CN116773805A - 一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法 - Google Patents
一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116773805A CN116773805A CN202210249657.6A CN202210249657A CN116773805A CN 116773805 A CN116773805 A CN 116773805A CN 202210249657 A CN202210249657 A CN 202210249657A CN 116773805 A CN116773805 A CN 116773805A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- sequence
- cell membrane
- damage
- membrane damage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 154
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 142
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 133
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 37
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 118
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 60
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 60
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 59
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 32
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 11
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 abstract description 10
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 8
- 238000009509 drug development Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 4
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012174 single-cell RNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法。本发明提供的试剂盒，生物素标记的Annexin V或其类似物通过亲和素与生物素标记的细胞膜损伤指示序列连接，将其用于检测待测细胞的损伤程度时，连接有细胞膜损伤指示序列的膜联蛋白Annexin V通过磷脂酰丝氨酸连接在待测细胞的细胞膜表面，从而使每个待测细胞带有不同数量的细胞膜损伤指示序列，得到待测液；将待测液进行单细胞测序，能在获得单个待测细胞转录组的同时，检测出该待测细胞实时的损伤程度；将待测液加入荧光定量PCR反应体系进行测量，可以在大量细胞的层面上反应细胞损伤程度。因此，本发明提供的试剂盒，对药物开发、病理检测和发育过程中的研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒技术领域，特别涉及一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法。
背景技术
对细胞损伤程度的鉴定在组织发育研究、肿瘤药物开发等方面有着广泛的应用。检测细胞损伤程度常用的方法包括对细胞膜损伤的检测，对细胞核形态和基因组DNA破碎的检测，对线粒体膜电位的检测以及对生化分子标签的检测等。
对细胞损伤和死亡程度的检测在药物开发、病理检测和发育过程中细胞凋亡的检测等方面有着重要的应用。在药物开发方面，对于组成复杂、细胞异质性较强的肿瘤细胞，在单细胞的层面上灵敏地检测细胞对药物处理的反应，结合其单细胞转录组的状态解析药物的作用机制，对药物的机理探寻和靶点鉴定有着重要意义。在发育生物学研究中，在单细胞层面上反映细胞发育过程中自发的凋亡和损伤过程，对阐明器官发育的分子机理有着重要的作用。
