JP2002125700A

JP2002125700A - 二本鎖ｄｎａの分析方法

Info

Publication number: JP2002125700A
Application number: JP2000325136A
Authority: JP
Inventors: Yukio Sudo; 幸夫須藤
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2000-10-25
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2002-05-08

Abstract

(57)【要約】【課題】二本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分
析するための方法を提供すること。【解決手段】検体中の二本鎖ＤＮＡの分析方法であっ
て、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質
と該検体とを接触させる工程、及び、（２）該２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質と結合した二本鎖ＤＮＡを測定する工程、
を含む、上記の分析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、検体中に存在する
２本鎖核酸（特には、二本鎖ＤＮＡ）を分析する方法に
関し、検体中に存在する２本鎖核酸の存在量を定量する
方法にも関する。また、本発明は、遺伝子解析に応用さ
れた場合、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）
等の遺伝子多型の分析及び解析にも利用できる。また、
本発明は、検体中に存在するウイルス、菌体などに由来
する外来遺伝子群を検出する手法にも利用できる。

【０００２】

【従来の技術】標的となる核酸試料、または標的核酸試
料と相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ断片で
ある核酸プローブのいずれか一方を固相に固定し、これ
との間でハイブリダイゼーション反応を行う方法は、１
９７５年にE.M.Southernにより開発され、いわゆるサザ
ンブロッティング法として多用されてきている(J.Mol.B
iol 98,503(1975))。サザンブロッティング法では、核
酸試料を電気泳動した後にニトロセルロースやナイロン
膜などに固定し、相補的な配列をもつ核酸プローブと接
触することになる。

【０００３】この方法とは逆に、核酸プローブを固定化
し、標的核酸と接触させることにより、標的核酸量を測
定する方法も開発され、遺伝子解析や、遺伝子診断等に
利用されてきている。また、Southern等は多数の核酸プ
ローブをアレイ状に支持体に固定化したＤＮＡアレイを
開発し、ガラス支持体上のＤＮＡがその相補的なＤＮＡ
と結合することを実証した。また、Affymax社は、South
ernの考え方と、Photoresist法によるＤＮＡ固相合成技
術の組み合わせによりＤＮＡアレイの高密度化技術の開
発に成功し、GeneChipの形で商品化されるに至っている
(S. Fodor; Science 277, 393(1997)、Nature Genetics
Supplement 21,20(1999))。

【０００４】このように、ハイブリダイゼーションを用
いるＤＮＡの検出方法は、大きく進歩してきている。し
かしながら、上記した分析方法は、ｍＲＮＡ等の１本鎖
核酸の検出には極めて有効であるものの、２本鎖核酸を
検出するためには、ハイブリダイゼーション前に検体中
の２本鎖核酸を熱変性し、１本鎖にするという煩雑な操
作が必要となる。

【０００５】例えば、分析の対象がゲノム中のＤＮＡで
ある場合、対象ＤＮＡは２本鎖を形成している。例え
ば、P.N.Gillies等は電気アドレス法で(Nature Biotech
nology,17,365(1999))、また、R.J.Cho等は高密度オリ
ゴＤＮＡアレイにより(Nature Genetics 23,203(199
9))、ＳＮＰの検出を行っている。しかし、いずれの場
合も、ＤＮＡの測定のためには、検体中の標的ＤＮＡ部
分をＰＣＲで増幅したのち、熱変性により１本鎖に変性
するという煩雑な操作を行う必要がある。

【０００６】一方、２本鎖ＤＮＡを検出する方法とし
て、インターカレーターが知られている。特許第２５７
３４４３号公報には、インターカレーターを用いるＤＮ
Ａの検出方法が開示されているが、この方法でも、固定
化されたＤＮＡと反応させるために２本鎖ＤＮＡを予め
１本鎖に変性する必要があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即
ち、本発明は、二本鎖ＤＮＡを変性することなくそのま
ま分析するための方法を提供することを解決すべき課題
とした。本発明はまた、簡便かつ高感度な２本鎖ＤＮＡ
の分析方法を提供することを解決すべき課題とした。さ
らに本発明は、短時間かつ高感度で、ある遺伝子および
その多型を検出する目的に利用できる二本鎖ＤＮＡの分
析方法を提供することを解決すべき課題とした。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、支持体上に固定され
た２本鎖ＤＮＡ認識物質に検体を接触させ、該２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質と結合した二本鎖ＤＮＡを測定することに
より、二本鎖ＤＮＡを変性することなくそのまま分析す
ることが可能になることを見出した。さらに本発明者ら
は、２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した二本鎖ＤＮＡの量
は、ＤＮＡインターカレーターのような２本鎖挿入剤を
用いることにより、高感度で検出することができること
を見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成した
ものである。

