検出する手法にも利用できる。
２本鎖核酸（特には、２本鎖ＤＮＡ）を分析する方法に
関し、検体中に存在する２本鎖核酸の存在量を定量する
方法にも関する。また、本発明は、遺伝子解析に応用さ
れた場合、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）
等の遺伝子多型の分析及び解析にも利用できる。また、
本発明は、検体中に存在するウイルス、菌体などに由来
する外来遺伝子群を検出する手法にも利用できる。
【０００２】
【従来の技術】標的となる核酸試料、または標的核酸試
料と相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ断片で
ある核酸プローブのいずれか一方を固相に固定し、これ
との間でハイブリダイゼーション反応を行う方法は、１
９７５年にE.M.Southernにより開発され、いわゆるサザ
ンブロッティング法として多用されてきている(J.Mol.B
iol 98,503(1975))。サザンブロッティング法では、核
酸試料を電気泳動した後にニトロセルロースやナイロン
膜などに固定し、相補的な配列をもつ核酸プローブと接
触することになる。
料と相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ断片で
ある核酸プローブのいずれか一方を固相に固定し、これ
との間でハイブリダイゼーション反応を行う方法は、１
９７５年にE.M.Southernにより開発され、いわゆるサザ
ンブロッティング法として多用されてきている(J.Mol.B
iol 98,503(1975))。サザンブロッティング法では、核
酸試料を電気泳動した後にニトロセルロースやナイロン
膜などに固定し、相補的な配列をもつ核酸プローブと接
触することになる。
【０００３】この方法とは逆に、核酸プローブを固定化
し、標的核酸と接触させることにより、標的核酸量を測
定する方法も開発され、遺伝子解析や、遺伝子診断等に
利用されてきている。また、Southern等は多数の核酸プ
ローブをアレイ状に支持体に固定化したＤＮＡアレイを
開発し、ガラス支持体上のＤＮＡがその相補的なＤＮＡ
と結合することを実証した。また、Affymax社は、South
ernの考え方と、Photoresist法によるＤＮＡ固相合成技
術の組み合わせによりＤＮＡアレイの高密度化技術の開
発に成功し、GeneChipの形で商品化されるに至っている
(S. Fodor; Science 277, 393(1997)、Nature Genetics
Supplement 21,20(1999))。
し、標的核酸と接触させることにより、標的核酸量を測
定する方法も開発され、遺伝子解析や、遺伝子診断等に
利用されてきている。また、Southern等は多数の核酸プ
ローブをアレイ状に支持体に固定化したＤＮＡアレイを
開発し、ガラス支持体上のＤＮＡがその相補的なＤＮＡ
と結合することを実証した。また、Affymax社は、South
ernの考え方と、Photoresist法によるＤＮＡ固相合成技
術の組み合わせによりＤＮＡアレイの高密度化技術の開
発に成功し、GeneChipの形で商品化されるに至っている
(S. Fodor; Science 277, 393(1997)、Nature Genetics
Supplement 21,20(1999))。
【０００４】このように、ハイブリダイゼーションを用
いるＤＮＡの検出方法は、大きく進歩してきている。し
かしながら、上記した分析方法は、ｍＲＮＡ等の１本鎖
核酸の検出には極めて有効であるものの、２本鎖核酸を
検出するためには、ハイブリダイゼーション前に検体中
の２本鎖核酸を熱変性し、１本鎖にするという煩雑な操
作が必要となる。
いるＤＮＡの検出方法は、大きく進歩してきている。し
かしながら、上記した分析方法は、ｍＲＮＡ等の１本鎖
核酸の検出には極めて有効であるものの、２本鎖核酸を
検出するためには、ハイブリダイゼーション前に検体中
の２本鎖核酸を熱変性し、１本鎖にするという煩雑な操
作が必要となる。
【０００５】例えば、分析の対象がゲノム中のＤＮＡで
ある場合、対象ＤＮＡは２本鎖を形成している。例え
ば、P.N.Gillies等は電気アドレス法で(Nature Biotech
nology,17,365(1999))、また、R.J.Cho等は高密度オリ
ゴＤＮＡアレイにより(Nature Genetics 23,203(199
9))、ＳＮＰの検出を行っている。しかし、いずれの場
合も、ＤＮＡの測定のためには、検体中の標的ＤＮＡ部
分をＰＣＲで増幅したのち、熱変性により１本鎖に変性
するという煩雑な操作を行う必要がある。
ある場合、対象ＤＮＡは２本鎖を形成している。例え
ば、P.N.Gillies等は電気アドレス法で(Nature Biotech
nology,17,365(1999))、また、R.J.Cho等は高密度オリ
ゴＤＮＡアレイにより(Nature Genetics 23,203(199
9))、ＳＮＰの検出を行っている。しかし、いずれの場
合も、ＤＮＡの測定のためには、検体中の標的ＤＮＡ部
分をＰＣＲで増幅したのち、熱変性により１本鎖に変性
するという煩雑な操作を行う必要がある。
【０００６】一方、２本鎖ＤＮＡを検出する方法とし
て、インターカレーターが知られている。特許第２５７
３４４３号公報には、インターカレーターを用いるＤＮ
Ａの検出方法が開示されているが、この方法でも、固定
化されたＤＮＡと反応させるために２本鎖ＤＮＡを予め
１本鎖に変性する必要があった。
て、インターカレーターが知られている。特許第２５７
３４４３号公報には、インターカレーターを用いるＤＮ
Ａの検出方法が開示されているが、この方法でも、固定
化されたＤＮＡと反応させるために２本鎖ＤＮＡを予め
１本鎖に変性する必要があった。
【０００７】上記欠点を改良する技術として、２本鎖核
酸を直接検出する技術が開発された。（特願２０００−
３２５１３６号）。この発明では支持体上に固定された
２本鎖ＤＮＡ認識物質に検体を接触させ、該２本鎖ＤＮ
Ａ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定することによ
り、２本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分析する
ことが可能になることを見出している。しかしながら、
この方法を用いても、反応時間をさらに短縮する必要が
生じることがあった。
酸を直接検出する技術が開発された。（特願２０００−
３２５１３６号）。この発明では支持体上に固定された
２本鎖ＤＮＡ認識物質に検体を接触させ、該２本鎖ＤＮ
Ａ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定することによ
り、２本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分析する
ことが可能になることを見出している。しかしながら、
この方法を用いても、反応時間をさらに短縮する必要が
生じることがあった。
【０００８】固定化された１本鎖ＤＮＡを溶液中の検体
ＤＮＡと反応させるいわゆるＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョン法による検出法において、反応速度を促進する方法
はすでに開発されている。例えば、反応場に電場をかけ
ハイブリダイゼーション速度を促進できることは、米国
特許４７８７９６３号明細書、国際公開ＷＯ９８／１０
２７３号公報に開示されている。また、ポリエチレング
リコールの添加も反応速度の促進に効果のあることも知
られている。しかしながら、２本鎖核酸を直接検出する
反応を加速させる技術は開発されておらず、その開発が
必要であった。
ＤＮＡと反応させるいわゆるＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョン法による検出法において、反応速度を促進する方法
はすでに開発されている。例えば、反応場に電場をかけ
ハイブリダイゼーション速度を促進できることは、米国
特許４７８７９６３号明細書、国際公開ＷＯ９８／１０
２７３号公報に開示されている。また、ポリエチレング
リコールの添加も反応速度の促進に効果のあることも知
られている。しかしながら、２本鎖核酸を直接検出する
反応を加速させる技術は開発されておらず、その開発が
必要であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即
ち、本発明は、２本鎖ＤＮＡを変性することなくそのま