目前常用的细胞损伤程度检测方法主要依赖荧光显微成像，无法在单细胞层面检测细胞的损伤程度、也无法在鉴定细胞损伤程度的同时高通量地获得单细胞层面的转录组信息。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法，旨在提供一种能在单细胞层面检测细胞损伤程度、且能高通量地获得单细胞层面的转录组信息的试剂盒。
为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种试剂盒，所述试剂盒包括：第一试剂，包括生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列，所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列；
第二试剂，包括标记物标记的第一物质，所述标记物包括生物素或其类似物，所述第一物质包括Annexin V或其类似物；以及，
第三试剂，包括亲和素或其类似物。
第二方面，本发明还提出一种试剂盒，所述试剂盒包括：
试剂R1，包括生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列，所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列；
试剂R2，包括第一物质与第二物质的融合蛋白，所述第一物质包括Annexin V或其类似物，所述第二物质包括亲和素或其类似物。
第三方面，本发明还提出一种试剂盒，所述试剂盒包括细胞膜损伤指示复合物，所述细胞膜损伤指示复合物包括依次连接的标记物标记的第一物质、第二物质、以及生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列；
其中，所述标记物包括生物素或其类似物，所述第一物质包括Annexin V或其类似物，所述第二物质包括亲和素或其类似物；
所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列。
可选的，所述生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列中，所述细胞膜损伤指示序列还包括第一引物结合序列，所述第一引物结合序列一端与所述生物素或其类似物连接，另一端与所述条形码核苷酸序列连接。
可选的，所述细胞膜损伤指示序列还包括第二引物结合序列和多聚腺苷酸尾序列，所述细胞膜损伤指示序列包括依次连接的第一引物结合序列、条形码核苷酸序列、多聚腺苷酸尾序列和第二引物结合序列。
可选的，所述亲和素包括链霉亲和素。
基于上述目的，本发明还提出一种细胞损伤程度的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S10、提供一试剂盒，所述试剂盒包括：第一试剂，包括生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列，所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列；第二试剂，包括生物素或其类似物标记的Annexin V或其类似物；以及，第三试剂，包括亲和素或其类似物。；
S20、将标记物标记的第一物质、亲和素或其类似物、生物素标记的细胞膜损伤指示序列混匀后进行孵育，得到混合物，将所述混合物进行纯化处理，得到纯化后的细胞膜损伤指示复合物，所述标记物包括生物素或其类似物，所述第一物质包括Annexin V或其类似物；
S30、将所述纯化后的细胞膜损伤指示复合物与待测细胞孵育后，清洗所述待测细胞，得到标记细胞；
S40、将所述标记细胞重悬后，测试所述标记细胞上结合的细胞膜损伤指示序列的数量，得到细胞膜的损伤程度。
可选的，步骤S40包括：
将所述标记细胞进行单细胞测序，根据测序结果得到单个细胞上所结合的细胞膜损伤指示序列数量，从而得到单个细胞的细胞损伤程度。
可选的，步骤S40包括：
将所述标记细胞重悬，然后加入荧光定量PCR反应体系进行测量，根据测量得到的荧光信号计算出每个细胞上结合的细胞膜损伤指示序列的数量，从而得到细胞损伤程度。
本发明提供的试剂盒，生物素标记的Annexin V或其类似物通过亲和素与生物素标记的细胞膜损伤指示序列连接，而生物素标记的膜联蛋白Annexin V可以特异性地结合细胞死亡时暴露在细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸，如此，连接有细胞膜损伤指示序列的膜联蛋白Annexin V或其类似物通过磷脂酰丝氨酸连接在待测细胞的细胞膜表面，从而使每个待测细胞带有不同数量的细胞膜损伤指示序列，得到待测液；将待测液进行单细胞测序，能在获得单个待测细胞转录组的同时，检测出该待测细胞实时的损伤程度；此外，将待测液加入荧光定量PCR反应体系进行测量，可以在大量细胞的层面上反应细胞损伤程度。因此，本发明提供的试剂盒，对药物开发、病理检测和发育过程中的研究具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明一实施例中的生物素标记的细胞膜损伤指示序列示意图；
