KR100611056B1

KR100611056B1 - 병원성 미생물 검출을 위한 올리고뉴클레오티드마이크로칩 및 이를 이용한 병원성 미생물 검출방법

Info

Publication number: KR100611056B1
Application number: KR1020030091767A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 엄호섭; 황병희
Original assignee: 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2002-12-16
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2006-08-10
Also published as: KR20040055617A

Abstract

본 발명은 병원성 미생물인 쉬겔라 디센테리아 (Shigella dysenteriae), 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 비브리오 벌니휘쿠스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus) 및 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)에서 다형성능 (polymorphism)을 나타내는 서열을 포함하되 16S rRNA의 가변영역 (variable region)에 높은 특이성을 갖도록 고안된 올리고뉴클레오티드들을 자동화된 미세배열기를 이용하여 고형 기판의 표면에 고정시켜 제작된, 상기 병원성 미생물을 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 마이크로칩 및 이를 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 마이크로칩은 병원성 미생물을 고감도로 검출할 수 있어 식품검사, 임상검사, 식당위생검사, 수입 농·축·수산물 검역 및 가축의 진단 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

병원성 미생물 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 마이크로칩 및 이를 이용한 병원성 미생물 검출방법{OLIGONUCLEOTIDE MICROCHIP AND METHOD FOR THE DETECTION OF PATHOGENIC MICROORGANISMS USING SAME}

도 1은 본 발명에 따라 제작된 병원성 미생물의 16S rRNA의 가변영역을 특이적으로 인식하는 캡쳐 프로브 (capture probe) 올리고뉴클레오티드가 집적된 올리고뉴클레오티드 마이크로칩을 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명에 따라 제작된 올리고뉴클레오티드 마이크로칩의 검출효율을 검증하기 위하여 목적 균주의 16S rRNA의 가변영역을 포함하도록 고안된 타겟 프로브 (target probe) 올리고뉴클레오티드를 이용하여 병원성 미생물을 검출한 결과를 나타낸 것이고,

도 3 내지 도 10은 각각 본 발명에 따라 제작된 올리고뉴클레오티드 마이크로칩에 대하여 대상 균주인 대장균 K12, 쉬겔라 디센테리아, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 엔테리티디스, 비브리오 콜레라, 비브리오 벌니휘쿠스, 비브리오 파라헤모리티쿠스 및 캄필로박터 제주니의 16S rRNA의 가변영역을 포함하도록 고안된 타겟 프로브를 이용하여 상기 균주들을 각각 검출한 결과를 나타낸 것이고,

도 11은 본 발명에 따라 제작된 올리고뉴클레오티드 마이크로칩의 검출효율 을 검증하기 위하여 목적 균주로부터 추출된 염색체로부터 PCR로 증폭하여 합성한 타겟 프로브 올리고뉴클레오티드를 이용하여 병원성 미생물을 검출한 결과를 나타낸 것이고,

도 12 내지 도 19는 각각 본 발명에 따라 제작된 올리고뉴클레오티드 마이크로칩에 대하여 대상 균주인 대장균 K12, 쉬겔라 디센테리아 ATCC13313, 살모넬라 타이피뮤리움 IFO 1252, 살모넬라 타이피뮤리움 임상시료, 살모넬라 타이피 임상시료, 비브리오 콜레라 ATCC 14035, 비브리오 벌니휘쿠스 ATCC 27562 및 비브리오 파라헤모리티쿠스 ATCC로부터 추출된 염색체로부터 PCR로 증폭으로 합성한 타겟 프로브를 이용하여 상기 균주들을 검출한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 병원성 미생물의 16S rRNA의 가변영역 (variable region)에 특이적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 올리고뉴클레오티드 마이크로칩 (oligonucleotide microchip) 및 이를 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.

인체에 수많은 질병을 일으키는 병원성 미생물의 검출 및 진단은 인류의 복지를 위해 매우 중요한 분야로, 특히 인간에게 가장 중요한 에너지원인 식품의 경 우 이러한 병원성 미생물에 대한 안전성 검사가 이루어지지 않는다면 이를 통한 발병이 빈번하게 일어날 수 있다. 이러한 이유로 병원성 미생물을 검출하고 진단하기 위한 노력이 많이 이루어져 왔다. 인간에게 나타나는 주요한 질병 중에 증상으로 나타나는 임상적인 특징들은 발견되나, 이러한 증상을 설명할만한 원인이 규명되지 않은 대부분의 질병들이 아직까지 동정되지 않은 세균에 의한 것이라는 보고 (D. A. Relman, Emerging Infectious Diseases 4:382-389, 1998)가 있은 후, 이러한 병원성 미생물에 대한 새로운 검출방법의 개발이 모색되고 있다 (이효민 등, 한국식품위생안전성학회지 14: 319-326, 1999; S. Brunelle, IVD Technology 6월호: 55-61, 2001).