ま分析するための方法において、その反応速度を促進す
る方法を提供することを課題とした。本発明はまた、簡
便かつ高感度かつ迅速な２本鎖ＤＮＡの分析方法を提供
することを解決すべき課題とした。
術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即
ち、本発明は、２本鎖ＤＮＡを変性することなくそのま
ま分析するための方法において、その反応速度を促進す
る方法を提供することを課題とした。本発明はまた、簡
便かつ高感度かつ迅速な２本鎖ＤＮＡの分析方法を提供
することを解決すべき課題とした。
【００１０】さらに本発明は、短時間かつ高感度で、あ
る遺伝子およびその多型を検出する目的に利用できる２
本鎖ＤＮＡの分析方法を提供することを解決すべき課題
とした。さらに本発明は、２本鎖認識物質周辺に移送さ
れた非特異吸着性２本鎖ＤＮＡを除去することにより、
シグナル／ノイズ比を向上させる方法を提供することを
解決すべき課題とした。さらに本発明は、２本鎖認識物
質との結合能力の弱い２本鎖ＤＮＡを、２本鎖ＤＮＡ認
識物質より引き剥がすことによりＳＮＰ等の解析精度を
向上させる方法を提供することを解決すべき課題とし
た。
る遺伝子およびその多型を検出する目的に利用できる２
本鎖ＤＮＡの分析方法を提供することを解決すべき課題
とした。さらに本発明は、２本鎖認識物質周辺に移送さ
れた非特異吸着性２本鎖ＤＮＡを除去することにより、
シグナル／ノイズ比を向上させる方法を提供することを
解決すべき課題とした。さらに本発明は、２本鎖認識物
質との結合能力の弱い２本鎖ＤＮＡを、２本鎖ＤＮＡ認
識物質より引き剥がすことによりＳＮＰ等の解析精度を
向上させる方法を提供することを解決すべき課題とし
た。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、支持体上に固定され
た２本鎖ＤＮＡ認識物質に検体を接触させ、さらに該２
本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と検体を含む溶
液との間に電場をかけることにより支持体上に固定され
た２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２本鎖ＤＮＡとの結
合を促進し、その後に該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合し
た２本鎖ＤＮＡを測定することにより、２本鎖ＤＮＡを
変性することなくそのまま、かつ反応速度を促進して、
２本鎖ＤＮＡを分析することが可能になることを見出し
た。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものであ
る。
解決するために鋭意検討した結果、支持体上に固定され
た２本鎖ＤＮＡ認識物質に検体を接触させ、さらに該２
本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と検体を含む溶
液との間に電場をかけることにより支持体上に固定され
た２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２本鎖ＤＮＡとの結
合を促進し、その後に該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合し
た２本鎖ＤＮＡを測定することにより、２本鎖ＤＮＡを
変性することなくそのまま、かつ反応速度を促進して、
２本鎖ＤＮＡを分析することが可能になることを見出し
た。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものであ
る。
【００１２】さらに本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ認識物
質と結合した２本鎖ＤＮＡの量は、ＤＮＡインターカレ
ーターのような２本鎖挿入剤を用いることにより、高感
度で検出することができることを見出した。さらに本発
明者らは、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体
と該検体との間に電場をかけて支持体上に固定された２
本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２本鎖ＤＮＡとの結合を
促進した後に、上記電場とは逆向きの電場をかけること
により、非特異吸着ＤＮＡ及び２本鎖ＤＮＡ認識物質と
の結合が弱いＤＮＡを除去し、これによりシグナル／ノ
イズ比を向上できることも見出している。
質と結合した２本鎖ＤＮＡの量は、ＤＮＡインターカレ
ーターのような２本鎖挿入剤を用いることにより、高感
度で検出することができることを見出した。さらに本発
明者らは、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体
と該検体との間に電場をかけて支持体上に固定された２
本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２本鎖ＤＮＡとの結合を
促進した後に、上記電場とは逆向きの電場をかけること
により、非特異吸着ＤＮＡ及び２本鎖ＤＮＡ認識物質と
の結合が弱いＤＮＡを除去し、これによりシグナル／ノ
イズ比を向上できることも見出している。
【００１３】即ち、本発明によれば、検体中の２本鎖Ｄ
ＮＡの分析方法であって、（１）支持体上に固定された
２本鎖ＤＮＡ認識物質と該検体とを接触させる工程、
（２）検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２
本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場を、該
２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検体との
間にかける工程、及び（３）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と
結合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程、を含む上記の分
析方法が提供される。
ＮＡの分析方法であって、（１）支持体上に固定された
２本鎖ＤＮＡ認識物質と該検体とを接触させる工程、
（２）検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２
本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場を、該
２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検体との
間にかける工程、及び（３）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と
結合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程、を含む上記の分
析方法が提供される。
【００１４】本発明の別の態様によれば、検体中の２本
鎖ＤＮＡの分析方法であって、（１）支持体上に固定さ
れた２本鎖ＤＮＡ認識物質と該検体とを接触させる工
程、（２）検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定され
た２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場
を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検
体との間にかける工程、（３）工程（２）における電場
とは逆向きの電場をかける工程、及び（４）該２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程、
を含む上記の分析方法が提供される。
鎖ＤＮＡの分析方法であって、（１）支持体上に固定さ
れた２本鎖ＤＮＡ認識物質と該検体とを接触させる工
程、（２）検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定され
た２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場
を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が固定された支持体と該検
体との間にかける工程、（３）工程（２）における電場