图2为本发明一实施例中的标记细胞的部分结构示意图；
图3为本发明实施例3中的细胞膜损伤指示复合物标记经不同浓度的肿瘤化疗药物拓补替康处理后的MCF7细胞的实验结果图；
图4为本发明实施例4中的细胞膜损伤指示复合物标记经不同浓度的肿瘤化疗药物拓补替康处理后的MCF7细胞的单细胞RNA测序实验结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前常用的细胞损伤程度检测方法主要依赖荧光显微成像，无法在单细胞层面检测细胞的损伤程度、也无法在鉴定细胞损伤程度的同时高通量地获得单细胞层面的转录组信息。
鉴于此，本发明提出一种试剂盒，旨在提供一种能在单细胞层面检测细胞损伤程度、且能高通量地获得单细胞层面的转录组信息的试剂盒。
在第一实施例中，所述试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂，所述第一试剂包括生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列，所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列；所述第二试剂包括标记物标记的第一物质，所述标记物包括生物素或其类似物，所述第一物质包括Annexin V或其类似物；所述第三试剂包括亲和素或其类似物。
细胞膜损伤是细胞死亡(包括凋亡、坏死等)的特征之一，因而我们可以通过检测细胞膜损伤程度，从而间接检测细胞损伤和死亡程度。正常细胞中，磷酯酰丝氨酸(PS)位于细胞脂质双层膜的内侧，当细胞死亡发生时，磷酯酰丝氨酸会翻转到细胞膜外侧。膜联蛋白Annexin V可以特异性地结合磷脂酰丝氨酸，该特性使其可以作为细胞死亡程度的指示信号。
单细胞测序技术极大地推进了系统生物学领域的研究，对转录组进行高通量、单细胞层面的解析揭示了众多细胞类型并精细地区分了其中的细微差别。单细胞测序技术为药物研发和靶点探究的系统生物学研究提供了强大的工具。
本发明提供的试剂盒，生物素(或其类似物)标记的Annexin V或其类似物通过亲和素与生物素(或其类似物)标记的细胞膜损伤指示序列连接，而生物素(或其类似物)标记的膜联蛋白Annexin V可以特异性地结合细胞死亡时暴露在细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸，如此，连接有细胞膜损伤指示序列的膜联蛋白Annexin V或其类似物通过磷脂酰丝氨酸连接在待测细胞的细胞膜表面，从而使每个待测细胞带有不同数量的细胞膜损伤指示序列，得到待测液；将待测液进行单细胞测序，从而可以在获得单个待测细胞转录组的同时，检测出该待测细胞实时的损伤程度；此外，将待测液加入荧光定量PCR反应体系进行测量，可以在大量细胞的层面上反应细胞损伤程度。因此，本发明提供的试剂盒，对药物开发、病理检测和发育过程中的研究具有重要意义。
具体的，本发明提供的试剂盒，在发现并验证细胞在因药物处理、放射治疗、病理发生过程、组织器官发育过程等各种原因所致细胞损伤和死亡的过程中起到关键作用的基因具有重要意义。
可以理解的是，完好的细胞携带的细胞膜损伤指示序列数量较低，而在死亡过程中的细胞携带的细胞膜损伤指示序列数量会逐渐升高。此外，在进行单细胞测序前，需要对试剂盒进行预处理，使生物素(或其类似物)标记的Annexin V或其类似物通过亲和素(或其类似物)与生物素(或其类似物)标记的细胞膜损伤指示序列连接，得到细胞膜损伤指示复合物。
在第二实施例中，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列，所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列；所述试剂R2包括第一物质与第二物质的融合蛋白，所述第一物质包括Annexin V或其类似物，所述第二物质包括亲和素或其类似物。
与第一实施例不同的是，本实施例的试剂盒中将Annexin V(或其类似物)与亲和素(或其类似物)进行融合表达，如此，Annexin V或其类似物不需要生物素标记，就可以与亲和素或其类似物连接，且得到的融合蛋白可以通过亲和素(或其类似物)与生物素(或其类似物)标记的细胞膜损伤指示序列连接。
可以理解的是，本实施例提供的试剂盒与第一实施例提供的试剂盒的原理类似，也是将连接有细胞膜损伤指示序列的膜联蛋白Annexin V或其类似物通过磷脂酰丝氨酸连接在待测细胞的细胞膜表面，然后进行单细胞测序，在此不做赘述。