【０００９】本発明によれば、検体中の二本鎖ＤＮＡの
分析方法であって、（１）支持体上に固定された２本鎖
ＤＮＡ認識物質と該検体とを接触させる工程、及び、
（２）該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した二本鎖ＤＮＡ
を測定する工程、を含む、上記の分析方法が提供され
る。好ましくは、２本鎖ＤＮＡ認識物質は二本鎖ＤＮＡ
認識抗体、ＤＮＡ転写因子、Ｚｎフィンガーモチーフ又
はリングフィンガーモチーフを有するタンパク質、ある
いはペプチド核酸である。

【００１０】好ましくは、該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結
合した二本鎖ＤＮＡを測定する工程においては、反応系
にＤＮＡ２本鎖を認識する挿入剤を添加し、該２本鎖Ｄ
ＮＡに挿入された挿入剤を検出することにより、該検体
中の該二本鎖ＤＮＡが測定される。好ましくは、該挿入
剤はＤＮＡインターカレーターである。好ましくは、該
ＤＮＡインターカレーターは電気化学的活性を有し、該
ＤＮＡインターカレーターを電気化学的手法により検出
することにより、該検体中の該二本鎖ＤＮＡが測定され
る。好ましくは、ＤＮＡインターカレーターを、蛍光
法、発光法または表面プラズモン法により検出する。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。本発明による検体中の二本鎖ＤＮＡ
の分析方法は、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮ
Ａ認識物質と該検体とを接触させる工程、及び、（２）
該２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した二本鎖ＤＮＡを測定
する工程、を含むことを特徴とする。

【００１２】本明細書で言う「検体」の種類は二本鎖Ｄ
ＮＡを含むものであればその種類は特に制限されず、例
えば、末梢静脈血のような血液、白血球、血清、尿、糞
便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織
細胞、その他核酸を含有する任意の試料を用いることが
できる。検体は上記のような組織細胞などの試料をその
まま使用してもよいが、好ましくは、検体試料中の細胞
を破壊して二本鎖ＤＮＡを遊離させたものを検体として
使用する。検体試料中の細胞の破壊は、常法により行う
ことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を
外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液
（例えば、ＳＤＳ、Triton-X、Tween-20等の界面活性
剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶
液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもでき
る。核酸抽出溶液を用いて核酸を溶出する場合には、37
℃以上の温度でインキュベ−トすることにより反応を促
進することができる。

【００１３】本発明では、支持体上に固定された２本鎖
ＤＮＡ認識物質を使用する。本発明で用いる支持体とし
ては、以下に説明する２本鎖ＤＮＡ認識物質を固定でき
るものであれば特に制限されない。好ましい支持体の例
としては、ガラス、石英、プラスチック等の非多孔性支
持体、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜な
どの多孔性支持体などが挙げられ、あるいは非多孔性支
持体と多孔性支持体の複合体を使用することもできる。

【００１４】本発明で用いる２本鎖ＤＮＡ認識物質とし
ては、二本鎖ＤＮＡを認識し、特異的に結合する物質を
示す。２本鎖ＤＮＡ認識物質の具体例としては、ＤＮＡ
転写因子、ミスマッチ修復タンパク質、２本鎖ＤＮＡ認
識抗体、又はペプチド核酸などを挙げることができる。

【００１５】ＤＮＡ転写因子は、遺伝子上のプロモータ
ー領域に結合して、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を制御
する物質である（田村隆明著：転写因子（羊土社１９
９５年））。従って、転写因子は特定の配列の２本鎖Ｄ
ＮＡに特異的に結合することが知られている。

