CN115852000B - 检测样本中甲烷代谢基因的探针、芯片、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测样本中甲烷代谢基因的探针组合、芯片、试剂盒和方法，属于基因检测技术领域。所述探针组合包括SEQ ID No.1～348所示的探针。本发明能够解决检测基因类型覆盖度低，低丰度基因灵敏度低，现有高通量测序基因检测技术的成本高，周期长，操作步骤繁琐等问题。

Description

检测样本中甲烷代谢基因的探针、芯片、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体地，涉及检测样本中甲烷代谢基因的探针、芯片、试剂盒和方法。
背景技术
甲烷是仅次于二氧化碳的重要温室气体，同时也是生产和生活中热能和电能的主要能量来源。在自然界中，有将近70％的甲烷是由微生物的代谢产生的，另外约30％是由地热分解有机物产生的。前者广泛分布在反刍动物及人类的粪便、土壤、沉积岩以及深海中，而后者主要分布陆地和海洋地表下的渗液，泥火山，地热区，采矿过程中对煤炭和烷烃的提取过程中，同时，这类甲烷也是天然气的主要成分。大量研究表明，在自然界中甲烷及其它短链烷烃含量丰富的区域，同时也富集多种嗜甲烷菌(methanotrophs)，存在显著的相关性。这些微生物虽然来自多个不同属(genera)，但是均以甲烷为碳源作为能量的来源。甚至有些属的嗜甲烷菌，不仅能够以甲烷为碳源，还能以其它短链烷烃，比如乙烷，丙烷等作为碳源，称之为兼性嗜甲烷菌，这类嗜甲烷菌对地热天然气环境下具有更强的适应性。在这些区域，嗜甲烷菌在整个微生物群落中的相对丰度对该区域的甲烷含量具有一个很好的指示作用。因此，对嗜甲烷菌在生物学上的鉴定，能够预测不同样本所在区域甲烷的相对含量。尤其是对地热甲烷的预测方面，鉴定和量化嗜甲烷菌以及兼性嗜甲烷菌，对天然气的探测具有重要意义。
目前，对嗜甲烷菌的鉴定方法主要有16S rRNA测序，甲烷单加氧酶基因(pmoA)扩增子测序，DNA稳定同位素探针(DNA-SIP)等。随着研究领域的发展，越来越多的属发现了嗜甲烷菌，但是来自不同属的嗜甲烷菌很难用单一的方法将其区分开来，甚至不能被常用的功能基因引物扩增出目标序列。例如，Beijerinckiaceae科下包含了嗜甲烷菌和非嗜甲烷菌，用传统的16S rRNA测序是无法将其区分开的。再如，Methylocella属下的嗜甲烷菌，传统的嗜甲烷菌鉴定的标记基因pmoA无法得到扩增产物，该属则是通过sMMO酶将甲烷氧化为甲醇，而编码sMMO酶的基因为mmoX，而不是编码pMMO酶的pmoA。而且，不同的嗜甲烷菌，编码pMMO酶的基因差异也很大，单一的扩增引物无法将所有嗜甲烷菌的目标序列扩增出来，需要设计不同的扩增引物，甚至是利用其它同源基因扩增引物。这表明，利用以上传统方法检测甲烷代谢基因的工作将会十分繁琐，灵敏度较低。因此，对嗜甲烷菌进行多基因位点的检测，不仅可以鉴定嗜甲烷菌的甲烷氧化代谢类型，还能将所有嗜甲烷菌纳入检测范围之中，有利于对特定环境样本的嗜甲烷菌检测，例如地热天然气环境样本。
功能基因芯片(functional gene arrays，FGAs)技术是微整列(microarrary)技术的一种，它是通过将目标扩增产物与芯片板上的功能基因探针杂交，借助荧光信号对目标基因进行定性定量分析，能够广泛应用于微生物检测，群落组成以及系统发育的分析。与传统的宏基因测序组或16S rRNA基因测序相比，FGAs避免了因测序深度有限导致的随机采样误差，不易发现低丰度的物种，且易受污染物干扰的影响，能够准确描述环境样本中目标基因的存在和组成，从而揭示微生物群落的功能特点。而且，FGAs不依赖于测序，在操作程序上和分析周期上也有着巨大的优势。比如GeoChip，能够有效地快速检测和量化微生物群落的功能结构，能够广泛地应用于土壤，水体，粪便以及其它极端环境中。而针对检测地热天然气(甲烷)开发的甲烷代谢基因检测芯片目前还未见报道，这类芯片的研制能够反映嗜甲烷菌在所在样本中的种群结构以及甲烷的代谢水平，对石油天然气的探测以及煤矿瓦斯的监测具有很好的辅助功能，减少对环境的破坏和降低安全隐患。
发明内容