전통적인 미생물의 검출방법은 배양에 의존하기 때문에 과도한 시간 (4 내지 7일)이 요구되고 실험실의 다양한 배양조건에서도 배양이 불가능한 미생물들이 많기 때문에 오염된 식품이나 감염된 환자들로부터 검출되지 않는 미생물이 많을 뿐만 아니라, 형태학적 구분이 모호하여 현미경에 의한 검출도 그 한계를 나타내고 있다 (이효민 등, 한국식품위생안전성학회지 14: 319-326, 1999; M. A. Pfaller, Emerging Infectious Diseases 7: 312-318, 2001). 이러한 문제점을 극복하기 위해 개발된 검출방법으로 현재 상용화되고 있는 소형화된 생화학 키트 및 DNA/RNA 또는 면역반응 (ELISA)에 근거한 테스트, 그리고 종래의 방법을 개량한 자동화된 방법 등이 사용되고 있으나, 식품 종류에 따른 미생물 범위의 한계와 생화학적 또는 면역학적 반응으로 인한 형광을 판정해야 하는 등 정량적인 분석보다는 정성적인 분석에 치우쳐 그 판정이 어려운 경우가 많다 (W. E. Hill 등, Bacteriological Analytical Manual 8th ed., 1998; S. Brunelle, IVD Technology 6월호: 55-61, 2001; M. A. Pfaller, Emerging Infectious Diseases 7: 312-318, 2001). 뿐만 아니라, 이들 방법들은 여전히 분석 전에 미생물의 배양이 선행되어야 하기 때문에 종래에 가졌던 문제점을 그대로 내포하고 있다 (W. E. Hill 등, Bacteriological Analytical Manual 8th ed., 1998). 또한, 종래 병원성 세균검사의 비정확성 및 많은 시간과 경비가 소요되는 단점을 보완하기 위하여 새롭게 개발된 검출 장치들이라 해도 가격뿐만 아니라 커다란 부피가 사용자에게 부담을 주고 있다. 따라서, 이러한 문제점을 극복하고 실제 적용시 올바른 검출 및 진단이 가능한 새로운 방법이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 유전자 칩 (gene chip) 또는 DNA 마이크로어레이 (microarray)로도 불리는 DNA 칩 (DNA chip)은 자동 DNA 서열 분석기의 대규모 서열분석 (sequencing) 기술과 생물정보학의 진보에 의한 인간 및 미생물에 대한 유전체 해독 프로젝트, 분자생물학 및 특정 분자의 고정화 기술의 총아라고 할 수 있다. DNA 칩을 이용한 분석 원리는 서던 (Southern) 또는 노던 (Northern) 블럿 분석의 원리를 응용한 것으로 하나의 유전자에 대해서 한번의 실험을 수행해야 했던 종래 분자생물학 실험기법의 한계를 극복할 수 있는 우수한 기술이다. 특히, 올리고뉴클레오티드 칩은 데이터베이스의 유용성과 신뢰성에 크게 의존하여 in situ로 합성 및 집적 (spotting)되기 때문에 (B. Lemieux 등, Molecular Breeding 4: 277-289, 1998; D. M. Kehoe 등, Trends in Plant Science 4: 38-41, 1999), 현재 많은 유전체 서열분석 프로젝트의 완성과 함께 지노타이핑 (genotyping), 다형성능 (polymorphism) 검 출, 재서열분석 (resequencing) 및 SNP 연구분야에서 다각적으로 도입되고 있다. 상기 기술은 아주 많은 수의 유전자들을 단 한번의 실험으로 빠른 시간 내에 보다 민감하고 정확하게 정량적으로 분석할 수 있다는 장점을 지니고 있다 (D. G. Wang 등, Science 280: 1077-1082, 1998; T. R. Gingers, Genome Research 8: 435-448, 1998; J. G. Hacia, Nature genetics supplement 21: 42-47, 1999; G. M. Weinstock, Emerging Infectious Diseases 6: 496-504, 2000; S. V Tillib 등, Current Opinion in Biotechnology 12: 53-58, 2001).

이에 본 발명자들은 DNA 칩 기술이 다양한 다형성능을 나타내는 병원성 미생물의 검출 및 진단에도 우수한 효율을 나타낼 것으로 판단하고 예의 연구 노력한 결과, 대표적인 식품 병원성 미생물인 쉬겔라 디센테리아, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 엔테리티디스, 비브리오 콜레라, 비브리오 벌니휘쿠스, 비브리오 파라헤모리티쿠스 및 캄필로박터 제주니의 7종을 검출 및 진단할 수 있도록 16S rRNA의 가변영역에 특이적으로 고안된 캡쳐 프로브 (capture probe)가 집적된 올리고뉴클레오티드 마이크로칩을 제작하고 이를 이용하여 상기 병원성 미생물의 효율적인 검출이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식품검사, 임상검사, 수입 농·축·수산물 검역 및 가축의 진단 등에서 병원성 미생물을 고감도로 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 마이크로칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드 마이크로칩을 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 병원성 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 16S rRNA 서열의 가변영역을 특이적으로 인식하도록 고안된 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드를 고형 기판의 표면에 고정시켜 병원성 미생물을 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 마이크로칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 마이크로칩을 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

본 발명에서, "캡쳐 프로브 (capture probe) 올리고뉴클레오티드"란 병원성 미생물의 16S rRNA 염기서열의 가변영역을 특이적으로 인식하도록 고안된 25 mer 내외의 올리고뉴클레오티드로서 고형 기판에 집적되어 시료 내 병원성 미생물의 DNA와 혼성화 반응에 의해 특이적으로 결합하여 병원성 미생물을 검출하는데 사용되는 것을 의미한다.

본 발명에서, "타겟 프로브 (target probe) 올리고뉴클레오티드"란 본 발명 에 따라 제작된 올리고뉴클레오티드 마이크로칩의 병원성 미생물 검출 효과를 검증하기 위하여 병원성 미생물의 16S rRNA 염기서열의 가변영역을 포함하도록 고안된 100 mer 내외의 올리고뉴클레오티드로서 검출의 용이성을 위해 형광염료 등으로 표지되어 있는 것을 의미한다. 상기 타겟 프로브를 고형 기판에 집적된 캡쳐 프로브와 혼성화 반응시킨 후 사용된 표지물질의 특성을 이용하여 혼성화된 DNA를 검출하게 된다.

본 발명은 병원성 미생물의 16S rRNA 서열의 가변영역을 특이적으로 인식하도록 고안된 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드를 고형 기판의 표면에 고정시켜 병원성 미생물을 검출할 수 있도록 제작된 올리고뉴클레오티드 마이크로칩 (이하, "올리고 칩"으로 약칭함)을 제공한다.

우선, 본 발명은 병원성 미생물들을 검출하는데 DNA 칩 시스템을 적용하기 위하여, 미생물의 동정에 널리 사용되는 16S rRNA 서열정보를 이용하여 각각의 미생물에서 다형성능을 나타내는 서열을 포함하되 높은 특이성을 갖도록 고안된 25 mer 내외의 캡쳐 프로브 (capture probe) 올리고뉴클레오티드를 제작한다.

인체에 병을 일으키는 병원성 미생물로는 쉬겔라균 (Shigella), 살모넬라균 (Salmonella), 비브리오균 (Vibrio), 캄필로박터균 (Campylobacter), 바실러스균 (Bacillus), 리스테리아균 (Listeria) 또는 스타필로코커스균 (Staphylococcus) 등이 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 예에서는 쉬겔라 디센테리아, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 엔테리티디스, 비브리오 콜레라, 비브리오 벌니휘쿠스, 비브리 오 파라헤모리티쿠스 및 캄필로박터 제주니의 7종과 대조군 균주로서 비병원성 대장균 K12에 대한 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드를 제공하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드는 상기 7종의 병원성 미생물의 16S rRNA의 가변영역을 특이적으로 인식하고 약 25 mer 내외로 거의 동일한 열역학적 성질을 가지도록 제작된다 (표 1 참조). 병원성 미생물의 16S rRNA 서열정보는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 RDPⅡ (www.rdp.cme.edu) 데이터베이스를 통해 획득할 수 있다. 16S rRNA는 보존영역 (conserved region)과 가변영역들이 혼합되어 있는데, 보존영역은 생물체가 공통적으로 갖는 보존된 염기서열을 포함하는 반면, 가변영역은 종과 속간의 분화에 따른 다양성이 큰 부분으로 특정 분류군에만 존재하는 염기서열을 포함하는 특징을 가지고 있다. 따라서, 본 발명에서는 병원성 미생물을 검출하기 위하여 16S rRNA의 가변영역을 대상으로 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.