【００１６】多数ある転写因子のうち、Zinc Finger Pr
oteinつまりZinc FingerやRing Fingerモチーフをもつ
転写因子群は、真核生物における出現率は非常に高く、
ゲノム中の１％はこれをコードしているらしい。Pabo等
はZinc Figerモチーフの３次構造を解析、ＤＮＡと結合
するメカニズムの解明した（Science,252, 809(199
1)）。さらに、Choo等は、遺伝子組換法により、特定の
配列に結合する自然界にはないZinc Finger Protein群
を作製することに成功している(Nature 372,642[1994],
PNAS91,11163(1994))。さらに、Scripps Research Inst
ituteのグループはPhage Displayにより新規なZinc Fin
ger Protein群の作製に成功している（PNAS95,2812,[19
98]：96,2758(1999)）。このように、Zinc Finger Prot
einに代表されるＤＮＡ転写因子群は、本来２本鎖ＤＮ
Ａと結合する性質をもっており、かつ近年の研究によれ
ば、任意のＤＮＡ配列を認識する組換体の作製も可能と
なってきている。このような、タンパク質を固定化する
ことにより、２本鎖ＤＮＡを効率良く支持体上に捕捉す
ることが可能である。

【００１７】ミスマッチ修復タンパク質とは、ＤＮＡ二
本鎖の間に生じた不適正塩基対（不正またはミス対合）
の修復を行う酵素である。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼの場合、１０⁸塩基対に１箇所程度の頻度で鋳型
ＤＮＡの塩基と対を成さないヌクレオチドを取り込む
が、ミスマッチ修復酵素によりこれが修復される。ミス
マッチ修復酵素は細胞内で複製直後のＤＮＡに結合し
て、ミスマッチ塩基対を含む部分のヌクレオチドを除去
する。本発明ではミスマッチ修復タンパク質が二本鎖Ｄ
ＮＡに結合する性質を利用することにより、該タンパク
質を２本鎖ＤＮＡ認識物質として使用することができ
る。

【００１８】２本鎖ＤＮＡを認識する抗体が、全身性エ
リトマトーデスの患者血清中に出現することは良く知ら
れている。抗体作製技術、遺伝子組換技術の進歩によ
り、このような２本鎖ＤＮＡ認識モノクローナル抗体の
作製が可能となってきている(Suzuki etal,Int J Mol M
ed 3,385,1999,Barry etal,J Biol Chem 269,3623(199
4))。このような、２本鎖ＤＮＡ認識抗体は、本発明の
２本鎖ＤＮＡ認識タンパク質として使用することができ
る。

【００１９】ペプチド核酸は、ＤＮＡの骨格構造である
糖、リン酸部分をポリアミド骨格で置き換えたもので、
ＤＮＡとの結合力が強いことで知られている。さらに、
ペプチド核酸は、ＤＮＡ−ＤＮＡ鎖内に入りこみ３重鎖
を形成することが可能である。本発明ではペプチド核酸
のこの性質を利用することにより、ペプチド核酸を２本
鎖ＤＮＡ認識物質として使用することができる。

【００２０】上記した２本鎖ＤＮＡ認識物質は、そのま
ま支持体上に固定化することができる。具体的には、２
本鎖ＤＮＡ認識物質を含む溶液を支持体上に点着し、一
定時間放置することにより、２本鎖ＤＮＡ認識物質を支
持体上に固定化することができる。

【００２１】検体中の標的ＤＮＡは、ＰＣＲ法などで増
幅することなく直接検出するのが好ましいが、予め増幅
したのちに検出してもよい。標的ＤＮＡまたはその増幅
体は、予め標識しておくことにより容易に検出可能であ
る。ＤＮＡを標識するには、酵素(Reverse Transcripta
se,DNApolymerase RNAPolymerase,Terminaldeoxytransf
eraseなど)を用いる方法がよく用いられるが、化学反応
により、直接標識物質を結合させてもよい。このような
標識方法については、公知の技術として成書に記載され
ている（野村慎太郎著脱アイソトープ実験プロトコー
ル１、秀潤社１９９４年、脱アイソトープ実験プロトコ
ール２、秀潤社１９９８年、村松正明著ＤＮＡマイク
ロアレイと最新ＰＣＲ法標識物質秀潤社２０００
年）。標識物質は、検出可能なシグナルを作ることの可
能な物質であることが好ましい。標識物質が、酵素や触
媒のような、シグナルの増幅能力のある物質である場
合、ＤＮＡの検出感度は大きく向上する。該標識物質は
また、ビオチン−アビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗
体のような特異結合対の片方であって、その結合相手を
介して標識物質を標的ＤＮＡに結合させてもよい。