本发明旨在研制一款用于检测环境样本中微生物甲烷代谢基因的芯片，通过探针检测不同类型的甲烷代谢基因来反映环境样本中微生物对甲烷的代谢能力，从而更好地指示环境中的甲烷含量。为了达到该目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种检测微生物甲烷代谢基因的探针组合，包括SEQ IDNo.1～348所示的探针。
本发明第二方面提供一种基因芯片，所述基因芯片包括本发明第一方面所述的探针组合。
在本发明的一些实施方案中，所述基因芯片还包括有阴性对照探针，优选地，所述阴性对照探针包括具有SEQ ID No.349所示核苷酸序列的探针。
在本发明的一些实施方案中，所述基因芯片还包括全局质控探针，优选地，所述全局质控探针包括具有SEQ ID No.350所示核苷酸序列的探针。
在本发明的一些实施方案中，所述基因芯片还包括点样位置控制探针。
本发明第三方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述探针组合或本发明第二方面任一所述的基因芯片。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括待测样本基因组DNA提取试剂、核酸扩增试剂、荧光标记试剂和/或纯化试剂。
本发明的第四方面提供一种检测微生物甲烷代谢基因的的方法，包括以下步骤：
S1，获取待测样本的基因组DNA；
S2，对获取的基因组DNA进行核酸扩增、荧光标记并进行纯化；
S3，利用本发明第二方面任一所述的基因芯片进行杂交检测；
S4，根据检测到的探针信号判断检测结果。
本发明第四方面提供一种检测微生物甲烷代谢基因的探针的设计方法，包括以下步骤：
(1)获得多个数据库收录的目标基因表达的蛋白的氨基酸序列并去冗余；
(2)将得到的氨基酸序列与NCBI的NT库进行BLAST比对，比对方法采用tblastn，根据1e-20显著性筛选前5～100条最佳匹配的核苷酸序列，然后，根据95％以上的比对区域一致性获取核苷酸序列；
(3)将步骤(2)获得的核苷酸序列进行相似度聚类，确定每个分支的代表序列；
(4)将每个代表序列切分成长度为预设探针长度的连续片段，作为一个子集的探针，然后将起始位置步移1个nt的距离再对代表序列切分长度为预设探针长度的连续片段，作为下一个子集的探针，重复该操作至起始位置为第一个子集的第二个片段的起始位置；
(5)将各个子集的探针依次比对该分支内其它基因的参考序列，选取连续探针覆盖度最好，比对一致性最佳的子集作为该分支的代表探针组；
(6)确定每个分支的代表探针组后，再将其与其它分支的参考序列进行比对，去除比对上的探针，剩余的探针作为该分支的原始特异性探针；
(7)原始的特异性探针再与NCBI的NT全库进行比对，剔除比对至非目标微生物种类的探针序列。
在本发明的一些实施方案中，所述目标基因为甲烷代谢基因，所述目标微生物为嗜甲烷菌或能进行短链烷烃代谢的菌。
在本发明的一些实施方案中，步骤(2)中，根据1e-20显著性筛选前5～20条最佳匹配的核苷酸序列。
本发明的有益效果
与现有技术相比，本发明具有有益效果：
(1)利用本发明，能够全面并准确地检测7类微生物甲烷代谢基因(pmoA，mmoX，prmA，bmoX，alkB，mxaF和xoxF)。7个基因中，前5类为甲烷或短链烷烃单加氧酶基因，后2类为甲醇脱氢酶基因，这7个基因基本涵盖了嗜甲烷菌(短链烷烃营养型菌)的甲烷(短链烷烃)代谢的必要通路。通过对这7类基因的检测，可以反映环境样本中嗜甲烷菌(短链烷烃营养型菌)的组成类型，同时也可以反映基因的丰度水平，关联环境中的甲烷以及短链烷烃的相对含量。
(2)利用本发明，通过芯片探针特异性杂交，能够准确检测样本中的目标基因序列，且不受样本序列丰度的影响，避免了繁琐的测序过程，以及引入的一些系统误差，能够在12小时内检测95％以上的目标基因序列(一些基因的部分分支可能没有特异性探针)。
(3)本发明为地热天然气的开采和煤矿瓦斯的监测提供了有力的保障，降低作业过程的成本消耗和安全隐患。
附图说明