在第三实施例中，所述试剂盒包括细胞膜损伤指示复合物，所述细胞膜损伤指示复合物包括依次连接的标记物标记的第一物质、第二物质、以及生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列；其中，所述标记物包括生物素或其类似物，所述第一物质包括Annexin V或其类似物，所述第二物质包括亲和素或其类似物；所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列。
与第一和第二实施例不同的是，本实施例中试剂盒中的试剂为一个复合物，该复合物的制备方法包括：将亲和素或其类似物、生物素或其类似物标记的Annexin V、生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列进行孵育。
可以理解的是，本实施例提供的试剂盒与第一实施例提供的试剂盒的原理类似，也是将连接有细胞膜损伤指示序列的膜联蛋白Annexin V或其类似物通过磷脂酰丝氨酸连接在待测细胞的细胞膜表面，然后进行单细胞测序，在此不做赘述。
请参阅图1，所述细胞膜损伤指示序列的实质为一个核酸标签。其中，所述条形码核苷酸序列每个位置可以为A、T、C、G任一的碱基，通过碱基的排列可以得到特异的条形码核苷酸序列，条形码核苷酸序列为样本中细胞膜损伤指示序列的特征序列，其长度和序列可以自定设计，优选为8-10个碱基长度，条形码核苷酸序列太短会造成特异性的不足从而无法在单细胞测序中精准识别，太长则会造成不必要的浪费。在一实施例中，所述条形码核苷酸序列的核苷酸序列为GGTTTACT。
在上述实施例的基础上，所述生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列中，所述细胞膜损伤指示序列还包括第一引物结合序列，所述第一引物结合序列一端与所述生物素或其类似物连接，另一端与所述条形码核苷酸序列连接。
所述第一引物结合序列用于后续对细胞膜损伤指示序列进行PCR扩增，长度一般在16-28个碱基之间，第一引物结合序列设计需要遵循引物设计原则。本发明不限制所述第一引物结合序列的具体核苷酸序列，在一实施例中，所述第一引物结合序列的核苷酸序列为GAGGACGCTATGCCTGTACC。
具体地，所述细胞膜损伤指示序列与单细胞测序中的细胞标签进行连接，细胞标签分别连接细胞内的RNA和细胞膜损伤指示序列，并分别进行建库测序。在得到各个文库的测序结果后，可以通过细胞标签序列将细胞內源mRNA测序结果和细胞膜损伤指示序列的定量结果相对应，从而定量得到每个单细胞的细胞损伤程度。
进一步地，所述细胞膜损伤指示序列还包括第二引物结合序列和多聚腺苷酸尾序列，所述细胞膜损伤指示序列包括依次连接的第一引物结合序列、条形码核苷酸序列、多聚腺苷酸尾序列和第二引物结合序列。
单细胞mRNA测序中的细胞标签带有一段多聚胸苷酸序列(即多聚T)，通过在细胞膜损伤指示序列上设计多聚腺苷酸尾(即多聚A尾)序列，使进行单细胞mRNA测序时，该细胞膜损伤指示序列可以和细胞标签序列结合，从而分别对带有细胞标签的测序物质和带有细胞标签的细胞膜损伤指示序列进行测序，根据相同的细胞标签得知测序物质对应细胞的损伤程度。
在本实施例中，所述第二引物结合序列同样需要遵循引物设计原则，该第二引物结合序列用于后续与单细胞测序中的细胞标签通过碱基互补配对进行连接，在单细胞测序的过程中，细胞标签分别连接细胞内的RNA和细胞膜损伤指示序列，并分别进行建库测序。在得到各个文库的测序结果后，可以通过细胞标签序列将细胞內源RNA测序结果和细胞膜损伤指示序列的定量结果相对应，从而定量得到每个单细胞的细胞损伤程度。
根据建库试剂盒选择的不同，单细胞测序有多种不同的建库方法，第二引物结合序列要根据不同的建库方法而相应地改变序列，因此，对于第二引物结合序列的具体序列，本发明不做限制，可根据单细胞测序的建库方法，而设计相应的第二引物结合序列。在本实施例中，所述第二引物结合序列的核苷酸序列为：CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC。
进一步地，所述第一引物结合序列与条形码核苷酸序列之间、以及第二引物结合序列与多聚腺苷酸尾序列之间还可以包括用于增加细胞膜损伤指示序列长度的随机序列，这样可以增加后续单细胞测序中细胞膜损伤指示序列的回收效率。
在一实施例中，所述细胞膜损伤指示序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其中，序列中的GAGGACGCTATGCCTGTACC是第一引物结合序列；序列中的GGTTTACT是条形码核苷酸序列；序列中的B(简并碱基符号)是一个单独的碱基，代表C或T或G；序列中的AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA是多聚腺苷酸尾序列；序列中的CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC是第二引物结合序列。