【００２２】しかしながら、前述の標識操作は、一般的
に煩雑であるので、さらに好ましい検出方法としては、
検体中のＤＮＡを予め標識せずに測定する方法を挙げる
ことができる。これには、例えば２本鎖ＤＮＡを認識す
るＤＮＡ挿入剤、いわゆるＤＮＡインターカレーターを
用いることができる。ＤＮＡインターカレーターの使用
により、検出操作が簡単になるだけではなく、検出感度
も向上する。例えば、１０００ｂｐのＤＮＡを検出する
場合、いわゆる標識法は多くとも数個の標識物質しか導
入できないのであるが、インターカレーターを使用する
場合は１００個以上の標識物質を導入することが可能で
ある。

【００２３】ＤＮＡインターカレーターは、そのもの自
体が検出可能なシグナルを形成できる物質であってもよ
いが、その側鎖にシグナル形成物質を結合していたり、
ビオチン−アビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗体のよ
うな特異結合対を介してインターカレーターに結合して
いてもよい。本発明における、検出可能なシグナルは、
例えば、蛍光検出、発光検出、化学発光検出、生物発光
検出、電気化学発光検出、放射能検出、電気化学検出、
比色検出により検出可能なシグナルであることが好まし
いが、これらに限定されるものではない。

【００２４】好ましいＤＮＡインターカレーターの例と
して、蛍光性色素のようにインターカレーター自身がシ
グナル形成能力をもっていてもよいが、インターカレー
ターとシグナル形成物質との複合体であってもよい。イ
ンターカレーターとシグナル形成物質との複合体は、例
えば、下記一般式（１）、（２）のようなものをあげる
ことができる一般式（１）Ｘ−Ｌ１−Ｉ−Ｌ２−Ｙ一般式（２）Ｘ−Ｌ１−Ｉ（一般式（１）、（２）において、Ｉは２本鎖ＤＮＡに
挿入される物質を示し、Ｌ１，Ｌ２はリンカー配列を示
し、Ｘ及びＹは、検出可能な分子を示す。）

【００２５】一般式（１）及び（２）においてＩで示さ
れる２本鎖ＤＮＡに挿入される物質は、好ましくは、分
子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が
二本鎖ＤＮＡの塩基対と塩基対の間に介入することによ
って、二本鎖ＤＮＡと結合することができる物質を言
う。

【００２６】一般式（１）及び（２）においてＬ１，Ｌ
２で示されるリンカー配列は特に限定されず、例えば、
アルキレン基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基又は
これらの組み合わせから成る基などを例示することがで
きる。

【００２７】一般式（１）及び（２）においてＸ，Ｙが
示す検出可能な分子の具体例としては、Fluorescein、R
hodamin、Cy5、Cy3、Texas Red、ルテニウム錯体等に代
表される蛍光色素団、ビオチン−アビジン、抗原−抗
体、ハプテン−抗体のような特異結合対を形成する物
質、フェロセン誘導体に代表される電気化学的検出可能
な物質、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体のような
発光性の物質、またいわゆるＥＩＡ（酵素免疫測定法）
で使用しているような酵素等を挙げることができる。

【００２８】Ｘ，Ｙが特異結合対を形成する物質である
場合、Ｘ，Ｙを介してFluorescein、Rhodamin、Cy5、Cy
3、Texas Red、ルテニウム錯体等に代表される蛍光色素
団、フェロセン誘導体に代表される電気化学的検出可能
な物質、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体のような
発光性の物質、またいわゆるＥＩＡ（酵素免疫測定法）
で使用しているような酵素等を結合させることができ
る。

【００２９】本発明で用いる電気化学的、光化学的に活
性な挿入剤は特に限定されるものではなく、例えばエチ
ジウム、エチジウムブロマイド、アクリジン、アミノア
クリジン、アクリジンオレンジ、ビスベンチミド、ジア
ミノフェニルインドール、プロフラビン、エリブチシ
ン、アクチノマイシンＤ、チアゾール、クロモマイシ
ン、ドーノマイシン、マイトマイシンＣ、並びにこれら
の誘導体等を用いることができる。また、その他の使用
可能な挿入剤としては、特開昭62-282599 号公報に記載
されたものが挙げられる。さらに本発明で用いることが
できる挿入剤の具体例を示す。