とは逆向きの電場をかける工程、及び（４）該２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程、
を含む上記の分析方法が提供される。
【００１５】好ましくは、２本鎖ＤＮＡ認識物質は２本
鎖ＤＮＡ認識抗体、ＤＮＡ転写因子、Ｚｎフィンガーモ
チーフ又はリングフィンガーモチーフを有するタンパク
質、あるいはペプチド核酸である。
鎖ＤＮＡ認識抗体、ＤＮＡ転写因子、Ｚｎフィンガーモ
チーフ又はリングフィンガーモチーフを有するタンパク
質、あるいはペプチド核酸である。
【００１６】好ましくは、該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結
合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程においては、反応系
にＤＮＡ２本鎖を認識する挿入剤を添加し、該２本鎖Ｄ
ＮＡに挿入された挿入剤を検出することにより、該検体
中の該２本鎖ＤＮＡが測定される。
合した２本鎖ＤＮＡを測定する工程においては、反応系
にＤＮＡ２本鎖を認識する挿入剤を添加し、該２本鎖Ｄ
ＮＡに挿入された挿入剤を検出することにより、該検体
中の該２本鎖ＤＮＡが測定される。
【００１７】好ましくは、該挿入剤はＤＮＡインターカ
レーターである。好ましくは、該ＤＮＡインターカレー
ターは電気化学的活性を有し、該ＤＮＡインターカレー
ターを電気化学的手法により検出することにより、該検
体中の該２本鎖ＤＮＡが測定される。好ましくは、ＤＮ
Ａインターカレーターを、蛍光法、発光法または表面プ
ラズモン法により検出する。
レーターである。好ましくは、該ＤＮＡインターカレー
ターは電気化学的活性を有し、該ＤＮＡインターカレー
ターを電気化学的手法により検出することにより、該検
体中の該２本鎖ＤＮＡが測定される。好ましくは、ＤＮ
Ａインターカレーターを、蛍光法、発光法または表面プ
ラズモン法により検出する。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。本発明による検体中の２本鎖ＤＮＡ
の分析方法は、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮ
Ａ認識物質と該検体とを接触させる工程、（２）検体中
の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認
識物質の方に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ
認識物質が固定された支持体と該検体との間にかける工
程、及び（３）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本
鎖ＤＮＡを測定する工程、を含むことを特徴とする。
て詳細に説明する。本発明による検体中の２本鎖ＤＮＡ
の分析方法は、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮ
Ａ認識物質と該検体とを接触させる工程、（２）検体中
の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認
識物質の方に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ
認識物質が固定された支持体と該検体との間にかける工
程、及び（３）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本
鎖ＤＮＡを測定する工程、を含むことを特徴とする。
【００１９】本明細書で言う「検体」の種類は２本鎖Ｄ
ＮＡを含むものであればその種類は特に制限されず、例
えば、末梢静脈血のような血液、白血球、血清、尿、糞
便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織
細胞、その他核酸を含有する任意の試料を用いることが
できる。検体は上記のような組織細胞などの試料をその
まま使用してもよいが、好ましくは、検体試料中の細胞
を破壊して２本鎖ＤＮＡを遊離させたものを検体として
使用する。検体試料中の細胞の破壊は、常法により行う
ことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を
外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液
（例えば、ＳＤＳ、Triton-X、Tween-20等の界面活性
剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶
液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもでき
る。核酸抽出溶液を用いて核酸を溶出する場合には、３
７℃以上の温度でインキュベ−トすることにより反応を
促進することができる。
ＮＡを含むものであればその種類は特に制限されず、例
えば、末梢静脈血のような血液、白血球、血清、尿、糞
便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織
細胞、その他核酸を含有する任意の試料を用いることが
できる。検体は上記のような組織細胞などの試料をその
まま使用してもよいが、好ましくは、検体試料中の細胞
を破壊して２本鎖ＤＮＡを遊離させたものを検体として
使用する。検体試料中の細胞の破壊は、常法により行う
ことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を
外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液
（例えば、ＳＤＳ、Triton-X、Tween-20等の界面活性
剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶
液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもでき
る。核酸抽出溶液を用いて核酸を溶出する場合には、３
７℃以上の温度でインキュベ−トすることにより反応を
促進することができる。
【００２０】本発明では、支持体上に固定された２本鎖
ＤＮＡ認識物質を使用する。本発明で用いる支持体とし
ては、以下に説明する２本鎖ＤＮＡ認識物質を固定でき
るものであれば特に制限されない。好ましい支持体の例
としては、ガラス、石英、プラスチック、電極等の非多
孔性支持体を好ましく用いることができる。電極の材料
としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電
極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、
酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化
物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、
チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金も
しくはグラシーカーボンを用いることが特に好ましい。
これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆され
ていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。ま
た、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など
の多孔性支持体を使用してもよく、非多孔性支持体と多
孔性支持体の複合体を使用することもできる。
ＤＮＡ認識物質を使用する。本発明で用いる支持体とし
ては、以下に説明する２本鎖ＤＮＡ認識物質を固定でき
るものであれば特に制限されない。好ましい支持体の例
としては、ガラス、石英、プラスチック、電極等の非多
孔性支持体を好ましく用いることができる。電極の材料
としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電
極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、
酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化
物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、
チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金も
しくはグラシーカーボンを用いることが特に好ましい。
これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆され
ていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。ま
た、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など
の多孔性支持体を使用してもよく、非多孔性支持体と多
孔性支持体の複合体を使用することもできる。
【００２１】本発明で用いる２本鎖ＤＮＡ認識物質とし
ては、２本鎖ＤＮＡを認識し、特異的に結合する物質を
示す。２本鎖ＤＮＡ認識物質の具体例としては、ＤＮＡ
転写因子、ミスマッチ修復タンパク質、２本鎖ＤＮＡ認
識抗体、又はペプチド核酸などを挙げることができる。
ては、２本鎖ＤＮＡを認識し、特異的に結合する物質を
示す。２本鎖ＤＮＡ認識物質の具体例としては、ＤＮＡ
転写因子、ミスマッチ修復タンパク質、２本鎖ＤＮＡ認
識抗体、又はペプチド核酸などを挙げることができる。
【００２２】ＤＮＡ転写因子は、遺伝子上のプロモータ
ー領域に結合して、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を制御
する物質である（田村隆明著：転写因子（羊土社 １９
９５年））。従って、転写因子は特定の配列の２本鎖Ｄ
ＮＡに特異的に結合することが知られている。
ー領域に結合して、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を制御
する物質である（田村隆明著：転写因子（羊土社 １９
９５年））。従って、転写因子は特定の配列の２本鎖Ｄ
ＮＡに特異的に結合することが知られている。
【００２３】多数ある転写因子のうち、Zinc Finger Pr
oteinつまりZinc FingerやRing Fingerモチーフをもつ
転写因子群は、真核生物における出現率は非常に高く、
ゲノム中の１％はこれをコードしているらしい。Pabo等
はZinc Figerモチーフの３次構造を解析、ＤＮＡと結合
するメカニズムの解明した（Science,252, 809(199
1)）。さらに、Choo等は、遺伝子組換法により、特定の
配列に結合する自然界にはないZinc Finger Protein群
を作製することに成功している(Nature 372,642[1994],
PNAS91,11163(1994))。さらに、Scripps Research Inst
ituteのグループはPhage Displayにより新規なZinc Fin
ger Protein群の作製に成功している（PNAS95,2812,[19
98]：96,2758(1999)）。このように、Zinc Finger Prot
einに代表されるＤＮＡ転写因子群は、本来２本鎖ＤＮ
Ａと結合する性質をもっており、かつ近年の研究によれ
ば、任意のＤＮＡ配列を認識する組換体の作製も可能と
なってきている。このような、タンパク質を固定化する
ことにより、２本鎖ＤＮＡを効率良く支持体上に捕捉す
ることが可能である。
oteinつまりZinc FingerやRing Fingerモチーフをもつ
転写因子群は、真核生物における出現率は非常に高く、
ゲノム中の１％はこれをコードしているらしい。Pabo等
はZinc Figerモチーフの３次構造を解析、ＤＮＡと結合
するメカニズムの解明した（Science,252, 809(199
1)）。さらに、Choo等は、遺伝子組換法により、特定の
配列に結合する自然界にはないZinc Finger Protein群
を作製することに成功している(Nature 372,642[1994],
PNAS91,11163(1994))。さらに、Scripps Research Inst
ituteのグループはPhage Displayにより新規なZinc Fin
ger Protein群の作製に成功している（PNAS95,2812,[19
98]：96,2758(1999)）。このように、Zinc Finger Prot
einに代表されるＤＮＡ転写因子群は、本来２本鎖ＤＮ
Ａと結合する性質をもっており、かつ近年の研究によれ
ば、任意のＤＮＡ配列を認識する組換体の作製も可能と
なってきている。このような、タンパク質を固定化する
ことにより、２本鎖ＤＮＡを効率良く支持体上に捕捉す
ることが可能である。
【００２４】ミスマッチ修復タンパク質とは、ＤＮＡ２
本鎖の間に生じた不適正塩基対（不正またはミス対合）
の修復を行う酵素である。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼの場合、１０8塩基対に１箇所程度の頻度で鋳型
ＤＮＡの塩基と対を成さないヌクレオチドを取り込む
が、ミスマッチ修復酵素によりこれが修復される。ミス
マッチ修復酵素は細胞内で複製直後のＤＮＡに結合し
て、ミスマッチ塩基対を含む部分のヌクレオチドを除去
する。本発明ではミスマッチ修復タンパク質が２本鎖Ｄ
ＮＡに結合する性質を利用することにより、該タンパク
質を２本鎖ＤＮＡ認識物質として使用することができ
る。
本鎖の間に生じた不適正塩基対（不正またはミス対合）
の修復を行う酵素である。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼの場合、１０8塩基対に１箇所程度の頻度で鋳型
ＤＮＡの塩基と対を成さないヌクレオチドを取り込む
が、ミスマッチ修復酵素によりこれが修復される。ミス
マッチ修復酵素は細胞内で複製直後のＤＮＡに結合し
て、ミスマッチ塩基対を含む部分のヌクレオチドを除去
する。本発明ではミスマッチ修復タンパク質が２本鎖Ｄ
ＮＡに結合する性質を利用することにより、該タンパク
質を２本鎖ＤＮＡ認識物質として使用することができ
る。
【００２５】２本鎖ＤＮＡを認識する抗体が、全身性エ
リトマトーデスの患者血清中に出現することは良く知ら
れている。抗体作製技術、遺伝子組換技術の進歩によ
り、このような２本鎖ＤＮＡ認識モノクローナル抗体の
作製が可能となってきている(Suzuki etal,Int J Mol M
ed 3,385,1999,Barry etal,J Biol Chem 269,3623(199
4))。このような、２本鎖ＤＮＡ認識抗体は、本発明の
２本鎖ＤＮＡ認識タンパク質として使用することができ
る。
リトマトーデスの患者血清中に出現することは良く知ら
れている。抗体作製技術、遺伝子組換技術の進歩によ
り、このような２本鎖ＤＮＡ認識モノクローナル抗体の
作製が可能となってきている(Suzuki etal,Int J Mol M
ed 3,385,1999,Barry etal,J Biol Chem 269,3623(199
4))。このような、２本鎖ＤＮＡ認識抗体は、本発明の
２本鎖ＤＮＡ認識タンパク質として使用することができ
る。
【００２６】ペプチド核酸は、ＤＮＡの骨格構造である
糖、リン酸部分をポリアミド骨格で置き換えたもので、
ＤＮＡ等と特異的にハイブリダイズし、２本鎖を形成す
ることが知られている（P.E.Nielesen et al, Science,
254, 1497(1991)；遺伝子とバイオテクノロジー：杉本
直己著 丸善株式会社刊、１９９９年）。ペプチド核酸
は機能的にはＤＮＡと殆ど変わりがないが、その構造は
全く異なり、ポリアミド骨格を基本としてその分子中に
糖及びリン酸を含まない。さらに、ペプチド核酸は、Ｄ
ＮＡ−ＤＮＡ鎖内に入りこみ３重鎖を形成することが可
能である。本発明ではペプチド核酸のこの性質を利用す
ることにより、ペプチド核酸を２本鎖ＤＮＡ認識物質と
して使用することができる。
糖、リン酸部分をポリアミド骨格で置き換えたもので、
ＤＮＡ等と特異的にハイブリダイズし、２本鎖を形成す
ることが知られている（P.E.Nielesen et al, Science,
254, 1497(1991)；遺伝子とバイオテクノロジー：杉本
直己著 丸善株式会社刊、１９９９年）。ペプチド核酸
は機能的にはＤＮＡと殆ど変わりがないが、その構造は
全く異なり、ポリアミド骨格を基本としてその分子中に
糖及びリン酸を含まない。さらに、ペプチド核酸は、Ｄ
ＮＡ−ＤＮＡ鎖内に入りこみ３重鎖を形成することが可
能である。本発明ではペプチド核酸のこの性質を利用す
ることにより、ペプチド核酸を２本鎖ＤＮＡ認識物質と
して使用することができる。
【００２７】上記した２本鎖ＤＮＡ認識物質は、そのま