其中，每个亲和素分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。优选地，所述亲和素为链霉亲和素，链霉亲和素与生物素的结合特异性更高。请参阅图2，链霉亲和素是四聚体蛋白，大小为66KDa。一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极强，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10mol/L数量级，链霉亲和素的分子式为C14H17BrClNO2S，具有以下结构式(Ⅰ)所示的结构：
膜联蛋白Annexin V分子量约为36kDa，可以特异性地与细胞膜损伤过程中暴露在表面磷脂酰丝氨酸分子相结合。细胞死亡的过程中通常伴随着细胞膜的损伤，而伴随着细胞死亡进程的推进，细胞膜的损伤程度也会越加严重，从而结合更多的Annexin V蛋白。因而Annexin V可用于反应细胞死亡的程度。
较优地，所述生物素标记的Annexin V或其类似物、所述链霉亲和素或其类似物与所述生物素标记的细胞膜损伤指示序列的摩尔比为1:1:4。当然，也可以为其他比值，只要不影响该复合物的功能即可。
需要说明的是，本发明不限制所述生物素或其类似物中的类似物的具体结构，只要该类似物能与亲和素连接即可。同理，对于所述亲和素或其类似物中的类似物的具体结构，本发明也不做限制，只要该类似物能与生物素或其类似物连接即可。此外，对于AnnexinV或其类似物中的类似物的具体结构，本发明也不做限制，只要该类似物能与磷脂酰丝氨酸连接即可。
本发明还提出一种细胞损伤程度的检测方法，在一实施例中，所述检测方法包括以下步骤：
步骤S10、提供第一实施例所述的试剂盒。
所述试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂，所述第一试剂包括生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列，所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列；所述第二试剂包括生物素或其类似物标记的Annexin V或其类似物；所述第三试剂包括亲和素或其类似物。
步骤S20、将标记物标记的第一物质、亲和素或其类似物、生物素标记的细胞膜损伤指示序列混匀后进行孵育，得到混合物，将所述混合物进行纯化处理，得到纯化后的细胞膜损伤指示复合物，所述标记物包括生物素或其类似物，所述第一物质包括Annexin V或其类似物。
具体地，将亲和素或其类似物、生物素标记的Annexin V溶解于50％的甘油中，生物素标记的细胞膜损伤指示序列溶解于双蒸水中，先分别配置合适的浓度，再进行孵育，得到混合物。在本实施例中，孵育条件为室温孵育10分钟。
其中，所述纯化处理步骤包括：将混合物加入300μL的PBS(磷酸盐缓冲液)，加入购于Millipore的超滤纯化管(置于收集管内)，在4℃以14000g离心4分钟，弃收集管中的滤液，加入300μL PBS，重复此过程8次；更换收集管，倒置纯化管于收集管内，在4℃以3000g离心2分钟，用PBS将收集管中液体补足至原体积(混合物的体积)，即为纯化后的细胞膜损伤指示复合物。
步骤S30、将所述纯化后的细胞膜损伤指示复合物与待测细胞孵育后，清洗所述待测细胞，得到标记细胞。
对待测细胞进行标记之后，使得待测细胞带有细胞膜损伤指示序列，从而在后续的单细胞测序中能够清楚的分辨出单细胞的损伤程度。其中，清洗所述待测细胞的步骤包括：用PBS洗细胞3次，以洗去多余的细胞膜损伤指示复合物。
步骤S40、将所述标记细胞重悬后，测试所述标记细胞上结合的细胞膜损伤指示序列的数量，得到细胞膜的损伤程度。
在一实施例中，步骤S40包括：将所述标记细胞进行单细胞测序，根据测序结果得到单个细胞上所结合的所述细胞膜损伤指示序列数量，从而得到单个细胞的细胞损伤程度。
本发明通过在单细胞RNA测序之前，使得样本中的细胞带有细胞膜损伤指示序列，从而在后续的单细胞RNA测序结果中能清晰地定量区别单个细胞的损伤程度。该检测方法操作简单方便，对细胞损伤的区分清晰，对在单细胞层面探寻药物的分子靶点等方面的研究有较大帮助。
在另一实施例中，步骤S40包括：将所述标记细胞重悬，然后加入荧光定量PCR反应体系进行测量，根据测量得到的荧光信号计算出每个细胞上细胞膜损伤指示序列的数量，从而得到细胞损伤程度。通过采用上述步骤，可以在大量细胞的层面上反应细胞损伤程度。
因此，本发明提供的试剂盒，不仅可以在大量细胞的层面上反应细胞损伤程度，还可以清晰地定量区别单个细胞的损伤程度，用户可根据需要而选择相应的检测步骤。