본 발명의 올리고 칩은 바람직하게는 상기 7종의 병원성 미생물의 16S rRNA의 가변영역을 각각 특이적으로 인식하고 서열번호 2 내지 8로 기재되는 염기서열을 갖는 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드 7개, 대조군 균주 대장균 K12의 16S rRNA의 가변영역을 특이적으로 인식하고 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드 1개 및 서열번호 9 및 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 양성 대조군 프로브 올리고뉴클레오티드 2개를 고형 기판의 표면에 집적시켜 제작할 수 있다 (도 1 참조). 이때, 양성 대조군 프로브 올리고뉴클레오티드는 DNA 칩 실험에서 혼성화 반응이 올바르게 일어나 실험이 잘 수행되었는지를 판단하기 위한 기준으로서 2가지 타입 중 프로브 A는 캄필로박터 제주니를 제외한 나머지 7개 균주에 대해 검출이 가능한 16S rRNA 보존영역의 서열로부터 고안하고, 프로브 B는 동일한 영역에서 캄필로박터 제주니가 다른 7개 균주와 하나의 염기가 다른 것을 고려해 프로브 A와 하나의 염기만 다르도록 고안한다.

상기와 같이 고안된 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드를 고형 기판에 집적할 때, 한 균주에 대하여 9개의 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드가 한 세트를 이루어 프로브 매트릭스 (matrix)를 형성하게 된다. 상기 프로브 매트릭스는 고형 기판에 집적시 16S rRNA의 유사성 트리 상호관련성 및 신뢰도의 향상을 위하여 3개의 양성 대조군 프로브 올리고뉴클레오티드를 대각선으로 배열하고 나머지 6개의 대상 균주용 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드를 그 주위에 배열하여 구성된다. 스팟 (spot)들은 서로간에 혼성화 신호 (hybridization signal)의 간섭효과를 배제할 수 있도록 400 ㎛ 정도의 거리를 두고 배열하는 것이 바람직하다.

이와 같이 구성된 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드들을 자동화된 미세배열기를 이용하여 고형 기판의 표면에 고정시켜 병원성 미생물을 검출할 수 있는 올리고 칩을 제작한다.

상기 올리고 칩을 제작하는 방법은

1) 올리고뉴클레오티드를 집적 용액 (spotting solution)에 혼합하여 웰 플레이트에 분주하는 단계;

2) 상기 올리고뉴클레오티드를 미세배열기를 이용하여 고형 기판의 표면상에 집적하는 단계;

3) 상기 기판을 상온에 방치하여 올리고뉴클레오티드를 기판에 고정시킨 후 세척하는 단계;

4) 상기 기판을 95℃의 끓는 물에 담가 변성 (denaturation)시킨 후 붕소수소 나트륨 (sodium borohydride) 용액에 담그는 단계;

5) 상기 기판을 세척한 후 건조시키는 단계를 포함한다.

상기 단계를 보다 자세하게 설명하면, 단계 1)에서 모든 올리고뉴클레오티드는 고형 기판과의 안정적인 결합을 형성할 수 있도록 작용기를 갖는 것이 바람직하며, 이를 위하여 3개의 에틸렌글리콜 스페이서 (ethyleneglycol spacer)가 연결되어 있고, 5' 말단에 아미노 변형이 이루어져 있다. 올리고뉴클레오티드에 부착된 아민기는 슬라이드의 알데히드기와 공유결합을 이루어 집적시킨 올리고뉴클레오티드가 슬라이드 위에 단단한 결합을 이루도록 작용하며 아미노의 변형방법은 쉬프 염기 결합 (Schiff's base reaction)을 이용한 화학반응에 의하여 이루어진다. 또한, 3개의 에틸렌글리콜 스페이서는 슬라이드 상의 올리고뉴클레오티드와 실제 형광이 표지된 시료의 DNA가 혼성화 반응을 할 경우 올리고뉴클레오티드가 보다 효율적으로 접근하여 혼성화 반응의 효율을 높이는 역할을 한다.

단계 1)에서 사용된 집적 용액 (micro spottng solution, TeleChem사)은 여러 가지 이온과 중합체를 포함하여 슬라이드 상에 올리고뉴클레오티드가 올바르게 위치하도록 도와준다.

단계 2)에서 고형 기판으로는 유리, 변형 실리콘, 플라스틱 카세트 또는 폴리카보네이트와 같은 중합체를 재료로 하며 임의의 형태를 갖는 기판이 사용될 수 있으며, 일반적으로 유리 기판이 가장 많이 사용되고 있다. 상기 기판의 표면은 올리고뉴클레오티드가 안정적으로 결합할 수 있도록 도와주는 화학물질로 코팅될 수 있으며, 바람직하게는 알데히드 (aldehyde) 또는 아민 (amine) 등의 화학물질로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 알데히드로 코팅되어 있는 슬라이드 글래스를 사용하고 올리고뉴클레오티드의 아민기와 슬라이드 글래스의 알데히드기가 쉬프 염기 (Schiff's base) 결합을 통해 공유결합을 이루게 됨으로써 올리고뉴클레오티드가 슬라이드 위에 고정된다.

상기 단계에서 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드들이 슬라이드 글래스 칩 상에 정교하게 배열되는데, 이때 양성 대조군 프로브 3개를 대각선으로 놓고 대상 미생물용 캡쳐 프로브 6개를 그 주위에 배열하여 모두 9개의 프로브를 포함하는 매트릭스로 구성된 대상 미생물 검출용 캡쳐 프로브 세트를 제조한다 (도 1 참조). 세로 방향으로는 대조군 균주인 대장균 K12를 포함하는 8종의 대상 미생물의 검출을 위한 8개의 검출용 캡쳐 프로브 세트를 집적하고, 가로 방향으로는 8개의 동일한 캡쳐 프로브 세트들의 반복을 집적함으로써 8 × 8의 캡쳐 프로브 세트 매트릭스가 집적되도록 한다. 또한, 실험오차를 줄이고 한번의 실험으로 보다 많은 횟수의 실험효과를 가져오도록 상기 8 × 8 캡쳐 프로브 세트 매트릭스를 슬라이드 글래스 상에 2개 이상 집적하는 것이 바람직하다.

상기 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드 스팟은 약 100∼150 ㎛의 직경을 갖는 원형인 것이 바람직하다. 상기 올리고 칩은, 예를 들면 2.7 ㎝ × 7.6 ㎝의 크기를 갖는 알데히드 코팅된 슬라이드 글래스 표면에 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드가 직경 150 ㎛의 스팟 크기로 400 ㎛ 간격을 두고 행과 열로 배열된다.