ま支持体上に固定化することができる。具体的には、２
本鎖ＤＮＡ認識物質を含む溶液を支持体上に点着し、一
定時間放置することにより、２本鎖ＤＮＡ認識物質を支
持体上に固定化することができる。
ま支持体上に固定化することができる。具体的には、２
本鎖ＤＮＡ認識物質を含む溶液を支持体上に点着し、一
定時間放置することにより、２本鎖ＤＮＡ認識物質を支
持体上に固定化することができる。
【００２８】本発明の方法は、（２）検体中の２本鎖Ｄ
ＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方
に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が
固定された支持体と該検体との間にかける工程、を含
む。
ＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方
に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が
固定された支持体と該検体との間にかける工程、を含
む。
【００２９】電場をかける方法は特に限定されないが、
検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質の方に向かわせるような向きの電場をかけ
ることが必要である。このような電場をかけることによ
り、支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体
中の２本鎖ＤＮＡとの結合が促進される。２本鎖ＤＮＡ
は通常マイナスの電荷を帯びていることから、２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質が固定された支持体側に陽極を設置する
か、支持体自体を陽極とし、２本鎖ＤＮＡを含む検体
（好ましくは、検体は溶液である）中に陰極を設置し、
上記陽極と上記陰極の間に電場をかけることにより、支
持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２
本鎖ＤＮＡとの結合を促進することができる。
検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定された２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質の方に向かわせるような向きの電場をかけ
ることが必要である。このような電場をかけることによ
り、支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体
中の２本鎖ＤＮＡとの結合が促進される。２本鎖ＤＮＡ
は通常マイナスの電荷を帯びていることから、２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質が固定された支持体側に陽極を設置する
か、支持体自体を陽極とし、２本鎖ＤＮＡを含む検体
（好ましくは、検体は溶液である）中に陰極を設置し、
上記陽極と上記陰極の間に電場をかけることにより、支
持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の２
本鎖ＤＮＡとの結合を促進することができる。
【００３０】検体中の２本鎖ＤＮＡを支持体上に固定さ
れた２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場
の電位差は０〜＋２Ｖの範囲（即ち、支持体側の方が検
体液よりも０〜＋２Ｖ電位が高い）であることが好まし
い。本発明の好ましい実施態様の一つとしては、２本鎖
ＤＮＡと結合する物質を固定化した電極を作成し、該電
極と検体液を接触させ、その後、該電極と検体液の間に
電場（電位差）をかける手法が挙げられる。
れた２本鎖ＤＮＡ認識物質の方に向かわせるための電場
の電位差は０〜＋２Ｖの範囲（即ち、支持体側の方が検
体液よりも０〜＋２Ｖ電位が高い）であることが好まし
い。本発明の好ましい実施態様の一つとしては、２本鎖
ＤＮＡと結合する物質を固定化した電極を作成し、該電
極と検体液を接触させ、その後、該電極と検体液の間に
電場（電位差）をかける手法が挙げられる。
【００３１】好ましい一態様によれば、本発明の方法
は、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質
と該検体とを接触させる工程、（２）検体中の２本鎖Ｄ
ＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方
に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が
固定された支持体と該検体との間にかける工程、及び
（３）工程（２）における電場とは逆向きの電場をかけ
る工程、を含む。ここで工程（２）は上記と同様に行な
うことができる。
は、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質
と該検体とを接触させる工程、（２）検体中の２本鎖Ｄ
ＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方
に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が
固定された支持体と該検体との間にかける工程、及び
（３）工程（２）における電場とは逆向きの電場をかけ
る工程、を含む。ここで工程（２）は上記と同様に行な
うことができる。
【００３２】工程（３）は、工程（２）における電場と
は逆向きの電場をかける工程である。即ち、２本鎖ＤＮ
Ａ認識物質が固定された支持体側に陰極を設置するか、
または支持体自体を陰極とし、２本鎖ＤＮＡを含む検体
（好ましくは、検体は溶液である）中に陽極を設置し、
上記陽極と上記陰極の間に電場をかけることにより、支
持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質周辺の２本鎖
ＤＮＡを支持体より除去することができる。このよう
に、上記工程（３）を採用することにより、非特異吸着
ＤＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡ認識物質との結合が弱いＤＮ
Ａを支持体より除去することができ、これによりシグナ
ル／ノイズ比を向上させることができる。
は逆向きの電場をかける工程である。即ち、２本鎖ＤＮ
Ａ認識物質が固定された支持体側に陰極を設置するか、
または支持体自体を陰極とし、２本鎖ＤＮＡを含む検体
（好ましくは、検体は溶液である）中に陽極を設置し、
上記陽極と上記陰極の間に電場をかけることにより、支
持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質周辺の２本鎖
ＤＮＡを支持体より除去することができる。このよう
に、上記工程（３）を採用することにより、非特異吸着
ＤＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡ認識物質との結合が弱いＤＮ
Ａを支持体より除去することができ、これによりシグナ
ル／ノイズ比を向上させることができる。
【００３３】逆向きの電位の電位差は０〜−２Ｖの範囲
（即ち、該支持体側の方が検体液よりも０〜＋２Ｖ電位
が低い）であることが好ましい。本発明の好ましい実施
態様の一つとしては、２本鎖ＤＮＡと結合する物質を固
定化した電極を作成し、該電極と検体液を接触させ、そ
の後、該電極と検体液の間に電位をかけ、さらにその後
前記電位とは逆向きの電位をかけ、不必要なＤＮＡ分子
を除く手法が挙げられる。
（即ち、該支持体側の方が検体液よりも０〜＋２Ｖ電位
が低い）であることが好ましい。本発明の好ましい実施
態様の一つとしては、２本鎖ＤＮＡと結合する物質を固
定化した電極を作成し、該電極と検体液を接触させ、そ
の後、該電極と検体液の間に電位をかけ、さらにその後
前記電位とは逆向きの電位をかけ、不必要なＤＮＡ分子
を除く手法が挙げられる。
【００３４】検体中の標的ＤＮＡは、ＰＣＲ法などで増
幅することなく直接検出するのが好ましいが、予め増幅
したのちに検出してもよい。標的ＤＮＡまたはその増幅
体は、予め標識しておくことにより容易に検出可能であ
る。ＤＮＡを標識するには、酵素(Reverse Transcripta
se,DNApolymerase RNAPolymerase,Terminaldeoxytransf
eraseなど)を用いる方法がよく用いられるが、化学反応