图1示出了甲烷代谢基因检测芯片探针分布示意图。该图为一个30×45的微阵列探针分布图，微阵列又划分为6个子阵列。黑色位点标记的为安捷伦内部阴性探针，蓝色位点标记的为安捷伦内部位置探针，红色位点标记的是全局质控探针，青色位点标记的是内部阴性对照探针，其余空白处为目标特异性探针。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 7种类型的甲烷代谢基因特异性探针设计
根据微生物甲烷(短链烷烃)氧化代谢通路，拟定7类常见且公认的目标基因，即2类甲烷单加氧酶基因(pmoA和mmoX)，1类丙烷单加氧酶基因(prmA)，1类丁烷单加氧酶基因(bmoX)，1类烷烃羟化酶基因(alkB)，2类甲醇脱氢酶基因(mxaF和xoxF)。具体步骤如下：
(1)目标基因序列数据库构建：上述基因的蛋白序列主要来自于NCBI的蛋白库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)，COG数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog-project/)，eggNOG数据库(http://eggnog5.embl.de/)，KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/)和UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)等多个权威的蛋白序列数据库。数据库基本包含了上述目标基因的蛋白序列，共10,785条。通过将这些不同数据库来源的序列合并，然后去除冗余以及可信度较低的序列，以提高探针设计的质量。通过去重、去冗余(包含关系)、去除低质量(长度小于60aa)等过滤方式，最终得到目标基因的蛋白序列共9,778条。
(2)将整理的目标基因蛋白序列与NCBI的NT库进行BLAST比对，比对方法采用tblastn。首先，根据1e-20显著性筛选前50条最佳匹配的核苷酸序列，然后，根据95％以上的比对区域一致性获取目标序列。其次，根据100％相似度对这些核苷酸序列进行去冗余，最后，对这些序列进行物种注释，根据嗜甲烷菌常见的28个属以及能进行短链烷烃代谢的34个属进行过滤，如下表所示。去除一些来源于非嗜甲烷菌(短链烷烃营养型微生物)的序列，共得到43,347条核苷酸序列。
表1常见的嗜甲烷菌和短链烷烃营养型菌所在属以及目标基因类型
(3)目标基因同源序列的生成和聚类：根据基因类别，将转换成核苷酸的基因序列按照基因名称进行归类，每个基因的同源序列按照相似度95％聚类，根据表1信息保留常见嗜甲烷菌及甲烷营养型菌所在的分支，并确定每个分支的代表序列，如表2所示。
表2目标甲烷代谢基因序列以及类群统计
(3)特异性探针设计：使用连续平铺探针的方法(tiling)将每个分支的代表序列切分成长度为50nt的连续片段(探针长度)，作为一个子集的探针。然后将起始位置步移1个nt的距离再对代表序列切分长度为50nt的连续片段，作为下一个子集的探针。重复该操作至起始位置为第一个子集的第二个片段的起始位置，共50个子集的连续探针，子集之间的探针呈叠瓦式平移，即每个分支均有50个探针子集，相邻两个子集的首个探针的起始位置相差1nt。通过将50个子集的探针依次比对该分支内其它基因的参考序列，选取连续探针覆盖度最好，比对一致性最佳的子集作为该分支的代表探针组。探针比对的结合标准按照大于35个连续无错配碱基的比对，比对一致性大于96％，探针的寡核苷酸结合自由能小于-252kJ/mol。确定每个分支的代表探针组后，再将其与其它分支的参考序列进行比对，去除比对上的探针，剩余的探针作为该分支的原始特异性探针。与其它分支的比对按照非结合标准，即小于20个连续无错配碱基的比对，比对一致性大于90％，探针的寡核苷酸的结合自由能大于-147kJ/mol。原始的特异性探针再与NCBI的NT全库进行比对，剔除比对至非嗜甲烷菌的探针序列，仍然按照探针比对的非结合标准。最终剩余的探针为候选特异性探针，并根据每个基因对每个类群选取类群之间特异性高的6个探针作为芯片探针组的探针，共348个。为了确定这些探针的代表性，可以统计这些探针与该基因下的每个分支的覆盖情况和每个分支的特异性情况，如表3和表4所示。
表3目标甲烷代谢基因的探针数目和特异性统计