단계 3)에서는 올리고뉴클레오티드의 아민기와 고형 기판의 알데히드기 사이에 쉬프 염기 결합을 통한 공유결합이 형성되어 올리고뉴클레오티드가 고형 기판 표면에 고정되고, SDS (sodium dodecyl sulfate), SSC (Sodium chloride and Sodium Citrate), SSPE (sodium chloride, sodium phosphate and EDTA [ethylene diamine tetraacetic acid]) 등으로 세척하여 고정되지 않은 올리고뉴클레오티드를 제거한다.

단계 4)에서는 올리고뉴클레오티드를 집적시킨 후 올리고뉴클레오티드끼리 엉겨 있는 것을 바로잡기 위하여 기판을 90 내지 100℃, 바람직하게는 95℃의 끓는 물에 담가 고농도로 집적된 올리고뉴클레오티드의 변성을 유도하고, 0.2 내지 0.25% 붕소수소 나트륨 용액에 담가 쉬프 염기 결합을 하지 못하고 잔존하는 알데히드기를 불활성화시킨다.

이후, 단계 5)에서처럼 기판을 세척하고 건조시켜 본 발명에 따라 올리고 칩을 제조한다.

아울러, 본 발명은 상기 올리고 칩을 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 올리고 칩을 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법은

1) 병원성 미생물을 포함하고 있는 시료로부터 DNA를 추출하여 표지하는 단계;

2) 상기 표지된 시료 DNA를 본 발명의 올리고 칩상의 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드와 혼성화 반응시키는 단계;

3) 상기 올리고 칩을 세척하는 단계;

4) 상기 표지를 이용하여 혼성화된 DNA를 검출하는 단계; 및

5) 병원성 미생물의 존재 유무를 확인하는 단계로 구성된다.

상기 단계를 보다 자세하게 설명하면, 단계 1)에서 시료 DNA는 식품, 수입 농·축·수산물 또는 대상 환자의 혈액 등과 같이 병원성 미생물이 오염되어 있는 시료로부터 DNA를 추출한 후 여기에 적당한 표지물질, 예를 들어 형광염료, 바이오틴 (biotin) 또는 방사선 동위원소를 부착하여 준비한다. 예를 들면, 형광염료로는 Cy5, Cy3 등을 사용할 수 있으며, 이 외에 상업적으로 이용가능한 대부분의 형광 염료를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기와 같이 제작된 올리고 칩의 검출효과를 검증하기 위하여 대상으로 선정한 각 병원성 미생물의 16S rRNA의 가변영역을 포함하고 서열번호 11 내지 18로 기재되는 염기서열을 갖는 100 mer 내외의 타겟 프로브 (target probe)를 고안한 후 5' 말단에 Cy5 형광물질을 표지하여 모델실험을 수행한다.

단계 2)에서는 단계 1)에서 준비된 표지 시료 DNA를 정제한 후 혼성화 반응용액과 혼합하여 본 발명의 올리고 칩 기판 위에 적가함으로써 캡쳐 프로브 올리고 뉴클레오티드와의 혼성화 반응을 수행한다. 혼성화 반응은 상기 올리고 칩을 수증기로 포화된 튜브 안에 넣은 채로 50 내지 53℃의 배양기 내에서 3 내지 5시간 동안 실시한다.

단계 3)에서는 혼성화 반응이 끝난 올리고 칩을, 예를 들면 1× 혼성화 반응용액 및 0.1× 혼성화 반응용액으로 순차적으로 세척한 후 물기를 제거한다.

단계 4)에서는 시료 DNA에 표지된 물질을 검출하기에 적합한 수단을 이용하여 혼성화된 DNA를 검출하는데, 예를 들어 표지물질로 형광염료를 사용한 경우에는 올리고 칩에 적당한 진동수의 빛을 쬐어 형광염료를 활성화시키고 발생된 형광의 패턴을 형광 판독기로 해독함으로써 혼성화된 DNA를 검출할 수 있다.

단계 5)에서는 99% 신뢰구간 상한값을 역치 (threshold)로 설정하여 양성 신호를 판별함으로써 병원성 미생물의 존재 유무를 확인한다.

본 발명의 올리고 칩은 병원성 미생물을 효율적으로 검출할 수 있어 식품검사, 임상검사, 식당위생검사, 수입 농·축·수산물 검역 및 가축의 진단 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 올리고 칩의 제작 및 검출효율 확인

(단계 1) 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드의 제작

본 발명에서 선정한 7종의 대표적인 식품유래 병원성 미생물의 검출을 위하여 올리고 칩에 집적할 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드를 하기 표 1과 같이 제작하였다. 7종의 병원성 미생물인 쉬겔라 디센테리아 (Shigella dysenteriae), 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) SGSC1412, 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis) SE22, 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) CECT 514(T), 비브리오 벌니휘쿠스 (Vibrio vulnificus) ATCC 27562(T), 비브리오 파라헤모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus) 113 ATCC 17802(T) 및 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) ATCC 43431의 16S rRNA의 서열정보는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 RDPⅡ (www.rdp.cme.edu) 데이터베이스를 통하여 획득하였다. 본 발명에서 고안된 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드는 16S rRNA의 가변영역 부분을 특이적으로 인식하며 약 25 mer 내외로 거의 동일한 열역학적 성질을 가지도록 제작하였다.

구체적으로, 서열번호 1 내지 8의 올리고뉴클레오티드들은 각각 대조군 균주인 비병원성 대장균 K12, 쉬겔라 디센테리아, 살모넬라 타이피뮤리움 SGSC1412, 살모넬라 엔테리티디스 SE22, 비브리오 콜레라 CECT 514(T), 비브리오 벌니휘쿠스 ATCC 27562(T), 비브리오 파라헤모리티쿠스 113 ATCC 17802(T) 및 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) ATCC 43431의 검출을 위한 캡쳐 프로브들이다. 서열번호 9의 양성 대조군 프로브 A는 대장균 K12, 쉬겔라 디센테리아, 살모넬라 타이피뮤리움 SGSC1412, 살모넬라 엔테리티디스 SE22, 비브리오 콜레라 CECT 514(T), 비 브리오 벌니휘쿠스 ATCC 27562(T) 및 비브리오 파라헤모리티쿠스 113 ATCC 17802(T)의 16S rRNA 보존영역 (conserved sequence) 부분을 인식하도록 제작되었고, 서열번호 10의 양성 대조군 프로브 B는 캄필로박터 제주니의 16S rRNA 보존영역 부분을 인식하도록 제작되었다.

상기와 같이 고안된 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드는 독일의 MWG-Biotech사에서 제조 및 공급되었는데, 알데히드로 개질된 슬라이드 글래스 (Telechem, USA)에 집적된 후 안정적으로 공유결합을 형성할 수 있도록 합성시 캡쳐 프로브의 5' 말단을 아민기로 변형하였고, 결합시 시료 DNA와 슬라이드 표면의 입체적 장애를 줄이기 위해 캡쳐 프로브와 아민기 사이에 3개의 에틸렌글리콜 스페이서를 도입하였다.