により、直接標識物質を結合させてもよい。このような
標識方法については、公知の技術として成書に記載され
ている（野村慎太郎著 脱アイソトープ実験プロトコー
ル１、秀潤社１９９４年、脱アイソトープ実験プロトコ
ール２、秀潤社１９９８年、村松正明著 ＤＮＡマイク
ロアレイと最新ＰＣＲ法標識物質 秀潤社２０００
年）。標識物質は、検出可能なシグナルを作ることの可
能な物質であることが好ましい。標識物質が、酵素や触
媒のような、シグナルの増幅能力のある物質である場
合、ＤＮＡの検出感度は大きく向上する。該標識物質は
また、ビオチン−アビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗
体のような特異結合対の片方であって、その結合相手を
介して標識物質を標的ＤＮＡに結合させてもよい。
幅することなく直接検出するのが好ましいが、予め増幅
したのちに検出してもよい。標的ＤＮＡまたはその増幅
体は、予め標識しておくことにより容易に検出可能であ
る。ＤＮＡを標識するには、酵素(Reverse Transcripta
se,DNApolymerase RNAPolymerase,Terminaldeoxytransf
eraseなど)を用いる方法がよく用いられるが、化学反応
により、直接標識物質を結合させてもよい。このような
標識方法については、公知の技術として成書に記載され
ている（野村慎太郎著 脱アイソトープ実験プロトコー
ル１、秀潤社１９９４年、脱アイソトープ実験プロトコ
ール２、秀潤社１９９８年、村松正明著 ＤＮＡマイク
ロアレイと最新ＰＣＲ法標識物質 秀潤社２０００
年）。標識物質は、検出可能なシグナルを作ることの可
能な物質であることが好ましい。標識物質が、酵素や触
媒のような、シグナルの増幅能力のある物質である場
合、ＤＮＡの検出感度は大きく向上する。該標識物質は
また、ビオチン−アビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗
体のような特異結合対の片方であって、その結合相手を
介して標識物質を標的ＤＮＡに結合させてもよい。
【００３５】しかしながら、前述の標識操作は、一般的
に煩雑であるので、さらに好ましい検出方法としては、
検体中のＤＮＡを予め標識せずに測定する方法を挙げる
ことができる。これには、例えば２本鎖ＤＮＡを認識す
るＤＮＡ挿入剤、いわゆるＤＮＡインターカレーターを
用いることができる。ＤＮＡインターカレーターの使用
により、検出操作が簡単になるだけではなく、検出感度
も向上する。例えば、１０００ｂｐのＤＮＡを検出する
場合、いわゆる標識法は多くとも数個の標識物質しか導
入できないのであるが、インターカレーターを使用する
場合は１００個以上の標識物質を導入することが可能で
ある。２本鎖ＤＮＡ挿入剤（ＤＮＡインターカレータ
ー）は、検体である２本鎖ＤＮＡが支持体上の２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質と反応した後に添加してもよいし、同時に
加えてもよい。
に煩雑であるので、さらに好ましい検出方法としては、
検体中のＤＮＡを予め標識せずに測定する方法を挙げる
ことができる。これには、例えば２本鎖ＤＮＡを認識す
るＤＮＡ挿入剤、いわゆるＤＮＡインターカレーターを
用いることができる。ＤＮＡインターカレーターの使用
により、検出操作が簡単になるだけではなく、検出感度
も向上する。例えば、１０００ｂｐのＤＮＡを検出する
場合、いわゆる標識法は多くとも数個の標識物質しか導
入できないのであるが、インターカレーターを使用する
場合は１００個以上の標識物質を導入することが可能で
ある。２本鎖ＤＮＡ挿入剤（ＤＮＡインターカレータ
ー）は、検体である２本鎖ＤＮＡが支持体上の２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質と反応した後に添加してもよいし、同時に
加えてもよい。
【００３６】ＤＮＡインターカレーターは、そのもの自
体が検出可能なシグナルを形成できる物質であってもよ
いが、その側鎖にシグナル形成物質を結合していたり、
ビオチン−アビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗体のよ
うな特異結合対を介してインターカレーターに結合して
いてもよい。本発明における、検出可能なシグナルは、
例えば、蛍光検出、発光検出、化学発光検出、生物発光
検出、電気化学発光検出、放射能検出、電気化学検出、
比色検出により検出可能なシグナルであることが好まし
いが、これらに限定されるものではない。
体が検出可能なシグナルを形成できる物質であってもよ
いが、その側鎖にシグナル形成物質を結合していたり、
ビオチン−アビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗体のよ
うな特異結合対を介してインターカレーターに結合して
いてもよい。本発明における、検出可能なシグナルは、
例えば、蛍光検出、発光検出、化学発光検出、生物発光
検出、電気化学発光検出、放射能検出、電気化学検出、
比色検出により検出可能なシグナルであることが好まし
いが、これらに限定されるものではない。
【００３７】好ましいＤＮＡインターカレーターの例と
して、蛍光性色素のようにインターカレーター自身がシ
グナル形成能力をもっていてもよいが、インターカレー
ターとシグナル形成物質との複合体であってもよい。イ
ンターカレーターとシグナル形成物質との複合体は、例
えば、下記一般式（１）、（２）のようなものをあげる
ことができる 一般式（１） Ｘ−Ｌ１−Ｉ−Ｌ２−Ｙ 一般式（２） Ｘ−Ｌ１−Ｉ （一般式（１）、（２）において、Ｉは２本鎖ＤＮＡに
挿入される物質を示し、Ｌ１，Ｌ２はリンカー配列を示
し、Ｘ及びＹは、検出可能な分子を示す。）
して、蛍光性色素のようにインターカレーター自身がシ
グナル形成能力をもっていてもよいが、インターカレー
ターとシグナル形成物質との複合体であってもよい。イ
ンターカレーターとシグナル形成物質との複合体は、例
えば、下記一般式（１）、（２）のようなものをあげる
ことができる 一般式（１） Ｘ−Ｌ１−Ｉ−Ｌ２−Ｙ 一般式（２） Ｘ−Ｌ１−Ｉ （一般式（１）、（２）において、Ｉは２本鎖ＤＮＡに
挿入される物質を示し、Ｌ１，Ｌ２はリンカー配列を示
し、Ｘ及びＹは、検出可能な分子を示す。）
【００３８】一般式（１）及び（２）においてＩで示さ
れる２本鎖ＤＮＡに挿入される物質は、好ましくは、分
子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が
２本鎖ＤＮＡの塩基対と塩基対の間に介入することによ
って、２本鎖ＤＮＡと結合することができる物質を言
う。
れる２本鎖ＤＮＡに挿入される物質は、好ましくは、分
子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が
２本鎖ＤＮＡの塩基対と塩基対の間に介入することによ
って、２本鎖ＤＮＡと結合することができる物質を言
う。
【００３９】一般式（１）及び（２）においてＬ１，Ｌ
２で示されるリンカー配列は特に限定されず、例えば、
アルキレン基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基又は
これらの組み合わせから成る基などを例示することがで
きる。
２で示されるリンカー配列は特に限定されず、例えば、
アルキレン基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基又は
これらの組み合わせから成る基などを例示することがで
きる。
【００４０】一般式（１）及び（２）においてＸ，Ｙが
示す検出可能な分子の具体例としては、Fluorescein、R
hodamin、Cy5、Cy3、Texas Red、ルテニウム錯体等に代
表される蛍光色素団、ビオチン−アビジン、抗原−抗
体、ハプテン−抗体のような特異結合対を形成する物
質、フェロセン誘導体に代表される電気化学的検出可能
な物質、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体のような
発光性の物質、またいわゆるＥＩＡ（酵素免疫測定法）
で使用しているような酵素等を挙げることができる。
示す検出可能な分子の具体例としては、Fluorescein、R
hodamin、Cy5、Cy3、Texas Red、ルテニウム錯体等に代
表される蛍光色素団、ビオチン−アビジン、抗原−抗
体、ハプテン−抗体のような特異結合対を形成する物
質、フェロセン誘導体に代表される電気化学的検出可能
な物質、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体のような
発光性の物質、またいわゆるＥＩＡ（酵素免疫測定法）
で使用しているような酵素等を挙げることができる。
【００４１】Ｘ，Ｙが特異結合対を形成する物質である
場合、Ｘ，Ｙを介してFluorescein、Rhodamin、Cy5、Cy
3、Texas Red、ルテニウム錯体等に代表される蛍光色素
団、フェロセン誘導体に代表される電気化学的検出可能
な物質、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体のような
発光性の物質、またいわゆるＥＩＡ（酵素免疫測定法）
で使用しているような酵素等を結合させることができ
る。
場合、Ｘ，Ｙを介してFluorescein、Rhodamin、Cy5、Cy
3、Texas Red、ルテニウム錯体等に代表される蛍光色素
団、フェロセン誘導体に代表される電気化学的検出可能
な物質、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体のような
発光性の物質、またいわゆるＥＩＡ（酵素免疫測定法）
で使用しているような酵素等を結合させることができ
る。
【００４２】本発明で用いる電気化学的、光化学的に活
性な挿入剤は特に限定されるものではなく、例えばエチ
ジウム、エチジウムブロマイド、アクリジン、アミノア
クリジン、アクリジンオレンジ、ビスベンチミド、ジア
ミノフェニルインドール、プロフラビン、エリブチシ
ン、アクチノマイシンＤ、チアゾール、クロモマイシ
ン、ドーノマイシン、マイトマイシンＣ、並びにこれら
の誘導体等を用いることができる。また、その他の使用
可能な挿入剤としては、特開昭62-282599 号公報に記載
されたものが挙げられる。さらに本発明で用いることが
できる挿入剤の具体例を示す。
性な挿入剤は特に限定されるものではなく、例えばエチ
ジウム、エチジウムブロマイド、アクリジン、アミノア
クリジン、アクリジンオレンジ、ビスベンチミド、ジア
ミノフェニルインドール、プロフラビン、エリブチシ
ン、アクチノマイシンＤ、チアゾール、クロモマイシ
ン、ドーノマイシン、マイトマイシンＣ、並びにこれら
の誘導体等を用いることができる。また、その他の使用
可能な挿入剤としては、特開昭62-282599 号公報に記載
されたものが挙げられる。さらに本発明で用いることが
できる挿入剤の具体例を示す。
【００４３】
【化１】
【００４４】以下の実施例により本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明は実施例によって限定されること
はない。
に説明するが、本発明は実施例によって限定されること
はない。
【００４５】
【実施例】実施例１ （１）抗体の固定化 ２本鎖認識抗体を含むＰＢＳ溶液（フナコシ社製、１μ
ｇ／ｍｌ）１μｌを、表面にイオウ原子（Ｓ）を介して
サクシイミド基を導入した、平板上に配置された、金電
極（２．５ｍｍφ）に点着し、１２時間放置した。さら
にこの金電極表面を、０．５ＭのGlycineホウ酸に３０
分間浸漬したのちＰＢＳにより洗浄した。
ｇ／ｍｌ）１μｌを、表面にイオウ原子（Ｓ）を介して
サクシイミド基を導入した、平板上に配置された、金電
極（２．５ｍｍφ）に点着し、１２時間放置した。さら
にこの金電極表面を、０．５ＭのGlycineホウ酸に３０
分間浸漬したのちＰＢＳにより洗浄した。
【００４６】（２）サンプルの調製 Human alpha 2-HS-glycoprotein（HSGP）の翻訳領域
（ＯＲＦ）をpBluescriptIISK-のマルチクローニングサ
イトのNotI、XhoIサイト間にクローニングした。このベ
クターを鋳型にして、HSGP cDNAをＰＣＲ法により増幅
した。
（ＯＲＦ）をpBluescriptIISK-のマルチクローニングサ
イトのNotI、XhoIサイト間にクローニングした。このベ
クターを鋳型にして、HSGP cDNAをＰＣＲ法により増幅
した。
【００４７】（３）反応 ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡをＴＥに溶解し、０．１μＭ
溶液を調製し、これをサンプルとした。サンプルを１０
μｌ上記の（１）で作製した２本鎖認識抗体固定化金電
極表面に点着し、その後この金電極表面に１．５Ｖの電
圧を印加し、１５分間放置後、ＴＥ溶液により洗浄した
溶液を調製し、これをサンプルとした。サンプルを１０
μｌ上記の（１）で作製した２本鎖認識抗体固定化金電
極表面に点着し、その後この金電極表面に１．５Ｖの電
圧を印加し、１５分間放置後、ＴＥ溶液により洗浄した
【００４８】（４）測定 さらに、この金電極をSybrGreen溶液（Molecular Probe
社、１０００倍希釈ＴＥ溶液）に２０分間浸漬したの
ち、ＴＥにより洗浄した。洗浄済み金電極を風乾後、Ｆ
ＬＡ２０００（富士写真フイルム株式会社製）により６
３３ｎｍ励起による蛍光強度を測定した。
社、１０００倍希釈ＴＥ溶液）に２０分間浸漬したの
ち、ＴＥにより洗浄した。洗浄済み金電極を風乾後、Ｆ
ＬＡ２０００（富士写真フイルム株式会社製）により６
３３ｎｍ励起による蛍光強度を測定した。
【００４９】（比較例１）実施例１の（３）において、
金電極表面に１．５Ｖの電圧を印加することを行わない
以外は、同様にして蛍光強度を測定した。実施例１と比
較例１の結果を以下に示す。
金電極表面に１．５Ｖの電圧を印加することを行わない
以外は、同様にして蛍光強度を測定した。実施例１と比
較例１の結果を以下に示す。
【００５０】 （ＬＡＵは蛍光強度に比例する単位） 実施例１と比較例１との結果より、本発明の方法によ
り、反応を促進して２本鎖ＤＮＡを検出できることが示
された。
り、反応を促進して２本鎖ＤＮＡを検出できることが示
された。
【００５１】（実施例２）（１）抗体の固定化、（２）
サンプルの調製、（３）反応までは実施例１と同様に行
った。その後、特願平１１−３４９２８６号に記載の方
法で合成した、下記式で表される電気化学活性を有する
インターカレーター（５０ｍＭ）を含む０．１Ｍ酢酸−
酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）−０.１Ｍ塩化カリ
ウム水溶液の混合液に、上記の（１）〜（３）までの操
作を行った金電極（作用極）、白金（対極）および銀／
塩化銀参照電極を浸漬して三極電極を形成させ、ＣＶ５
０Ｗ（ＢＡＳ社製）を用いて、デファレンシャルパルス
ボンランメトリ−（ＤＰＶ）測定を行った。そして、そ
のＤＰＶより、印加電圧２６０ｍＶにおけるピ−ク電流
値を求めた。
サンプルの調製、（３）反応までは実施例１と同様に行
った。その後、特願平１１−３４９２８６号に記載の方
法で合成した、下記式で表される電気化学活性を有する
インターカレーター（５０ｍＭ）を含む０．１Ｍ酢酸−
酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）−０.１Ｍ塩化カリ
ウム水溶液の混合液に、上記の（１）〜（３）までの操
作を行った金電極（作用極）、白金（対極）および銀／
塩化銀参照電極を浸漬して三極電極を形成させ、ＣＶ５
０Ｗ（ＢＡＳ社製）を用いて、デファレンシャルパルス
ボンランメトリ−（ＤＰＶ）測定を行った。そして、そ
のＤＰＶより、印加電圧２６０ｍＶにおけるピ−ク電流
値を求めた。
【００５２】
【化２】
【００５３】（比較例２）実施例２において、金電極表
面に１．５Ｖの電圧を印加することを行わない以外は、
同様にしてＤＰＶ測定を行い、印加電圧２６０ｍＶにお
けるピ−ク電流値を求めた。実施例２と比較例２の結果
を以下に示す。
面に１．５Ｖの電圧を印加することを行わない以外は、
同様にしてＤＰＶ測定を行い、印加電圧２６０ｍＶにお
けるピ−ク電流値を求めた。実施例２と比較例２の結果
を以下に示す。
【００５４】 （バックグラウンドは、サンプルを反応させる前の金電
極でＤＰＶ測定した際のピ−ク電流） 実施例２と比較例２との結果より、本発明の方法によ
り、反応を促進して２本鎖ＤＮＡを検出できることが示
された。
極でＤＰＶ測定した際のピ−ク電流） 実施例２と比較例２との結果より、本発明の方法によ
り、反応を促進して２本鎖ＤＮＡを検出できることが示
された。
【００５５】
【発明の効果】本発明により、反応速度を促進して、２
本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分析することが
可能になった。また本発明の方法によれば、簡便かつ迅
速、高感度に２本鎖ＤＮＡを分析することができる。
本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分析することが
可能になった。また本発明の方法によれば、簡便かつ迅
速、高感度に２本鎖ＤＮＡを分析することができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/76 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ ４Ｂ０６３ 21/78 27/26 Ｐ 27/26 27/30 Ｂ 27/30 33/53 Ｍ 27/416 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/566 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｇ ３３６Ｂ Ｆターム(参考） 2G043 BA16 CA03 DA02 EA01 KA02 KA05 2G045 DA12 DA13 FA40 FB05 FB12 FB13 2G054 AA06 CA22 CE03 EA03 2G059 AA05 BB12 CC16 EE02 4B024 AA11 BA80 CA01 CA04 HA11 4B063 QA01 QQ02 QQ03 QQ08 QQ42 QR32 QR48 QR54 QR66 QR82 QS33 QS34 QS36 QX02 QX05
Claims (10)
- 【請求項１】 検体中の２本鎖ＤＮＡの分析方法であっ
て、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質
と該検体とを接触させる工程、（２）検体中の２本鎖Ｄ
ＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方
に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が
固定された支持体と該検体との間にかける工程、及び
（３）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖ＤＮＡ
を測定する工程、を含む上記の分析方法。 - 【請求項２】 検体中の２本鎖ＤＮＡの分析方法であっ
て、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質
と該検体とを接触させる工程、（２）検体中の２本鎖Ｄ
ＮＡを支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質の方
に向かわせるための電場を、該２本鎖ＤＮＡ認識物質が
固定された支持体と該検体との間にかける工程、（３）
工程（２）における電場とは逆向きの電場をかける工
程、及び（４）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本
鎖ＤＮＡを測定する工程、を含む上記の分析方法。 - 【請求項３】 ２本鎖ＤＮＡ認識物質が２本鎖ＤＮＡ認
識抗体である、請求項１又は２に記載の分析方法。 - 【請求項４】 ２本鎖ＤＮＡ認識物質がＤＮＡ転写因子
である、請求項１又は２に記載の分析方法。 - 【請求項５】 ２本鎖ＤＮＡ認識物質がＺｎフィンガー
モチーフまたはリングフィンガーモチーフをもつタンパ
ク質である、請求項１又は２に記載の分析方法。 - 【請求項６】 ２本鎖ＤＮＡ認識物質がペプチド核酸で
ある、請求項１又は２に記載の分析方法。 - 【請求項７】 ２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した２本鎖
ＤＮＡを測定する工程において、反応系にＤＮＡ２本鎖
を認識する挿入剤を添加し、該２本鎖ＤＮＡに挿入され
た挿入剤を検出することにより、該検体中の該２本鎖Ｄ
ＮＡを測定することを特徴とする、請求項１から６の何
れかに記載の分析方法。 - 【請求項８】 該挿入剤がＤＮＡインターカレーターで
ある、請求項７に記載の分析方法。 - 【請求項９】 該ＤＮＡインターカレーターが電気化学
的活性を有し、該ＤＮＡインターカレーターを電気化学
的手法により検出することにより、該検体中の該２本鎖
ＤＮＡを測定する、請求項８に記載の分析方法。 - 【請求項１０】 ＤＮＡインターカレーターを、蛍光
法、発光法または表面プラズモン法により検出する、請
求項８に記載の分析方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000332249A JP4040834B2 (ja) | 2000-10-31 | 2000-10-31 | ２本鎖ｄｎａの分析方法 |
| DE60142609T DE60142609D1 (de) | 2000-10-25 | 2001-10-23 | Methode zur Analyse doppelsträngiger DNA |
| AT01124357T ATE474932T1 (de) | 2000-10-25 | 2001-10-23 | Methode zur analyse doppelsträngiger dna |
| EP01124357A EP1201767B1 (en) | 2000-10-25 | 2001-10-23 | Method of analyzing double stranded DNA |
| US10/039,642 US6924105B2 (en) | 2000-10-25 | 2001-10-24 | Method of analyzing double stranded DNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000332249A JP4040834B2 (ja) | 2000-10-31 | 2000-10-31 | ２本鎖ｄｎａの分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002139491A true JP2002139491A (ja) | 2002-05-17 |
| JP4040834B2 JP4040834B2 (ja) | 2008-01-30 |
Family
ID=18808479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000332249A Expired - Fee Related JP4040834B2 (ja) | 2000-10-25 | 2000-10-31 | ２本鎖ｄｎａの分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4040834B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005103695A1 (ja) * | 2004-04-23 | 2005-11-03 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置 |
| JP2008527334A (ja) * | 2004-12-30 | 2008-07-24 | コーニング インコーポレイテッド | 非精製検体のラベルフリー検出 |
-
2000
- 2000-10-31 JP JP2000332249A patent/JP4040834B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005103695A1 (ja) * | 2004-04-23 | 2005-11-03 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置 |
| JPWO2005103695A1 (ja) * | 2004-04-23 | 2008-03-13 | 松下電器産業株式会社 | 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置 |
| JP2008527334A (ja) * | 2004-12-30 | 2008-07-24 | コーニング インコーポレイテッド | 非精製検体のラベルフリー検出 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4040834B2 (ja) | 2008-01-30 |
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