目标基因 基因类群 候选探针 探针组探针 探针覆盖类群 类群特异性探针
pmoA 15 156 90 15(100％) 90
mmoX 6 70 36 6(100％) 36
mxaF 16 177 96 16(100％) 94
xoxF 8 95 48 8(100％) 42
prmA 4 52 24 4(100％) 24
bmoX 2 27 12 2(100％) 12
alkB 7 98 42 7(100％) 41
共计 58 16263 348 58(100％) 339
表4目标甲烷代谢基因特异探针的基因序列匹配统计
目标基因 基因序列数目(表1中的目标菌) 特异性探针 匹配的基因序列
pmoA 1532 90 1505(98.24％)
mmoX 492 36 488(99.19％)
mxaF 375 96 356(94.93％)
xoxF 282 48 276(97.87％)
prmA 236 24 229(97.03％)
bmoX 43 12 37(86.05％)
alkB 768 42 738(96.09％)
共计 3728 348 3629(97.34％)
7个类别的基因设计的特异性探针共348个，这些探针能够完全覆盖每个基因的每个类群，并且能够对这些基因的目标参考序列匹配度占97.34％。根据设定探针杂交的信号的阈值，可以鉴定目标基因的类别。
7类甲烷代谢基因的特异性探针信息如表5所示：
表5探针序列信息
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实施例2对照探针及全局质控探针的设计
对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针。阴性对照探针为不存在于自然界生物基因组内的人工模拟寡核酸序列，检测任何样品都应为阴性。
阴性对照探针设计：使用随机种子的方法用计算机模拟生成10万条50nt的人工序列，并通过BLAST将序列集比对NT全库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nt.gz)，保留未比对上的序列，比对标准仍然按照连续匹配的碱基不超过20个，且序列覆盖率小于90％。最终剩余1052条序列。随机挑选1条序列作为阴性对照探针。阴性对照探针(Negative Control Probe)序列如下(SEQ IN No.349)：
AAAAAACTTGGCTACGAGGTGGACGCACTATTCATCAGAGCCGGAAAAAG
阳性对照探针设定为全局质控探针，为人工模拟合成的寡核苷酸序列，其核酸序列需要与样本混合共同加入检测芯片中，点样时需加入对应的核酸序列，一方面起到阳性对照作用，另一方面用于对不同子阵列和样品之间微阵列探针的荧光信号校正。全局质控探针设计方法同阴性对照探针的设计，全局质控探针(Global QC Probe)序列如下(SEQ INNo.350)：
CCGCACCTCGGACCGCACACAATCGTTTGAGGACGTGTAGCTGTGCTGGC
实施例3基因芯片的制备
本发明采用安捷伦(https://www.agilent.com/)平台的CGH(全基因组杂交)芯片，该芯片由固相载体和固定于该固相载体上的探针组成。而探针以微阵列的方式按一定空间分布的特征固定在固相载体上。本发明特别定制8×1K的微阵列(每个微整列均有45行，30列)，每个微阵列可以检测一份样品。每个微阵列又分为3×2的子阵列，不同子阵列之间可以用于探针的荧光信号校正。除了安捷伦芯片的固定探针外，剩余的位置需要按照子阵列为单元，将对照探针按照一定的位置进行放置，其它的位置填充目标基因检测探针。各类探针的分布特征见图1，各类探针的分布特征具体如下：
点样位置控制探针：该类型探针为安捷伦芯片自带的探针，其不与核酸杂交发光，而是通过化学发光原理，芯片杂交实验结束后，这些位点可帮助扫描仪定位芯片的准确坐标。根据固定探针的功能，分为阳性控制探针(即除NegControl以外的探针)和阴性控制探针。前者用于确定芯片扫描图片方向，评估样本是否贴上标签。后者用于测量背景信号值，因为其不包含内源性阳性控制探针，故可以用于任意物种。1K安捷伦芯片内置探针共84个位点(49个位置探针和35个阴性探针)，其中24个内置位置探针位点分布于微阵列的四个角，剩余位置探针位点和其余阴性探针位点随机分散在微阵列中。
全局质控探针：共1条探针序列，每个子阵列均有9个全局质控探针，排布规则按照每个子阵列的第4列，第8列，第12列与第4行，第8行，第12行交汇的位置放置。
阴性对照探针：共1条探针序列，每个子阵列重复10次。在3×2的子阵列中，左侧的子阵列位于阵列最后一行的后10个，右侧的子阵列位于阵列最后一行的前10个。
目标基因特异性探针：将设计的348个甲烷代谢基因特异性探针重复3次，向6个子阵列的空余位置由第一排到最后一排依次填入所有的目标基因特异性探针，使每个子阵列上的目标基因特异性探针数目相近。
实施例4待测样品DNA制备
可使用常规土壤DNA提取方法抽提环境样本的总DNA，样本可以为土壤，水体，沉积物等。本实施例采用碱液加热煮沸法对6例地热天然气环境样本的提取：
(1)称取3g土壤样品放入50mL离心管中，并加入500mg玻璃珠。然后再加入37℃预热的10mL DNA提取液(100mmol/L Tris[pH8.0]，100mmol/L EDTA，200mmol/L NaCl，2％[W/V]PVP，2％[W/V]CTAB，2％[V/V]巯基乙醇，6mg/mL溶菌酶)，通过漩涡振荡器混匀。
(2)在37℃水浴40分钟，水浴期间，每隔10分钟进行一次摇匀。
(3)水浴结束后，加入10mL的SDS缓冲液(100mmol/L Tris[pH8.0]，100mmol/LEDTA，200mmol/L NaCl，2％[W/V]SDS，160μg/mL的蛋白酶K)，65℃水浴1.5小时，每隔半小时摇匀一次。
(4)水浴后在6000转下离心10分钟，收集上清液。
(5)用上述方法再将土样残渣抽提一次，提取液由10mL变为6mL，完成后合并上清液。
(6)在上清液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶液(25:24:1V/V)，上下颠倒混匀放置10min，完成后在18℃的16000转下离心20min，收集水相。
(7)再加入等体积的氯仿-异戊醇溶液(24:1V/V)，抽提一次，重复上述步骤。
(8)用加入等体积的预冷(-20℃)异丙醇和1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)室温沉淀1-2h，直到析出白色絮状沉淀，16000转25℃离心20分钟，弃上清液。
(9)用75％乙醇漂洗2-3次，室温干燥，加入TE缓冲液，备用。
实施例5待测样品的核酸扩增及荧光标记
本实施例通过配置PCR荧光标记体系，将目标片段随机扩增，具体步骤如下：
(1)不同样本的DNA起始量需要保持相近(250ng)，并加水使体积达到29.5μL，并加入5.5μL的随机扩增引物(Life Technologies，random hexamers，3μg/μL)，混合于PCR管中。
(2)将样本DNA和随机引物震荡摇匀后，放入PCR仪(98℃，10分钟预热)，达到时间后，立即将管子放入冰上冷却。
(3)配置荧光标记体系：11μL的5×buffer(klenow)，5.5μL的10×dNTP mix，1μL的Klenow(imer)，0.5μL的CyDye(25nM)，2μL的ddH2O，共20μL。加入荧光染料时需要避光。
(4)将20μL的荧光标记预混合物转移到样本DNA和随机引物的混合物中，混合均匀，总体积约55μL。
(5)将反应体系置于PCR仪中执行程序：37℃，4小时，95℃，3分钟，4℃，保存。
实施例6荧光标记后的DNA纯化
(1)将标记后的产物在14000转下离心10分钟，分三次每次加入125μL 1×TE与样本混合，润洗标记管转入纯化柱。
(2)弃掉滤液，收集管放回收集柱中，加入480μL 1×TE(pH8.0)到收集柱中，盖盖后在14000转下离心10分钟。
(3)将收集柱取出来，倒置在新的2mL离心管中，1000转下离心1分钟，得到纯化后的样品(体积：40～64μL)，将纯化产物转入PCR管中。
(4)用Nanodrop one测定总核酸浓度，以及对应染料标记的浓度。
(5)使用浓缩仪对样品干燥至体积10μL，如果样品体积不足10μL，则加入1×TE至10μL。
实施例7芯片杂交及清洗
本实施例使用Agilent Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit试剂盒，包括以下步骤：
(1)封闭液的制备：从试剂盒中取10×aCGH Blocking Agent(干粉状态)，瞬间离心后加入1350μL Dnase/Rnase-free distilled H2O，室温条件反复震荡混匀6小时，至充分溶解。然后分装成120μL/管，备用。
(2)PCR仪开机预热，预设热盖温度为105℃。
(3)构建杂交体系，见表6，
表6杂交体系
组分 体积(μL)
Labeled DNA 2.5
Oligo nucleotide(Cy5)全局质控探针 2.2
98％甲酰胺 3
10×aCGH Blocking Agent封闭液 5.5
2×HI-RPM Hybridization Buffer 27.5
ddH2O 14.3
总体积 55
需要避光操作。
(4)将45μL的杂交缓冲液放入样品管侧壁，短暂离心后，分2次震荡15秒，离心。
(5)将反应体系置于PCR仪上，设定热盖温度为105℃，并运行程序98℃，3分钟，37℃，30分钟。
(6)避光取出杂交体系，6000转离心1分钟，置于37℃PCR仪或微量恒温仪备用。
(7)芯片清洗：杂交后在室温下取出芯片，放在洗液1(Agilent试剂盒的试剂)中，设置250转/分钟，在室温下震荡清洗5分钟；接着再用洗液2(Agilent试剂盒的试剂)，设置200转/分钟，在39℃下震荡清洗1分钟，最后去除芯片表面的液体，并在4小时内扫描。
实施例8芯片扫描及结果判读
(1)扫描及特征提取：清洗后的芯片将每个贴有“安捷伦”标签的芯片一端朝上，条形码一端先插入到幻灯片支架中，使用安捷芯片扫描仪在Multi-TIFF模式下进行扫描，得到芯片特征数据(tiff图片格式)，接着使用特征提取软件(Agilent Feature extraction)v12.1从tiff文件中提取信号特征，得到探针信号特征数据；
(2)数据质检：对上一步的探针信号特征数据进行质检，信号检出阈值设为100，实验数据质检合格需要满足以下两个条件：a)所有阴性对照探针均未检出(荧光信号值均低于阈值)；b)所有全局质控探针均检出，且均未出现信号过饱和。
(3)数据质控：
a)检出高于检测信号阈值(信号值100)的全局质控探针和目标基因探针；
b)计算全部子阵列(6个子阵列)的全局质控探针的信号平均值(QC_AllArraymean)和每个子阵列的全局质控探针的信号平均值(QC_SubArraymean)。
c)除了安捷伦芯片自带的数据读取的判别标准外，还需增加信噪比(SNR，信号值(前景值-背景值)/背景值标准差，SNR≥2)，信背比(SBR，前景值/背景值，SBR≥1.3)，严格信噪比(SSDR，(前景值-背景值)/(前景值标准差+背景值标准差)，SSDR≥0.7)3个统计指标，满足这3个统计指标，该位点探针的信号值视为有效。
d)荧光信号值的标准化处理：对每一个检出的目标基因探针i按公式1校正信号值(Signali)，并得到质控数据：
Correct_Signali＝Signali×QC_SubArraymean/QC_AllArraymean (公式1)
(4)目标基因检出判定：7类甲烷代谢基因以分支(类群)水平为检测尺度，每类基因的每个分支的6个代表探针均有3次重复，只要有2个重复以上(包括2个)特异性探针信号为阳性，表明该代表探针被检出，当每个分支的6种特异性探针被检出4种，则表明该分支被检出。
实施例9方法的时效性检测
1.实验数据
为了测试本发明实施例4-8的时间成本，采集的6例地热天然气环境样本总核酸被分为两份，其中一份供本发明进行芯片检测(按实施例4-8的处理方法)，另一份进行二代宏基因组测序，测序量为10G，通用技术方案包括扩增、建库、测序、数据质控、组装、物种注释和基因功能注释等主要操作环节，生物信息分析采用32个CPU。通过两种方法检测目标样本的甲烷代谢基因，比较本发明与宏基因组测序基因检测方法在周期上的差异。
2.实验结果
