CN115725764B - 检测样本中毛螺菌科菌种的探针组合、基因芯片和试剂盒 - Google Patents

检测样本中毛螺菌科菌种的探针组合、基因芯片和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测样本中毛螺菌科菌种的探针组合、芯片、试剂盒和方法,属于基因检测技术领域。所述8种毛螺菌科菌种分别为Agathobacter rectalis,Anaerobutyricum soehngeni,Bariatricus massiliensis,Blautia hansenii,Coprococcus eutactus,Enterocloster citroniae,Fusicatenibacter saccharivorans和Stomatobaculum longum,所述探针组合包括SEQ ID No.1~80所示的探针。本发明能够提供目前已知的8种关键的毛螺菌科菌种的快速检测方法,能够解决现有方法菌种检测灵敏度低,高通量测序检测技术成本高,周期长,操作步骤繁琐等问题。

Description

检测样本中毛螺菌科菌种的探针组合、基因芯片和试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测技术领域,具体地,涉及检测样本中毛螺菌科菌种的探针组合、基因芯片和试剂盒。
背景技术
毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌是人肠道中普遍存在的高丰度共生菌,约占人体肠道全部菌种丰度的10%~35%,该类群菌种广泛参与多种碳水化合物的代谢,并可以通过产生丁酸等短链脂肪酸、参与胆汁酸代谢、调控粘膜免疫应答、抵抗肠道内病原体定植等方式影响宿主健康,对毛螺菌科菌种在肠道中的丰度和多样性进行定性和定量的鉴定有助于研究者深入解析肠道菌群的功能。近年来,有大量人群队列研究表明肠道中毛螺菌科丰度与溃疡性肠病、帕金森病、以及脂肪肝、肥胖等代谢类疾病发病具有显著负相关性;然而,还有研究揭示了毛螺菌科的丰度与如系统性红斑狼疮和艾滋病等免疫疾病的发生发展具有正相关,其产生的对甲酚和吲哚等代谢产物也具有潜在的细胞毒性。这表明毛螺菌科在不同人群中丰度的变化对于宿主的健康和疾病具有截然相反的生理学意义。因此,毛螺菌科下的不同菌种对人类健康的影响是不同的,该类群的不同菌种有望作为潜在的疾病诊断生物标记物或者作为疾病预后判断的辅助指标被广泛应用。
传统的细菌鉴定主要通过培养,分离,显微观察,生理和形态学的判断,不仅操作过程较为繁琐,也过多依赖于工作人员的专业技术和经验知识。而且,对于一些不可培养的细菌则可能无法做到分离和鉴定。目前,对细菌的物种鉴定主要依托于分子生物学鉴定,通过物种特有的DNA片段对物种进行同一认定。比如,常用的16S rRNA测序,16S rRNA基因是原核生物核糖体中30S亚基的组成部分,该区段序列在细菌种普遍存在且在遗传进化上具有高度的保守性,常用作细菌物种鉴定的标记基因。但是,依据原核生物16S rRNA基因的保守性特点,并不能对所有细菌鉴定到种水平,而菌种水平的鉴定更为困难。基于酶联免疫吸附检测(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)的方法能够实现细菌菌种水平的鉴定,具有较高的灵敏度,常用于病原诊断。但是,该方法依赖于高度特异性的菌种抗体和其识别的特异性蛋白,可供应用的菌种范围十分有限,尤其是针对毛螺菌科菌种的较少。
基因芯片技术是将已知的物种特异性核酸序列(又称为探针)以微阵列(microarray)的形式排布在芯片载体上,通过与样本中目标菌种的核酸序列特异性杂交释放荧光信号,根据信号的强度判断物种的存在及其相对丰度。基因芯片技术与宏基因组测序或16S rRNA基因测序相比,其避免了因测序深度有限导致的随机采样误差和易受污染物干扰的影响,并且通过检测信号的高灵敏度能够发现丰度较低的物种,可以准确地描述环境样本中目标物种的存在和组成。运用基因芯片技术也可以实现对微生物的高通量检测,根据目标菌种特异性探针的数量和芯片承载探针的规格,一张芯片通常可以完成近千种细菌菌种的检测。同时,基因芯片技术不依赖于测序,在操作程序和分析周期上也有着巨大的优势,是一种快速灵敏的目标序列检测方法,在微生物物种检测,尤其是人类相关的病原检测方面得到了广泛的应用。然而,目前不尚缺少检测芯片能够检测人类肠道毛螺菌科菌种,特别是一些对人类肠道健康影响密切相关的菌种。
发明内容
本发明旨在针对毛螺菌科不同菌种设计特异性检测芯片,通过探针检测肠道内毛螺菌科目标菌种在种水平的多样性及其相对丰度,反映肠道毛螺菌科目标菌种的结构和组成,辅助判断肠道环境的短链脂肪酸合成,胆汁代谢,病原抗性等相关能力。为了达到该目的,本发明采用以下技术方案:
本发明第一方面提供一种检测8种毛螺菌科菌种中一种或多种的探针组合,所述8种毛螺菌科菌种分别为Agathobacter rectalis,Anaerobutyricum soehngeni,Bariatricus massiliensis,Blautia hansenii,Coprococcus eutactus,Enteroclostercitroniae,Fusicatenibacter saccharivorans,Stomatobaculum longum,其中,检测Agathobacter rectalis的探针包括分别具有SEQ ID No.1~10所示核苷酸序列的探针中的至少一种;检测Anaerobutyricum soehngeni的探针包括分别具有SEQ ID No.11~20所示核苷酸序列的探针中的至少一种;检测Bariatricus massiliensis的探针包括分别具有SEQ ID No.21~30所示核苷酸序列的探针中的至少一种;检测Blautia hansenii的探针包括分别具有SEQ ID No.31~40所示核苷酸序列的探针中的至少一种;检测Coprococcuseutactus的探针包括分别具有SEQ ID No.41~50所示核苷酸序列的探针中的至少一种;检测Enterocloster citroniae的探针包括分别具有SEQ ID No.51~60所示核苷酸序列的探针中的至少一种;检测Fusicatenibacter saccharivorans的探针包括分别具有SEQ IDNo.61~70所示核苷酸序列的探针中的至少一种;检测Stomatobaculum longum的探针包括分别具有SEQ ID No.71~80所示核苷酸序列的探针中的至少一种。
在本发明的一些实施方案中,在本发明的一些实施方案中,所述探针组合包括能够检测8种毛螺菌科菌种中至少2种、3种、4种、5种、6种或7种的探针。在本发明的一些更优选实施方案中,所述探针组合包括能够检测8种毛螺菌科菌种的探针。
在本发明中,所述探针组合也称为探针组合物,是指有多种探针组成的组合物。
在本发明的一些实施方案中,检测Agathobacter rectalis的探针包括分别具有SEQ ID No.1~10所示核苷酸序列的探针;检测Anaerobutyricum soehngeni的探针包括分别具有SEQ ID No.11~20所示核苷酸序列的探针;检测Bariatricus massiliensis的探针包括分别具有SEQ ID No.21~30所示核苷酸序列的探针;检测Blautia hansenii的探针包括分别具有SEQ ID No.31~40所示核苷酸序列的探针;检测Coprococcus eutactus的探针包括分别具有SEQ ID No.41~50所示核苷酸序列的探针;检测Enterocloster citroniae的探针包括分别具有SEQ ID No.51~60所示核苷酸序列的探针;检测Fusicatenibactersaccharivorans的探针包括分别具有SEQ ID No.61~70所示核苷酸序列的探针;检测Stomatobaculum longum的探针包括分别具有SEQ ID No.71~80所示核苷酸序列的探针。
在本发明中,针对特定毛螺菌科菌种的探针是利用以下叠瓦式探针方法设计得到的:
(1)从菌种的参考序列的首端开始,制作成长度为50nt,相邻探针之间在参考序列上的起始位置移位为1nt的探针集合;
(2)使用Bowtie2软件将每株菌的探针集合与其它菌种的参考序列比对,过滤掉比对上的探针;
(3)将过滤后的探针根据碱基排布顺序计算结合自由能,去除结合自由能小于-147kJ/mol的探针;
(4)用Bowtie2将剩余探针序列与人类参考基因组(hg38)比对,过滤掉比对上的探针;
(5)对过滤后的探针集合进行去冗余,即间隔50nt以内的探针序列只取一个,最终得到每个菌种的候选特异性探针集。
本发明的第二方面提供一种基因芯片,所述基因芯片包括本发明第一方面所述的探针组合。
在本发明的一些实施方案中,所述基因芯片还包括有阴性对照探针。
在本发明的一些具体实施方案中,所述阴性对照探针包括具有SEQ ID No.81所示核苷酸序列的探针。
在本发明的一些实施方案中,所述基因芯片还包括阳性对照探针。
在本发明的一些具体实施方案中,所述阳性对照探针包括分别具有SEQ ID No.82~105所示核苷酸序列的探针中的至少一种。
在本发明的一些实施方案中,所述基因芯片还包括全局质控探针。
在本发明的一些具体实施方案中,所述全局质控探针包括具有SEQ ID No.106所示核苷酸序列的探针。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明采用安捷伦芯片,探针以微阵列的排布方式固定于固相载体上,微阵列又可以划分为4个9列×9行的子阵列,微阵列上探针的布局如下:
安捷伦的固定探针:共36个位点,其中23个为位置探针,主要在扫描时起到芯片和子阵列方向识别的作用,剩余的13个为阴性探针,是不与任何生物序列杂交的,用于测量背景信号值;
全局质控探针:共1条序列,重复20次,每个子阵列设5个,排布规则按照每个子阵列的第3列、第7列与第3行、第7行,以及第5列与第5行的交汇位置,5个点以中心向四个角分散排布;
阳性对照探针:共24条序列,为4种大肠杆菌16S序列的阳性对照探针,每个子阵列设1种大肠杆菌(Escherichia coli)阳性对照探针,每种大肠杆菌的阳性对照探针分布在子阵列的末尾,即左侧的子阵列分布在最后一行的后6个,右侧的子阵列分布在最后一行的前6个,以避开芯片四个角的安捷伦位置探针;
阴性对照探针:共1条序列,重复4次,位于每个子阵列最后一行中目标菌种特异性探针与阳性对照探针之间的位置;
目标菌种特异性探针:共80条序列,重复3次,向4个子阵列的空余位置由第一排到最后一排依次填入,使每个子阵列的目标菌种特异性探针数目相近。
本发明的第三方面提供一种试剂盒,所述试剂盒包括本发明第一方面所述的探针组合或本发明第二方面任一所述的基因芯片。
进一步地,所述试剂盒还包括待测样本DNA提取试剂。
更进一步地,所述试剂盒还包括核酸扩增试剂和荧光标记试剂。
更进一步地,所述试剂盒还包括纯化试剂。
本发明的第四方面提供一种毛螺菌科菌种的方法,包括以下步骤:
S1,获取待测样本的总DNA;
S2,对获取的总DNA进行核酸扩增、荧光标记并进行纯化;
S3,利用本发明第二方面任一所述的基因芯片进行杂交检测;
S4,根据检测到的探针信号判断检测结果。
在本发明的一些实施方案中,步骤S2中,所述核酸扩增为非特异性随机扩增;使用Cyanine3-dUTP进行荧光标记。
进一步地,步骤S4的步骤为:
S41,扫描及特征提取:清洗后的芯片使用安捷芯片扫描仪在Multi-TIFF模式下进行扫描,得到芯片特征数据,接着使用特征提取软件提取信号特征,得到探针信号特征数据;
S42,数据质检:对上一步的探针信号特征数据进行质检,设置信号检出阈值为100,若:a)所有阴性对照探针均未检出(荧光信号值均低于阈值);b)检出了50%以上的阳性对照探针;c)所有全局质控探针均检出,且均未出现信号过饱和,则本次检测数据质检合格;
S43,数据质控:检验通过的芯片数据需要进行质控和子阵列间探针信号值的校正,具体方法如下:
a)检出高于检测信号阈值(信号值>100)的全局质控探针,阳性探针和目标菌种特异性探针;
b)计算全部子阵列(4个子阵列)的全局质控探针的信号平均值(UC_Arraymean)和每个子阵列的全局质控探针的信号平均值(UC_SubArraymean);
c)除了安捷伦芯片自带的数据判读标准外,还需要增加信噪比(SNR,信号值(前景值-背景值)/背景值标准差,SNR≥2),信背比(SBR,前景值/背景值,SBR≥1.3),严格信噪比(SSDR,(前景值-背景值)/(前景值标准差+背景值标准差),SSDR≥0.7)3个统计指标。满足这3个统计指标,该位点探针的信号值视为有效。
d)信号值的标准化处理:对每一个检出的目标基因探针i的信号值(Signali)按以下公式得到校正信号值(Correct_Signali):
Correct_Signali=Signali×UC_SubArraymean/UC_Arraymean
S44,目标菌种的检出判定:目标菌种的特异性探针均有10个,每个探针重复了3次,只要有2个(包含2个)以上重复被检出,视为该特异性探针被检出,当该菌种有8个特异性探针被检出,则表明该菌种被检出。
在本发明中,所述待测样本为粪便样本。
在本发明的一些实施方案中,所述方法为非诊断和治疗目的的方法。
本发明的有益效果
与现有技术相比,本发明具有有益效果:
(1)本发明提供了利用基因芯片检测8种人类肠道毛螺菌科菌种的方案,通过对这8种毛螺菌的检测,可以明确这些菌种在人群中的物种组成和相对丰度,在一定程度上反映了肠道中短链脂肪酸合成,胆汁代谢,肠道病原抗性等益生能力。
(2)利用本发明的探针组合、基因芯片或试剂盒快速检验人类肠道菌群,通过芯片探针特异性杂交,能够准确检测样本中目标菌种的序列,且不受样本序列丰度的影响,避免了基因测序操作繁琐,低丰度物种检测灵敏度低,系统误差大等缺点。并且能够在12小时内完成对8种目标菌种进行特异性检测,具有时效快,准确性高,灵敏度高的特点。
(3)本发明的探针组合、基因芯片或试剂盒,为毛螺菌科菌种作为潜在的疾病诊断生物标记物提供了方法和技术途径,能够更好地辅助相关疾病的医学诊断。
附图说明
图1示出了毛螺菌科菌种基因芯片探针分布示意图。蓝色和黑色的位点分别为安捷伦固定探针中的位置探针和阴性探针,绿色位点为全局质控探针,红色为阳性对照探针,墨绿色为阴性对照探针,剩余空白颜色的检测位点为目标菌种的特异性探针位点。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例,否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量,且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下,本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考,且其等价的同族专利也引入作为参考,特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致,则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值,因此除非另有说明,否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值,条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1,1.5等)的范围,则适当地将1个单位看作0.0001,0.001,0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围,通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例,并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
术语“包含”,“包括”,“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在,且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问,除非明确说明,否则本申请中所有使用术语“包含”,“包括”,或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反,出来对操作性能所必要的那些,术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明,否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白,下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术,因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白,这里所公开的特定实施例可以做很多修改,仍然能得到相同的或者类似的结果,而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义,所有在此使用的技术和科学的术语,和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同,在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备,如无特殊说明,均为实验室常规仪器设备;下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 8种人类肠道毛螺菌科菌种的特异性探针设计
(1)8种毛螺菌科菌种的基因组数据库构建
通过对dbSCAN_seq数据库的检索,设置筛选条件,满足人类肠道中的毛螺菌科下的微生物,且在短链脂肪酸合成、胆汁代谢、鞭毛蛋白病原抗性和肠壁黏附能力相关基因差异较大,并且来自不同属的菌种。挑选8株菌,分别为Agathobacter rectalis,Anaerobutyricum soehngeni,Bariatricus massiliensis,Blautia hansenii,Coprococcus eutactus,Enterocloster citroniae,Fusicatenibacter saccharivorans,Stomatobaculum longum。同时,获取这些菌种的基因组序号,分别为MGYG000002492,MGYG000000077,MGYG000002945,MGYG000001704,MGYG000000018,MGYG000000198,MGYG000000251和MGYG000003001,并根据基因组编号在EMBL-EBI的MGnify数据库下载对应菌种的基因组序列。利用FastANI软件检测这些菌种基因组序列两两之间的相似性,基因组ANI值低于95%,表明菌种间差异明显。
(2)特异性探针设计
采用叠瓦式探针的方法,分别将8株菌的参考序列从首端开始,制作成长度为50nt,相邻探针之间在参考序列上的起始位置移位为1nt的探针集合。使用Bowtie2软件将每株菌的探针集合与其它菌种的参考序列比对,过滤掉比对上的探针。再将过滤后的探针根据碱基排布顺序计算结合自由能,去除结合自由能小于-147kJ/mol的探针。再用Bowtie2将剩余探针序列与人类参考基因组(hg38)比对,过滤掉比对上的探针。由于每个菌种的探针是以叠瓦式构建的,相邻探针间隔1nt,需要对过滤后的探针集合进行去冗余,即间隔50nt以内的探针序列只取一个,最终得到每个菌种的候选特异性探针集。调查研究显示,一般情况10条特异性探针能够对细菌进行菌种水平的鉴定,因此,从每个菌种的候选特异性探针集随机选取10条探针序列,用于芯片的目标探针。每个菌种的具体特异性探针序列如表1所示:
表1目标菌种特异性探针序列信息
Figure BDA0004006582280000091
Figure BDA0004006582280000101
Figure BDA0004006582280000111
Figure BDA0004006582280000121
/>
Figure BDA0004006582280000131
实施例2对照探针及全局质控探针的设计
对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针。阴性对照探针为不存在于自然界生物基因组内的人工模拟寡核酸序列,检测任何样品都应为阴性。
阴性对照探针设计:阴性对照探针设计:通过随机种子的方法用计算机模拟生成10万条50nt的核苷酸序列,并使用BLAST将序列集比对至NT全库,保留未比对上的序列,比对标准仍然按照连续匹配的碱基不超过20个,且序列一致性小于90%,同时满足结合自由能大于-147kJ/mol。最终剩余826条序列。随机挑选1条序列作为阴性对照探针。阴性对照探针(Negative Control Probe)序列如下(SEQ IN No.81):
AACTCCTACAAGATTAAGGGTAAATACGAAGGTTTTTATCTCGCGGGCAC
阳性对照探针设计:从细菌16S参考序列数据库(Silva_v132)选取人类肠道中常见的4种大肠杆菌(Escherichia coli)16S序列,NCBI编号分别为:AY319394.1,AY776275.1,EF025911.1和EF025907.1。分别从每株菌的16S序列的起始位置按照探针首尾相接的方式制作成长度为50nt的探针集合,并去除4个集合内相似度高于90%的探针。剩余的探针分别与8个目标菌种的基因组序列以及人类参考序列(hg38)用Bowtie2软件比对,最终得到4种大肠杆菌的候选阳性探针集,并从每个探针集中随机挑选6条序列作为芯片的阳性对照探针。序列如表2所示。
表2阳性对照探针
Figure BDA0004006582280000132
/>
Figure BDA0004006582280000141
全局质控探针为人工模拟合成的寡核苷酸序列,其核酸序列需要与样本混合共同加入检测芯片中,点样时需加入对应的核酸序列,一方面起到阳性对照作用,另一方面用于对不同子阵列和样品之间微阵列探针的荧光信号校正。全局质控探针设计方法同阴性对照探针的设计,挑选一条序列作为全局质控探针,在芯片杂交过程中,需要加入该序列的反向互补序列,全局质控探针(Global QC Probe)序列如下(SEQ IN No.106):
CCGCACCTCGGACCGCACACAATCGTTTGAGGACGTGTAGCTGTGCTGGC
实施例3基因芯片的制备
本发明采用安捷伦(https://www.agilent.com/)平台的CGH(全基因组杂交)芯片,探针以微阵列的排布方式固定于固相载体上。根据目标探针和对照探针的数目,本发明特别定制18列×18行的微阵列,该微阵列又可以划分为4个9列×9行的子阵列,每个子阵列之间的对照探针和全局质控探针数目需要相同,除了安捷伦芯片自带的固定探针(包括位置探针和阴性探针)之外,3次重复的目标探针尽可能的均匀分布在每个子阵列中。各类探针的分布特征见图1,具体的排布描述如下:
安捷伦的固定探针:共36个位点,其中23个为位置探针,主要在扫描时起到芯片和子阵列方向识别的作用,剩余的13个为阴性探针,是不与任何生物序列杂交的,用于测量背景信号值。
全局质控探针:共1条序列,重复20次,每个子阵列设5个,排布规则按照每个子阵列的第3列、第7列与第3行、第7行,以及第5列与第5行的交汇位置,5个点以中心向四个角分散排布。
阳性对照探针:共24条序列,为4种大肠杆菌16S序列的阳性对照探针,每个子阵列设1种大肠杆菌(Escherichia coli)阳性对照探针,每种大肠杆菌的阳性对照探针分布在子阵列的末尾,即左侧的子阵列分布在最后一行的后6个,右侧的子阵列分布在最后一行的前6个,以避开芯片四个角的安捷伦位置探针。
阴性对照探针:共1条序列,重复4次,位于每个子阵列最后一行中目标菌种特异性探针与阳性对照探针之间的位置。
目标菌种特异性探针:共80条序列,重复3次,向4个子阵列的空余位置由第一排到最后一排依次填入,使每个子阵列的目标菌种特异性探针数目相近。
实施例4待测样品DNA制备
肠道菌群的核酸提取需要以人类粪便为样本,可使用粪便DNA提取试剂盒抽提肠道菌群DNA。本实施例使用Bioteke粪便基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)对6份人类粪便样本提取:
(1)称取10mg粪便样本放入1.5mL离心管中,并加入300μL磁珠结合液CB,150μL裂解液TL,20μL蛋白酶K,4μL RNase A和50μL溶菌酶,在55℃下水浴40分钟,期间用涡旋器混匀3-5次,每次10-20秒;
(2)水浴后,在13000转下离心1分钟,取上清液转到新的1.5mL离心管中,加入20μL磁珠和280μL无水乙醇,用移液器轻轻吹打混匀,再在55℃水浴10分钟,期间用漩涡器混匀3次,每次10-20秒;
(3)将离心管放置到磁力架上,静置30秒使磁珠完全吸附,小心将管内液体吸出,避免吸走磁珠;
(4)加入450μL磁珠IR,用移液器反复吹打混合20次,再放置到磁力架上,静置30秒使磁珠完全吸附,再将管内液体吸出,避免吸走磁珠;
(5)加入550μL磁珠IR,用移液器反复吹打混合20次,再放置到磁力架上,静置30秒使磁珠完全吸附,再将管内液体吸出,避免吸走磁珠;
(6)加入650μL漂洗液WB(需加入无水乙醇),用移液器反复吹打混合20次,再放置到磁力架上,静置30秒使磁珠完全吸附,再将管内液体吸出,避免吸走磁珠;
(7)自然晾干5分钟,使磁珠上的乙醇完全挥发,加入120μL在65℃预热的洗脱缓冲液TE,用移液器反复吹打20次,在65℃水浴放置10分钟,使DNA从磁珠上充分洗脱,将深孔板放置在磁力架上,使磁珠完全吸附,小心取上清液,即为提取的DNA,置于-20℃保存备用。
实施例5待测样品的核酸扩增及荧光标记
本实施例通过使用PCR的方法对目标片段随机加入荧光标记物,具体步骤如下:
(1)不同样本的DNA初始量均要保持在250ng左右,加入超纯水并定容至29.5μL,然后加入5.5μL的随机引物(Life Technologies,random hexamers,3μg/μL),混合于PCR管中;
(2)将样本DNA与随机引物摇匀后,放入PCR仪,在98℃预热10分钟,然后转至冰上冷却;
(3)配置荧光标记体系,将11μL的5×buffer(混入klenow),5.5μL的10×dNTPmix,1μL的Klenow(imer,40U/mL),0.5μL的单色荧光染料CyDye(25nM),2μL的超纯水,共20μL。加入荧光染料时需要避光;
(4)将20ul的荧光染料标记预混合物转移至样本DNA和随机引物的混合物种,混合均匀,总体积定容至55μL;
(5)将反应体系置于PCR仪中,执行程序:37℃,4小时,95℃,3分钟,4℃,保存。
实施例6荧光标记后的DNA纯化
(1)将荧光标记后的产物在14000转下离心10分钟,将125μL的1×TE润洗液与样本混合清洗,重复3次,然后将PCR管转入纯化柱;
(2)弃掉滤液,收集管放回收集柱中,加入480μL 1×TE(pH8.0)至收集柱中,盖上盖子后在14000转下离心10分钟;
(3)将收集柱取出来,倒置在新的2mL离心管中,1000转下离心1分钟,得到纯化后的样品(体积:40~64μL),将纯化产物转入PCR管中;
(4)用Nanodrop one测定总核酸浓度,以及对应染料标记的浓度;
(5)用浓缩仪将样品干燥至10μL体积,如果样品体积不足10μL,则加入1×TE至10μL。
实施例7芯片杂交及清洗
本实施例使用Agilent Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit试剂盒,包括以下步骤:
(1)封闭液的制备:从试剂盒中取10×aCGH Blocking Agent(干粉状态),瞬间离心后加入1350μL Dnase/Rnase-free distilled H2O,室温条件放置6小时,期间反复震荡混匀,至充分溶解。然后分装成120μL/管,备用;
(2)PCR仪开机预热,至热盖温度至105℃;
(3)构建杂交体系,见表3,需要避光操作;
表3杂交体系
物料 体积(μL)
荧光标记的DNA 2.5
荧光标记的全局质控探针(Cy5) 2.2
98%甲酰胺 3
10×aCGH Blocking Agent封闭液 5.5
2×HI-RPM Hybridization Buffer 27.5
超纯水 14.3
总体积 55
(4)将45μL的杂交缓冲液放入样品管侧壁,短暂离心后,分2次震荡15秒,离心;
(5)将反应体系置于PCR仪,设定热盖温度为105℃,并执行程序:98℃,3分钟,37℃,30分钟;
(6)避光条件下取出杂交体系,6000转下离心1分钟,置于PCR仪或微量恒温仪在37℃下,备用;
(7)芯片完成杂交后需要将非特异性杂交的探针清洗掉,取出芯片放在洗液1(安捷伦试剂盒的试剂)中,在250转下震荡5分钟。然后用洗液2(安捷伦试剂盒的试剂),在200转下震荡1分钟,温度控制在39℃。最后去除芯片表面的液体,并在4小时内扫描信号。
实施例8信号检测及结果判读
(1)扫描及特征提取:清洗后的芯片将每个贴有“安捷伦”标签的芯片一端朝上,条形码一端先插入到幻灯片支架中,使用安捷伦芯片扫描仪在Multi-TIFF模式下进行扫描,得到芯片特征数据(tiff)格式,接着使用特征提取软件(Agilent Feature Extraction)v12.1从tiff文件中提取信号特征,得到探针信号特征数据;
(2)数据质检:探针信号特征数据需要经过质检,信号检出阈值设为100,合格的实验数据需要满足以下条件:a)所有阴性对照探针均未被检出(荧光信号值低于阈值);b)超过50%的阳性探针被检出;c)所有全局质控探针均被检出,且均未出现信号过饱和。质检合格的数据方可用于后续分析;
(3)数据质控:检验通过的芯片数据需要进行质控和子阵列间探针信号值的校正,具体方法如下:
a)检出高于检测信号阈值(信号值>100)的全局质控探针,阳性探针和目标菌种特异性探针;
b)计算全部子阵列(4个子阵列)的全局质控探针的信号平均值(UC_Arraymean)和每个子阵列的全局质控探针的信号平均值(UC_SubArraymean);
c)除了安捷伦芯片自带的数据判读标准外,还需要增加信噪比(SNR,信号值(前景值-背景值)/背景值标准差,SNR≥2),信背比(SBR,前景值/背景值,SBR≥1.3),严格信噪比(SSDR,(前景值-背景值)/(前景值标准差+背景值标准差),SSDR≥0.7)3个统计指标。满足这3个统计指标,该位点探针的信号值视为有效。
d)信号值的标准化处理:对每一个检出的目标基因探针i的信号值(Signali)按以下公式得到校正信号值(Correct_Signali):
Correct_Signali=Signali×UC_SubArraymean/UC_Arraymean
(4)目标菌种的检出判定:目标菌种的特异性探针均有10个,每个探针重复了3次,只要有2个(包含2个)以上重复被检出,视为该特异性探针被检出,当该菌种有8个特异性探针被检出,则表明该菌种被检出。
实施例9方法的时效性检测
(1)实验数据
为了测试本发明实施例4-8的时间成本,采集6份人类粪便样本,经过总DNA的提取,每个样本均分为3份。第1份供本发明进行芯片检测(按实施例4-8的处理方法);第2份进行二代宏基因组测序,测序量为10G,采用通用的技术方案,包括样本DNA的片段随机扩增,建库,测序,数据质控,组装,物种注释等主要操作;第3份采用细菌16S扩增子测序,数据量10万条序列,采用通用的技术方案,包括样本的16S区域目标片段的扩增,建库,测序,数据质控,拼接,物种注释等主要操作。生物信息分析的计算资源均采用32个CPU,存储空间100G。通过三种方法检测8种肠道毛螺菌科的菌种,比较三种方法在执行周期上的差异。
(2)实验结果
三种方法检测目标菌种在执行周期上的差异如表4所示,宏基因组测序检测方法全流程消耗至少40个小时,时间主要消耗在测序和数据分析上,而16S扩增子测序虽然在数据分析上比宏基因组测序的时间消耗要少,但是测序仍然消耗大量的时间。然而,本发明通过芯片检测的方法仅需要12个小时,均小于宏基因组测序和16S扩增子测序,分析耗时明显占优。此外,本发明避开了测序方法中的繁琐操作,以及操作技术要求高的难点,更适用于跨行业人士的使用。
表4本发明与宏基因组测序和16S扩增子测序的时效性比较
Figure BDA0004006582280000191
Figure BDA0004006582280000201
实施例10方法的准确性检测
(1)实验数据
宏基因组测序是微生物群落物种鉴定的金标准,通过对不同微生物的核酸分子测序并组装出较长的片段,使微生物的物种鉴定更为准确。通过实施例9的方案,比较宏基因组测序,16S扩增子测序和本发明的芯片检测三种方法,在8种目标菌种检出准确性上的差异。
(2)实验结果
从表5结果可知,通过用宏基因组测序的方法,在6份人类粪便样本中均检测到了不同组成的目标菌种。其中,样本1和样本6的检测结果,本发明的芯片检测与宏基因组测序,16S扩增子测序均一致。然而,在样本2和样本5中,本发明的芯片检测与宏基因组测序结果一致,但用16S扩增子测序则有部分目标菌种没有检出。这是因为16S区域相对保守,很多微生物在该区段的序列难以进行种水平的区分。类似的情况在样本3中也是如此,只是部分目标菌种用本发明的芯片检测也未检出,可能是这些菌种在该样本中的信号异常,因为这些菌种在其它样本中均检出。值得注意的是,本发明的芯片检测方法在样本4中检测到了宏基因组测序和16S扩增子测序均未检测到的目标菌种,这表明该菌种在样本中丰度较低,后两种方法对低丰度的物种检测灵敏度是不如本发明的芯片检测的。从实验结果可知,6份样本均只含有8种目标菌种的部分菌种,为了检验本发明对8种目标菌种同时存在的情况下的检测准确性,将6份样本的核酸等量混合,仍然按照实施例9的方案评估三种方法的检测结果。由表3可知,样本混合后,本发明的芯片检测与宏基因组测序的方法结果一致,8种目标菌种均能检测出来。然而,16S扩增子测序仍然有部分目标菌种未被检出。这表明本发明对目标菌种检测的灵敏度和准确性不受样本中菌种组成的影响,检测结果稳定。
表5本发明和16S扩增子测序分别与宏基因组测序对目标菌种的检出对比
Figure BDA0004006582280000202
Figure BDA0004006582280000211
说明:“++”表示宏基因组测序检出的目标菌种与所用的方法检出完全一致;“+-”表示宏基因组测序检出的目标菌种在所用的方法部分检出;“-+”表示所用的方法检出了宏基因组测序未检出的目标菌种;“-”表明宏基因组测序检出的目标菌种在所用的方法均未检出。
综上所述,本发明所述的芯片检测对8种肠道毛螺菌科菌种的鉴定准确性与当前菌群鉴定金标准的宏基因组测序相近,尤其是一些低丰度的菌种,本发明的芯片检测具有更高的灵敏度。此外,本发明的芯片检测在时间成本上有着巨大的优势,而且操作难度也大大降低,具有更为广泛的应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1. 一种检测8种毛螺菌科菌种的探针组合,其特征在于,所述8种毛螺菌科菌种分别为Agathobacter rectalisAnaerobutyricum soehngeniBariatricus massiliensisBlautia hanseniiCoprococcus eutactusEnterocloster citroniaeFusicatenibacter saccharivoransStomatobaculum longum,其中,检测Agathobacter rectalis的探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 1~10所示;检测Anaerobutyricum soehngeni的探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 11~20所示;检测Bariatricus massiliensis的探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 21~30所示;检测Blautia hansenii的探针的核苷酸序列如SEQID No. 31~40所示;检测Coprococcus eutactus的探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 41~50所示;检测Enterocloster citroniae的探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 51~60所示;检测Fusicatenibacter saccharivorans的探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 61~70所示;检测Stomatobaculum longum的探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 71~80所示。
2.一种基因芯片,其特征在于,所述基因芯片包括权利要求1所述的探针组合。
3.根据权利要求2所述的基因芯片,其特征在于,所述基因芯片还包括有阴性对照探针。
4. 根据权利要求3所述的基因芯片,其特征在于,所述阴性对照探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 81所示。
5.根据权利要求2所述的基因芯片,其特征在于,所述基因芯片还包括阳性对照探针。
6. 根据权利要求5所述的基因芯片,其特征在于,所述阳性对照探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 82~105所示的至少一种。
7.根据权利要求2所述的基因芯片,其特征在于,还包括全局质控探针。
8. 根据权利要求7所述的基因芯片,所述全局质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.106所示。
9.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述探针组合或权利要求2~8任一所述的基因芯片。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括待测样本DNA提取试剂、核酸扩增试剂、荧光标记试剂和/或纯化试剂。
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