【００３０】

【化１】

【００３１】本発明の好ましい実施態様としては、２本
鎖ＤＮＡと結合する物質を固定化したスライドを作成
し、該スライドと検体を反応させる手法が挙げられる。
このとき、２本鎖遺伝子挿入剤は、検体である２本鎖Ｄ
ＮＡがスライド上の２本鎖ＤＮＡと結合する物質と反応
した後に添加してもよいし、同時に加えてもよい。以下
の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本
発明は実施例によって限定されることはない。

【００３２】

【実施例】（１）抗体の固定化２本鎖認識抗体を含むＰＢＳ溶液（フナコシ社製、１μ
ｇ／ｍｌ）１μｌをスライドガラス（３ＤＬＩＮＫ：Th
ermodics社製）に点着し、１２時間放置した。さらにこ
のスライドガラスを、０．５ＭのGlycineホウ酸に３０
分間浸漬したのちＰＢＳにより洗浄した。

【００３３】（２）サンプルの調製 Human alpha 2-HS-glycoprotein（HSGP）の翻訳領域
（ＯＲＦ）をpBluescriptIISK-のマルチクローニングサ
イトのNotI、XhoIサイト間にクローニングした。このベ
クターを鋳型にして、HSGP cDNAをＰＣＲ法により増幅
した。

【００３４】（３）反応ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡをＴＥに溶解し、０．１μＭ
溶液を調製し、これをサンプルＡとした。サンプルＡを
９５℃で３分間煮沸後、氷浴で急冷し一本鎖サンプルＢ
を調整した。サンプルＡ及びサンプルＢを各々１０μｌ
ずつ上記の（１）で作製した抗体固定化スライド上のス
ポット部分に点着し、1時間放置後、ＴＥ溶液により洗
浄した。さらに、このスライドをSybrGreen溶液（Molec
ular Probe社、１０００倍希釈ＴＥ溶液）に２０分間浸
漬したのち、ＴＥにより洗浄した。洗浄済みスライドガ
ラスを風乾後、ＦＬＡ２０００（富士写真フイルム株式
会社製）により６３３ｎｍ励起による蛍光強度を測定し
た。結果を以下に示す。

【００３５】（ＬＡＵは蛍光強度に比例する単位）

【００３６】上記結果より、本発明の方法により、二本
鎖ＤＮＡを検出できることが示された。

【００３７】

【発明の効果】本発明により二本鎖ＤＮＡを変性するこ
となくそのまま分析することが可能になった。また本発
明の方法によれば、簡便かつ高感度に２本鎖ＤＮＡを分
析することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/566 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３８６ＧＦターム(参考） 2G043 AA01 AA06 BA16 DA02 EA01 KA02 2G059 AA00 EE02 4B024 AA11 AA20 CA01 CA04 CA09 HA11 HA15 HA19 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ42 QR32 QR48 QR51 QR55 QR66 QR84 QS25 QS32 QS33 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体中の二本鎖ＤＮＡの分析方法であっ
て、（１）支持体上に固定された２本鎖ＤＮＡ認識物質
と該検体とを接触させる工程、及び、（２）該２本鎖Ｄ
ＮＡ認識物質と結合した二本鎖ＤＮＡを測定する工程、
を含む、上記の分析方法。
【請求項２】２本鎖ＤＮＡ認識物質が二本鎖ＤＮＡ認
識抗体である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】２本鎖ＤＮＡ認識物質がＤＮＡ転写因子
である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】２本鎖ＤＮＡ認識物質がＺｎフィンガー
モチーフまたはリングフィンガーモチーフをもつタンパ
ク質である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項５】２本鎖ＤＮＡ認識物質がペプチド核酸で
ある、請求項１に記載の分析方法。
【請求項６】２本鎖ＤＮＡ認識物質と結合した二本鎖
ＤＮＡを測定する工程において、反応系にＤＮＡ２本鎖
を認識する挿入剤を添加し、該２本鎖ＤＮＡに挿入され
た挿入剤を検出することにより、該検体中の該二本鎖Ｄ
ＮＡを測定することを特徴とする、請求項１から５の何
れかに記載の分析方法。
【請求項７】該挿入剤がＤＮＡインターカレーターで
ある、請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】該ＤＮＡインターカレーターが電気化学
的活性を有し、該ＤＮＡインターカレーターを電気化学
的手法により検出することにより、該検体中の該二本鎖
ＤＮＡを測定する、請求項７に記載の分析方法。
【請求項９】ＤＮＡインターカレーターを、蛍光法、
発光法または表面プラズモン法により検出する、請求項
７に記載の分析方法。