两个方案耗时比较由表7可知，宏基因组测序基因检测方法全流程耗时至少40个小时，而本发明方法仅需12小时，周期缩短了2.5倍。此外，本发明的数据分析及报告解读均要比宏基因组测序基因检测方法更为简单，降低了操作的难度，更适用于跨行业人士的使用。
表7本发明与宏基因组测序基因检测方法的时效性对比
步骤 本发明 宏基因组测序
核酸提取 3h 3h
文库构建 - 8h
核酸扩增及荧光标记 2.5h -
纯化荧光标记后的gDNA 0.5h -
上机测序 - >12h
芯片杂交及清洗 4.5h -
信号检测/数据分析 <0.5h >16h
报告解读 <0.5h 1h
总时间 <12h >40h
实施例10方法的准确性检测
1.实验数据
由于大部分嗜甲烷菌不可培养，因此，无法通过单菌作为甲烷代谢基因的阳性对照，只能通过与宏基因组测序数据进行实际样品检测的物种一致性进行比较。通过实施例9的方案，将芯片检测结果与二代宏基因组测序检测结果进行比较，主要在基因类型鉴定和代表菌株一致性两个层面判定两种方法检测结果的差异。
2.实验结果
如表8所示：
表8本发明与宏基因组测序基因检测方法的差异对比
注a：“++”表示宏基因组测序和芯片检测检测的目标菌株完全一致；“-+”表示芯片检出宏基因组未检测到的目标菌株；“+-”表示宏基因组测序检测的部分目标菌株芯片未检测到；“--”表示宏基因组测序检测的菌株与芯片检测的菌株完全不一致；“-”表示宏基因组测序和芯片均未检测到目标菌株。
从表8中可以看出，6个地热天然气环境样本均能检测到嗜甲烷(短链烷烃)菌及其关键的代谢基因。其中样本3，样本5和样本6的检测的目标菌株表明，本发明与宏基因组测序结果完全一致。然而，样本1的宏基因组测序结果有部分目标菌株在芯片中未检测到，这表明实际样本中可能含有一些未知的菌株不在探针覆盖范围内。芯片在样本2和样本4中检测到了宏基因组测序未包含的菌株，这也表明芯片在一些低丰度的菌株检测中比宏基因组测序更有优势，同时也能避免宏基因组组装错误造成的鉴定偏差。通过使用实际样本的比较，本发明所使用的甲烷代谢基因检测芯片能够在基因水平上与宏基因组测序检测完全一致，代表菌株检测上能够基本一致，而代表菌株的检测只是本发明的一个辅助功能，可供参考。
综上所述，在鉴定环境样本中微生物的甲烷代谢基因水平上，本发明与现有的金标准宏基因组测序技术相比，在时间成本和准确度上有着巨大的优势，而且操作难度大大降低，具有更为广泛的适用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1. 一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括探针组合，所述探针组合包括SEQID No. 1~348所示的探针。
2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片还包括有阴性对照探针，所述阴性对照探针包括SEQ ID No. 349所示的探针。
3. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片还包括全局质控探针，所述全局质控探针包括SEQ ID No. 350所示的探针。
4.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片还包括点样位置控制探针。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~4任一所述的基因芯片。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括待测样本基因组DNA提取试剂、核酸扩增试剂、荧光标记试剂和/或纯化试剂。
7.一种检测微生物甲烷代谢基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，获取待测样本的基因组DNA；
S2，对获取的基因组DNA进行核酸扩增、荧光标记并进行纯化；
S3，利用权利要求1~4任一所述的基因芯片进行杂交检测；
S4，根据检测到的探针信号判断检测结果。
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