当然，本发明提供的细胞损伤程度的检测方法，也可以采用第二实施例或第三实施例所述的试剂盒，当采用第二实施例所述的试剂盒时，步骤S20进行适应性的调整；当采用第三实施例所述的试剂盒(即试剂盒包括细胞膜损伤指示复合物，所述细胞膜损伤指示复合物包括依次连接的生物素或其类似物标记的Annexin V、亲和素或其类似物、以及生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列)时，去除步骤S20。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1试剂盒
所述试剂盒包括：
第一试剂：生物素标记的细胞膜损伤指示序列(如图1所示)由苏州金唯智生物科技有限公司合成，所述细胞膜损伤指示序列包括依次连接的第一引物结合序列、条形码核苷酸序列、多聚腺苷酸尾序列和第二引物结合序列，其中，所述细胞膜损伤指示序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
第二试剂：生物素标记的Annexin V(厂家：Biolegend，货号640904)；以及，
第三试剂：链霉亲和素(厂家：北京酷来搏科技有限公司，货号CS10471)；
其中，所述生物素标记的Annexin V、所述链霉亲和素与所述生物素标记的细胞膜损伤指示序列的摩尔比为1:1:4。
实施例2在大量细胞层面检测细胞损伤程度
(1)提供实施例1所述的试剂盒；
(2)准备细胞：向贴壁培养的MCF7细胞中加入不同浓度的DNA拓补异构酶抑制剂拓补替康(Topotecan)，与不加药的对照组细胞一起培养24小时，得到待测细胞；
(3)细胞膜损伤指示复合物的制备：将1.4μM生物素标记的Annexin V、1.6μM链霉亲和素以及1μM细胞膜损伤指示序列以1:1:4的摩尔比进行混合，混匀后室温放置10分钟，得到混合物；将混合物加入300μL磷酸盐缓冲液PBS，加入购于Millipore的超滤纯化管(置于收集管内)，货号UFC510008，在4℃以14000g离心4分钟，弃收集管中的滤液，加入300μLPBS，重复此过程8次；更换收集管，倒置纯化管于收集管内，在4℃以3000g离心2分钟，用PBS将收集管中液体补足至原体积，即为纯化后的细胞膜损伤指示复合物；
(4)标记细胞：向加药培养的实验组与对照组细胞中加入纯化后的10nM细胞膜损伤指示复合物(以Annexin V计)，溶于Annexin V结合缓冲液中，在转台上室温孵育10分钟；用PBS洗细胞3次，以洗去多余的细胞膜损伤指示复合物，得到标记细胞；
(5)测量细胞上结合的细胞膜损伤指示序列数量：将标记后的细胞重悬，直接加入荧光定量PCR反应体系(每个反应加入100个细胞)进行测量，对照标准曲线计算出每个细胞上细胞膜损伤指示序列的数量。
检测结果如图3所示，由图3可以看出，每组细胞由于加药浓度的不同，导致细胞损伤的程度不同，并反应在平均每个细胞结合的细胞膜损伤指示序列数量上。用药浓度越高，细胞损伤程度越大，所结合的细胞膜损伤指示序列数量也越多。
实施例3在单细胞层面检测细胞损伤程度
(1)提供实施例1所述的试剂盒；
(2)准备细胞：向贴壁培养的MCF7细胞中加入不同浓度的DNA拓补异构酶抑制剂拓补替康(Topotecan)，与不加药的对照组细胞一起培养24小时，得到待测细胞；
(3)细胞膜损伤指示复合物的制备：将1.4μM生物素标记的Annexin V、1.6μM链霉亲和素以及1μM细胞膜损伤指示序列以1:1:4的摩尔比进行混合，混匀后室温放置10分钟，得到混合物；将混合物加入300μL磷酸盐缓冲液PBS，加入购于Millipore的超滤纯化管(置于收集管内)，货号UFC510008，在4℃以14000g离心4分钟，弃收集管中的滤液，加入300μLPBS，重复此过程8次；更换收集管，倒置纯化管于收集管内，在4℃以3000g离心2分钟，用PBS将收集管中液体补足至原体积，即为纯化后的细胞膜损伤指示复合物；
(4)标记细胞：向加药培养的实验组与对照组细胞中加入10nM细胞膜损伤指示复合物(以Annexin V计)，溶于Annexin V结合缓冲液中，在转台上室温孵育10分钟，用PBS洗细胞3次，以洗去多余的细胞膜损伤指示复合物，得到标记细胞；
(5)单细胞mRNA测序文库构建与测序：参照标准的单细胞mRNA测序流程进行文库构建；以最终cDNA文库为模板，加入包含第一引物结合序列的引物，通过PCR扩增单独构建细胞膜损伤指示序列的文库并进行测序。
检测结果如图4所示，由图4可以看出，用药浓度越高，细胞损伤程度越大，所结合的细胞膜损伤指示序列数量也越多。单个细胞所结合的细胞膜损伤指示序列数量可以通过单细胞测序得到，从而在单细胞层面上反应细胞在特定给药条件下的损伤程度。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方科技大学