서열번호	대상 균주명	캡쳐 프로브 (5'→3', 3'-아민)	길이
1	대장균 K12	CGCCACTCGTCAGCAAAGAAGC	22 mer
2	쉬겔라 디센테리아	CCGCCACTCGTCAGCAAACAG	21 mer
3	살모넬라 타이피뮤리움	ACTCGTCAGCGAAGCAGCAAGC	22 mer
4	살모넬라 엔테리티디스	GCCAGTCGTCAGCGAAGAGCA	21 mer
5	비브리오 콜레라	GCTCGCCACCCAAGGAACAAG	21 mer
6	비브리오 벌니휘쿠스	AAACAAGTTTCTCTGTGCTGCCGC	24 mer
7	비브리오 파라헤모리티쿠스	CGTTATCGTTCCCCGAAGTTCAGAT	25 mer
8	캄필로박터 제주니	CGCCACTAATCCACTTCTAGCAAGCT	26 mer
9	양성 대조군 A	GCCGCCAGCGTTCAATCTGA	20 mer
10	양성 대조군 B	GCCGCCAGCGTTCACTCTGA	20 mer

(단계 2) 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드의 집적을 통한 올리고 칩의 제작

16S rRNA의 유사성 트리 상호관련성 및 신뢰도의 향상을 위하여 상기 단계 1에서 제작한 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드를 슬라이드 글래스 칩 상에 집적시 양성 대조군 프로브 3개를 대각선으로 놓고 대상 미생물용 캡쳐 프로브 6개를 그 주위에 배열하여 모두 9개의 프로브를 포함하는 매트릭스로 구성된 대상 미생물 검출용 캡쳐 프로브 세트를 제조하였다 (도 1). 가로 방향으로는 대조군 균주인 대장균 K12를 포함하는 8종의 대상 미생물의 검출을 위한 8개의 검출용 캡쳐 프로브 세트를 집적하고, 세로 방향으로는 8개의 동일한 캡쳐 프로브 세트들의 반복을 집적함으로써 8 × 8의 캡쳐 프로브 세트 매트릭스가 집적되도록 하였다. 또한, 실험오차를 줄이고 한번의 실험으로 보다 많은 횟수의 실험효과를 가져오도록 상기 8 × 8 캡쳐 프로브 세트 매트릭스를 슬라이드 글래스 상에 2개 집적하였다.

먼저, 단계 1에서 제작한 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드 각각을 미세 집적용액 (micro spotting solution, TeleChem International Inc사, Sunnyvale, CA)과 1:1의 비율로 혼합한 후 96 웰 플레이트에 40 ㎕씩 분주하였다. 이때, 각 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드의 농도는 20 p㏖/㎕가 되도록 하였다.

상기 플레이트를 미세배열기 (microarrayer; Microsys 5100 Cartesian사) 내에 장착하여 미세배열기에 의해 알데히드 코팅된 슬라이드 글래스 (aldehyde-coated glass slide, CEL associates사) 위에 직경 100 ㎛의 스팟 크기로 400 ㎛ 간격을 두고 행과 열로 배열시켰다. 각각의 올리고뉴클레오티드들이 배열된 상기 슬라이드 글래스를 500 ㎖ 비이커를 사용하여 0.2% SDS로 2번 세척한 후 다시 증류수로 1번 세척하였다. 상기 슬라이드 글래스를 95℃의 끓는 물에 담가 변성 (denaturation)시킨 후 0.25% 붕소수소 나트륨 (Sodium borohydride) 용액에 5분 동안 담가 올리고뉴클레오티드가 슬라이드 글래스에 알맞게 결합하도록 하였다. 상기 슬라이드 글래스를 0.2% SDS로 2번, 증류수로 2번 세척한 후 원심분리기를 통 해 물기를 제거하여 건조시켰다.

(단계 3) 타겟 프로브의 설계 및 제작

단계 2에서 제작된 올리고 칩의 병원성 미생물 검출효과를 검증하기 위하여 대상 균주로 선정한 각각의 병원성 미생물들의 16S rRNA의 가변영역 부분을 포함하도록 타겟 프로브를 100 mer 내외로 고안하였다 (표 2).

구체적으로, 서열번호 11 내지 18의 타겟 프로브 올리고뉴클레오티드는 각각 대조군 균주인 대장균 K12, 쉬겔라 디센테리아, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 엔테리티디스, 비브리오 콜레라, 비브리오 벌니휘쿠스, 비브리오 파라헤모리티쿠스 및 캄필로박터 제주니의 16S rRNA의 가변영역을 포함한다. 이때, 타겟 프로브 올리고뉴클레오티드는 합성시 5' 말단에 Cy5 형광물질을 도입함으로써 이후의 실험단계에서 추가적인 표지 (labeling) 반응이 필요하지 않게 하였다.

서열번호	대상 균주명	타겟 프로브 (5'→3')	길이
11	대장균 K12	TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA	101 mer
12	쉬겔라 디센테리아	TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGAAAGCAGCTTGCTGTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA	100 mer
13	살모넬라 타이피뮤리움	TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA	101 mer
14	살모넬라 엔테리티디스	TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTCTTCGCTGACGACTGGCGGACGAGTGAGTAA	100 mer
15	비브리오 콜레라	TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCACAGAGGAACTTGTTCCTTGGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAA	101 mer
16	비브리오 벌니휘쿠스	TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCACAGAGAAACTTGTTTCTCGGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAA	101 mer
17	비브리오 파라헤모리티쿠스	TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTGAACTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAA	110 mer
18	캄필로박터 제주니	TGGCTCAGAGTGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGATGAAGCTTCTAGCTTGCTAGAAGTGGATTAGTGGCGCACGGGTGAGTAA	99 mer

(단계 4) 혼성화 반응 및 분석

슬라이드 글래스 상에 캡쳐 프로브가 집적된 스팟 외의 영역이 타겟 프로브와 반응하지 않도록 먼저 올리고뉴클레오티드가 고정된 올리고 칩을 3×SSC 전혼성화 용액 (pre-hybridization solution; 450 mM NaCl, 3 mM 소디움 시트레이트, 1% 소 혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA) (Sigma Aldrich, USA), 0.1% SDS, pH 7.0)에 30분간 담궈 반응시켰다. 이 후, 단계 3에서 준비된 대조군 균주를 포함한 8종의 미생물에 대한 Cy5 표지된 타겟 프로브를 3× SSC 혼성화 용액 (hybridization solution; 450 mM NaCl, 3 mM 소디움 시트레이트, 0.2 ㎎/㎖ BSA, 0.1% SDS, pH 7.0)과 혼합하여 단계 2에서 준비된 슬라이드 글래스 위에 40 ㎕를 적가하고 커버 글래스로 덮은 후 53℃에서 3시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다.

혼성화 반응이 끝난 슬라이드 글래스를 1× SSC + 0.2% SDS 혼합용액과 0.1× SSC + 0.2% SDS 혼합용액 및 0.1× SSC로 각각 5분씩 세척한 후 상온에서 원심분리기를 이용하여 건조시켰다. 상기 슬라이드 글래스를 판독기 (ScanArray Lite, Packard Instrument사)와 응용 프로그램을 사용하여 이미지 분석을 수행하였다. 올리고 칩을 판독기 (ScanArray Lite, Packard Instrument Co, Meriden, CT)를 이용하여 스캔하였고, 정량적 미세배열 분석 소프트웨어 (quantitative microarray analysis software, QuantArray, version 2.0)를 이용하여 분석하였다. 이로부터 여러 개의 동일한 프로브 스팟들의 형광강도의 평균과 표준오차를 구한 후 양성 대조군 프로브 스팟들로부터의 평균 형광강도 및 표준오차와 비교하였고, 그 결과를 도 3 내지 도 10에 나타내었다. 도 3 내지 도 10에서 1 내지 8은 각각 대장균 K12, 쉬겔라 디센테리아, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 엔테리티디스, 비브리오 콜레라, 비브리오 벌니휘쿠스, 비브리오 파라헤모리티쿠스 및 캄필로박터 제주니의 검출용 캡쳐 프로브를 나타내고, A는 양성 대조군 스팟의 평균 형광강도, B는 양성 대조군 스팟의 표준오차 (standard deviation), C는 대상 미생물 검출용 캡쳐 프로브 스팟의 평균 형광강도, D는 대상 미생물 검출용 캡쳐 프로브 스팟의 표준오차를 나타낸다.

그 결과, 99%의 유사성을 가지고 있는 대장균 K12와 쉬겔라 디센테리아의 경우 각각의 특이적인 캡쳐 프로브뿐만 아니라, 상대의 캡쳐 프로브를 이용한 올리고 칩에서도 검출됨으로써 (도 3 및 도 4), 본 발명의 올리고 칩이 한 종류만의 캡쳐 프로브 또는 한 종류의 검출원리로는 대장균 K12와 쉬겔라 디센테리아와 같이 서로간에 유사성이 매우 높은 균주들간의 검출에는 제한적임을 알 수 있었다. 살모넬라 타이피뮤리움의 경우에도 대장균 K12와의 유사성으로 인하여 비특이적인 검출이 발견되었다 (도 5). 그러나, 살모넬라 엔테리티디스의 경우에는 이러한 비특이적인 검출이 상대적으로 낮아 본 발명의 올리고 칩을 이용한 특이적인 검출이 가능함을 확인하였다 (도 6). 세 가지 비브리오 균주의 경우에도 본 발명의 올리고 칩을 이용하여 모두 특이적으로 검출이 가능함을 확인함으로써 본 발명에 따라 고안된 캡쳐 프로브 올리고뉴클레오티드가 동일한 종에 속하는 균주들의 검출 및 진단에도 성공적으로 활용될 수 있음을 알 수 있었다 (도 7 내지 도 9). 캄필로박터 제주니는 본 발명의 올리고 칩에서 가장 높은 형광강도를 나타냄으로써 상기 균주의 특이적 검출이 가능함을 확인하였다 (도 10).

<실시예 2> 올리고 칩을 이용한 병원성 미생물의 검출

상기 실시예 1에서 제작한 올리고 칩을 이용하여 실제 병원성 미생물이 검출되는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

(단계 1) 병원성 미생물의 수집 및 배양

본 발명의 올리고 칩이 대상으로 하는 병원성 미생물 쉬겔라 디센테리아, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 비브리오 벌니휘쿠스 및 비브리오 파라헤 모리티쿠스를 한국 미생물보존센터 (KCCM)와 동국대학교 의과대학 미생물학교실로부터 획득하였고, 대조군으로 사용된 비병원성 미생물 대장균 K12는 본 발명자가 보유하고 있는 균주를 사용하였다 (표 3). 하기 표 3에서, 임상 시료는 실제 병원성 미생물이 감염된 환자로부터 분리·동정된 균주를 의미하며, 본 실험에서는 임상에서 획득된 살모넬라 타이피뮤리움과 함께 장티푸스를 유발하는 살모넬라 타이피를 사용하여 올리고 칩의 검출효율을 검증하였다.

대상 균주명	미생물 정보
대장균 K12	ATCC 29425
쉬겔라 디센테리아 ATCC 13313	KCCM 41652
살모넬라 타이피뮤리움 IFO 1252	KCCM 40253
살모넬라 타이피뮤리움 임상시료	동국대학교 의과대학 미생물학교실
살모넬라 타이피 임상시료	동국대학교 의과대학 미생물학교실
비브리오 콜레라 ATCC 14035	KCCM 41626
비브리오 벌니휘쿠스 ATCC 27562	KCCM 41665
비브리오 파라헤모리티쿠스 ATCC 17802	KCCM 11965

분양받은 병원성 미생물들과 비병원성 균주로 대조군인 대장균 K12를 1 ㎖의 멸균 증류수로 충분히 현탁한 후 각 균주를 한천 고체배지에 삼각로드를 이용하여 접종하였고, 균주에 따라 약간의 차이는 있지만 16 내지 24시간 동안 30℃ 또는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 고체배지 위에 형성된 콜로니를 배지로부터 떼어낸 후 동일한 액체배지를 50 ㎖ 정도 채운 250 ㎖ 플라스크에 접종하고 진탕 배양하였다. 이때, 사용된 배지는 하기와 같은 조성을 갖는 선택배지로서 각 균주의 생육은 증진시키면서 다른 미생물의 생육은 억제되도록 하였다:

① 대장균 K12 - 효모 추출액 5.0 g, 트립톤 10.0 g, NaCl 10.0 g 및 증류수 1.0 ℓ(멸균);

② 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 타이피뮤리움 IFO 1252 및 살모넬라 타이피 (임상시료) - 폴리펩톤 10.0 g, 효모 추출액 2.0 g, MgSO₄ & H₂O 1.0 g 및 증류수 1.0 ℓ(pH 7.0, 멸균);

③ 살모넬라 디센테리움 ATCC 13313 및 비브리오 콜레라 ATCC 14035 - 쇠고기 추출액 3.0 g, 펩톤 5.0 g 및 증류수 1.0 ℓ(pH 7.0);

④ 비브리오 파라헤모리티쿠스 ATCC 17802 - 쇠고기 추출액 3.0 g, 펩톤 5.0 g, NaCl 30.0 g 및 증류수 1.0 ℓ(pH 7.0);

⑤ 비브리오 벌니휘쿠스 ATCC 27562 - 카제인 (Pancreatic Digest) 17.0 g, 대두가루 (Pancreatic Digest) 3.0 g, NaCl 15.0 g, K₂HPO₄ 2.5 g, 글루코스 2.5 g 및 증류수 1.0 ℓ.

(단계 2) 타겟 프로브의 설계 및 제작

상기 단계 1)에서 배양된 비병원성 균주인 대장균 K12와 병원성 균주인 쉬겔라 디센테리아 ATCC 13313, 살모넬라 타이피뮤리움 IFO 1252, 살모넬라 타이피뮤리움 (임상시료), 살모넬라 타이피 (임상시료), 비브리오 콜레라 ATCC 14035, 비브리오 벌니휘쿠스 ATCC 27562 및 비브리오 파라헤모리티쿠스 ATCC 17802로부터 염색체를 추출 (chromosome extraction)하였다. 상기 균주들은 모두 그람음성 세균으로 동일한 방법을 통해 염색체를 추출하였는데, 각 균주의 배양액으로부터 5 ㎖씩을 회수한 후 DNeasy 조직 키트 (Qiagen사)를 이용하여 염색체 추출을 실시하였다.

상기에서 추출된 각 균주의 해당 염색체를 주형으로 PCR을 수행하여 타겟 프로브 영역을 증폭한 후 ARES^TM Alexa Fluor 647 DNA 표지 키트 (Molecular Probes사)를 사용하여 증폭된 타겟 프로브를 형광으로 표지하였다. 이때, 일부 단계를 본 발명에 적합하게 수정하여 PCR 증폭시 염색체로부터 아민-변형 이중가닥 (Amine-modified double stranded) DNA를 합성한 후 합성된 상기 DNA에 형광물질을 도입하는 간접 형광 표지법 (indirect dye-coupling)을 수행하였다.

구체적으로, 아민-변형 이중가닥 DNA를 합성하기 위하여, 각 균주의 해당 염색체로부터 타겟 프로브 영역의 DNA를 증폭하되 형광물질의 도입을 위해 형광물질의 NHS 에스테르 (ester)와 결합할 수 있는 아민이 달린 아민-변형 dUTP를 사용하였다. PCR 조건은 30 ㎕ 반응용액 당 주형 DNA 200 ng, 서열번호 19 및 20의 5' 및 3' 유니버설 시발체 (universial primer, (주)제노텍사, 대한민국) 각각 100 pmol, 2 pmol, 아민-변형 dUTP (Molecular Probes사, 미국) 0.3 mM, dTTP 0.15mM, dATP, dCTP 및 dGTP 혼합물 0.5 mM 그리고 중합효소 2 단위를 사용하였다. PCR 완충용액은 20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100 및 0.1 ㎎/㎖ 아세틸화 BSA (pH 8.8)로 구성되며, PCR 반응에 사용한 효소는 Taq DNA 중합효소 (Bioneer사, 대한민국) 또는 Takara Ex Taq (TaKaRa,사, 일본)을 사용하였다. PCR 반응조건은 95℃에서 5분간 전-변성시킨 후, 95℃에서 1분간의 변성반응, 60℃에서 1분간의 어닐링반응 및 72℃에서 1분간의 연장반응을 35회 반 복한 후 72℃에서 5분간 최종 연장시켰다. 상기 PCR 반응에 의해 rRNA의 가변영역 중에서 1번과 2번을 포함하되 본 발명에서 사용된 모든 병원성 미생물에 대해 동일한 영역이 증폭되어 약 327 bp정도의 PCR 산물이 얻어진다.

이로부터 증폭된 PCR 산물을 DNA 필터 카트리지 (filter cartridge)로 정제하여 아민-변형 이중가닥 DNA를 얻었고, 에탄올 침전 (ethanol precipitation)을 수행하여 Tris의 아민기를 제거한 후 -20℃에 보관하였다. 이와 같이 정제된 아민-변형 이중가닥 DNA의 농도와 결합상태는 형광측정기 (Shimadzu UV-1601PC 및 Hellma Quartz precision cells 108.002.QS)를 이용하여 260과 280 ㎚에서 측정하였고, 이로부터 상기와 같이 정제된 DNA가 높은 순도를 가짐을 확인하였다.

상기에서 증폭된 아민-변형 DNA (각 5 ㎍)를 NHS 에스테르 염색 (Alexa Fluor 647, Molecular probes사)으로 염색 커플링 (dye coupling) 반응을 수행하였다. 염색반응의 조건은 10 ㎕ 반응용액 당 주형 DNA 5 ㎍, 소디움 바이카보네이트 (sodium bicarbonate) 90 μM, 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide) 용액에 NHS 에스테르 염색약을 넣고, 암조건에서 한 시간 동안 반응시켰다. 이로부터 형광표지된 아민-변형 DNA를 상기와 동일하게 정제하였고, 농도와 형광표지율 (labelling or coupling efficiency)을 형광측정기 (Shimadzu UV-1601PC 및 Hellma Quartz precision cells 108.002.QS)를 이용하여 650 ㎚ (Alexa Fluor 647)에서 측정하였다.

상기와 같이 형광표지된 타겟 프로브를 이용하여 실시예 1의 단계 4)와 동일한 방법으로 슬라이드 글래스 상에 캡쳐 프로브가 집적된 본 발명의 올리고 칩과 혼성화 반응을 수행한 후, 이를 판독기 (ScanArray Lite, Packard Instrument Co, Meriden, CT)를 이용하여 스캔하였고 정량적 미세배열 분석 소프트웨어 (quantitative microarray analysis software, QuantArray, version 2.0)를 이용하여 분석하였다. 이로부터 여러 개의 동일한 프로브 스팟들의 형광강도의 평균과 표준오차를 구한 후 양성 대조군 프로브 스팟들로부터의 평균 형광강도 및 표준오차와 비교하였고, 그 결과를 도 11 내지 도 19에 나타내었다. 도 12 내지 도 19 에서 1 내지 8은 각각 대장균 K12, 쉬겔라 디센테리아, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 엔테리티디스, 비브리오 콜레라, 비브리오 벌니휘쿠스, 비브리오 파라헤모리티쿠스 및 캄필로박터 제주니의 검출용 캡쳐 프로브를 나타내고, A는 양성 대조군 스팟의 평균 형광강도, B는 양성 대조군 스팟의 표준오차 (standard deviation), C는 대상 미생물 검출용 캡쳐 프로브 스팟의 평균 형광강도, D는 대상 미생물 검출용 캡쳐 프로브 스팟의 표준오차를 나타낸다.

도 11에 나타난 바와 같이, 병원성 미생물들의 16S rRNA의 가변영역 부분을 포함하도록 고안된 타겟 프로브를 이용한 상기 실시예 1의 모델실험 결과에 비해서 실제 병원성 미생물의 염색체로부터 증폭된 타겟 프로브를 이용한 본 실시예에서 전체적으로 우수한 재현성을 나타내었다.

구체적으로, 99%의 16S rDNA 유사성을 나타내는 대장균 K12와 쉬겔라 디센테리아의 경우 각각의 특이적인 캡쳐 프로브뿐만 아니라, 상대의 캡쳐 프로브를 이용한 올리고 칩에서도 검출되었고, 실시예 1의 모델실험에 비해 보다 우수한 검출효율을 나타내었다 (도 12 및 도 13). 살모넬라 타이피뮤리움은 실시예 1의 모델실 험에서 본 발명의 올리고 칩에 의해 고감도로 검출되었는데, 본 발명의 올리고 칩은 임상에서 획득된 살모넬라 타이피뮤리움에 대해서도 상당히 우수한 검출효율을 나타내었다 (도 14 및 15). 또한, 본 발명의 올리고 칩은 살모넬라 타이피뮤리움과 유사하나 증상이 다른 장티푸스 유발성 살모넬라 타이피에 대해서도 동일하게 우수한 검출효율을 보였다 (도 16). 세 가지 비브리오 균주의 경우에는 비브리오 콜레라에 대해서 살모넬라 타이피뮤리움과 다소 혼선된 결과를 보였으나 다른 두 비브리오 균주에 있어서는 본 발명의 올리고 칩을 이용한 검출이 모두 특이적임을 확인하였다 (도 17 내지 도 19). 이로부터, 본 발명에 따라 고안된 캡쳐 프로브 올리고 칩이 동일한 종에 속하는 균주들의 검출에 유용하게 적용될 수 있음을 재확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 마이크로칩은 병원성 미생물을 효율적으로 검출할 수 있어 식품검사, 임상검사, 식당위생검사, 수입 농·축·수산물 검역 및 가축 진단 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Postech Foundation <120> OLIGONUCLEOTIDE MICROCHIP AND METHOD FOR THE DETECTION OF PATHOGENIC MICROORGANISMS USING SAME <130> FPD/200312-0002 <150> KR10-2002-0080409 <151> 2002-12-16 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for E.coli K12 <400> 1 cgccactcgt cagcaaagaa gc 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for Shigella dysenteriae <400> 2 ccgccactcg tcagcaaaca g 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for Salmonella typhimurium <400> 3 actcgtcagc gaagcagcaa gc 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for Salmonella enteritidis <400> 4 gccagtcgtc agcgaagagc a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for Vibrio cholerae <400> 5 gctcgccacc caaggaacaa g 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for Vibrio vulnificus <400> 6 aaacaagttt ctctgtgctg ccgc 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for Vibrio parahaemolyticus <400> 7 cgttatcgtt ccccgaagtt cagat 25 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe for Campylobacter jejuni <400> 8 cgccactaat ccacttctag caagct 26 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> positive control probe A <400> 9 gccgccagcg ttcaatctga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> positive control probe B <400> 10 gccgccagcg ttcactctga 20 <210> 11 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target probe for E.coli K12 <400> 11 tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgaacgg taacaggaag 60 aagcttgctt ctttgctgac gagtggcgga cgggtgagta a 101 <210> 12 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target probe for Shigella dysenteriae <400> 12 tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgaacgg taacagaaag 60 cagcttgctg tttgctgacg agtggcggac gggtgagtaa 100 <210> 13 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target probe for Salmonella typhimurium <400> 13 tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgaacgg taacaggaag 60 cagcttgctg cttcgctgac gagtggcgga cgggtgagta a 101 <210> 14 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target probe for Salmonella enteritidis <400> 14 tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgaacgg taacaggaag 60 cagcttgctc ttcgctgacg actggcggac gagtgagtaa 100 <210> 15 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target probe for Vibrio cholerae <400> 15 tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg cagcacagag 60 gaacttgttc cttgggtggc gagcggcgga cgggtgagta a 101 <210> 16 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target probe for Vibrio vulnificus <400> 16 tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg cagcacagag 60 aaacttgttt ctcgggtggc gagcggcgga cgggtgagta a 101 <210> 17 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target probe for Vibrio parahaemolyticus <400> 17 tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg aaacgagtta 60 tctgaacttc ggggaacgat aacggcgtcg agcggcggac gggtgagtaa 110 <210> 18 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target probe for Campylobacter jejuni <400> 18 tggctcagag tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgaacga tgaagcttct 60 agcttgctag aagtggatta gtggcgcacg ggtgagtaa 99 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' universial primer <400> 19 tggctcagat tgaacgctgg cggc 24 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' universial primer <400> 20 tggaccgtgt ctcagttcca gtgtg 25

Claims

병원성 미생물인 살모넬라 엔테리티디스, 비브리오 콜레라, 비브리오 벌니휘쿠스, 비브리오 파라헤모리티쿠스 또는 캄필로박터 제주니를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 마이크로칩으로서, 살모넬라 엔테리티디스 검출용 서열번호: 4의 올리고뉴클레오티드, 비브리오 콜레라 검출용 서열번호: 5의 올리고뉴클레오티드, 비브리오 벌니휘쿠스 검출용 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드, 비브리오 파라헤모리티쿠스 검출용 서열번호: 7의 올리고뉴클레오티드, 및 캄필로박터 제주니 검출용 서열번호: 8의 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 고형 기판의 표면에 고정시킨, 시료 내 상기 병원성 미생물을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 마이크로칩.
삭제
제 1항에 있어서,

올리고뉴클레오티드에 3개의 에틸렌글리콜 스페이서 (ethyleneglycol spacer)가 연결되어 있고, 5' 말단에 아미노 변형 (5' amino modification)이 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 마이크로칩.
제 1항에 있어서,

서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 마이크로칩.
1) 시료로부터 DNA를 추출하여 표지하는 단계;

2) 상기 시료 DNA를 제 1항의 마이크로칩상의 올리고뉴클레오티드와 혼성화 반응시키는 단계;

3) 상기 올리고뉴클레오티드 마이크로칩을 세척하는 단계;

4) 상기 표지를 이용하여 혼성화된 DNA를 검출하는 단계; 및

5) 살모넬라 엔테리티디스, 비브리오 콜레라, 비브리오 벌니휘쿠스, 비브리오 파라헤모리티쿠스 및 캄필로박터 제주니로 구성된 군으로부터 선택된 병원성 미생물의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 제 1항의 올리고뉴클레오티드 칩을 이용하여 상기 병원성 미생물을 검출하는 방법.
제 5항에 있어서,

단계 2)의 혼성화 반응이 50 내지 53℃에서 3 내지 5시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.