<120> 一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法
<130> 2022.03.09
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gaggacgcta tgcctgtacc ggtttactba aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agac 94
Claims (9)
1.一种试剂盒，用于检测细胞损伤程度，其特征在于，包括：
第一试剂，包括生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列，所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列；
第二试剂，包括标记物标记的第一物质，所述标记物包括生物素或其类似物，所述第一物质包括Annexin V或其类似物；以及，
第三试剂，包括亲和素或其类似物。
2.一种试剂盒，用于检测细胞损伤程度，其特征在于，包括：
试剂R1，包括生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列，所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列；
试剂R2，包括第一物质与第二物质的融合蛋白，所述第一物质包括Annexin V或其类似物，所述第二物质包括亲和素或其类似物。
3.一种试剂盒，用于检测细胞损伤程度，其特征在于，包括细胞膜损伤指示复合物，所述细胞膜损伤指示复合物包括依次连接的标记物标记的第一物质、第二物质、以及生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列；
其中，所述标记物包括生物素或其类似物，所述第一物质包括Annexin V或其类似物，所述第二物质包括亲和素或其类似物；
所述细胞膜损伤指示序列包括特异指示细胞损伤程度的条形码核苷酸序列。
4.如权利要求1至3任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素或其类似物标记的细胞膜损伤指示序列中，所述细胞膜损伤指示序列还包括第一引物结合序列，所述第一引物结合序列一端与所述生物素或其类似物连接，另一端与所述条形码核苷酸序列连接。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞膜损伤指示序列还包括第二引物结合序列和多聚腺苷酸尾序列，所述细胞膜损伤指示序列包括依次连接的第一引物结合序列、条形码核苷酸序列、多聚腺苷酸尾序列和第二引物结合序列。
6.如权利要求1至3任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素包括链霉亲和素。
7.一种细胞损伤程度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、提供如权利要求1所述的试剂盒；
S20、将标记物标记的第一物质、亲和素或其类似物、生物素标记的细胞膜损伤指示序列混匀后进行孵育，得到混合物，将所述混合物进行纯化处理，得到纯化后的细胞膜损伤指示复合物，所述标记物包括生物素或其类似物，所述第一物质包括Annexin V或其类似物；
S30、将所述纯化后的细胞膜损伤指示复合物与待测细胞孵育后，清洗所述待测细胞，得到标记细胞；
S40、将所述标记细胞重悬后，测试所述标记细胞上结合的细胞膜损伤指示序列的数量，得到细胞膜的损伤程度。
8.如权利要求7所述的细胞损伤程度的检测方法，其特征在于，步骤S40包括：
将所述标记细胞进行单细胞测序，根据测序结果得到单个细胞上所结合的细胞膜损伤指示序列数量，从而得到单个细胞的细胞损伤程度。
9.如权利要求7所述的细胞损伤程度的检测方法，其特征在于，步骤S40包括：
将所述标记细胞重悬，然后加入荧光定量PCR反应体系进行测量，根据测量得到的荧光信号计算出每个细胞上结合的细胞膜损伤指示序列的数量，从而得到细胞损伤程度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210249657.6A CN116773805A (zh) | 2022-03-10 | 2022-03-10 | 一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210249657.6A CN116773805A (zh) | 2022-03-10 | 2022-03-10 | 一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116773805A true CN116773805A (zh) | 2023-09-19 |
Family
ID=87986605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210249657.6A Pending CN116773805A (zh) | 2022-03-10 | 2022-03-10 | 一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116773805A (zh) |
-
2022
- 2022-03-10 CN CN202210249657.6A patent/CN116773805A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240003892A1 (en) | Heterogeneous single cell profiling using molecular barcoding | |
| JP3738910B2 (ja) | 特定の核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーション−ライゲーション分析 | |
| CN110129415B (zh) | 一种ngs建库分子接头及其制备方法和用途 | |
| CN109161547B (zh) | 一种核酸适配体及其在检测致病性溶藻弧菌中的应用 | |
| EP4256081A1 (en) | Method of detection of a target nucleic acid sequence | |
| WO2000031536A2 (en) | Detecting structural or synthetic information about chemical compounds | |
| CN1731150B (zh) | 一种利用生物芯片检测二恶英类化学物质的方法 | |
| CN112280829B (zh) | 一种试剂盒、样本标记方法、单细胞测序方法 | |
| EP1041160A1 (en) | Methods for detecting mutation in base sequence | |
| JPH01501339A (ja) | 改良された核酸ハイブリダイゼーション方法及びそれに用いるキット | |
| CN112795654A (zh) | 用于生物体融合基因检测与融合丰度定量的方法及试剂盒 | |
| CN116773805A (zh) | 一种试剂盒、以及细胞损伤程度的检测方法 | |
| CN116445594A (zh) | 适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用 | |
| EP0453290B1 (en) | Nucleic acid probes for the detection of Giardia Lamblia and methods of detection | |
| US20050095626A1 (en) | Method for separation and purification method of nucleic acid | |
| CN113462694B (zh) | 一种针对大口黑鲈虹彩病毒感染细胞的核酸适配体及其应用 | |
| CN115852000B (zh) | 检测样本中甲烷代谢基因的探针、芯片、试剂盒和方法 | |
| CN114624442B (zh) | 一种基于适配体信号放大的化学发光检测癌胚抗原试剂及其制备方法 | |
| US20220025430A1 (en) | Sequence based imaging | |
| CN116497033A (zh) | 一种核酸适体及应用其的球形棕囊藻荧光分子检测探针 | |
| KR100607901B1 (ko) | 분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법 | |
| KR100691799B1 (ko) | 단일가닥핵산 프로브를 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법 | |
| KR20070083924A (ko) | 핵산 검출용 핵산 단편 및 핵산 검출방법 | |
| CN115851934A (zh) | 一种单基因检测方法及其应用 | |
| JP2004201589A (ja) | 細菌同定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |