JP6404714B2 - 多変量診断アッセイ及びこれを用いるための方法 - Google Patents

多変量診断アッセイ及びこれを用いるための方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年６月２４日に出願された米国特許出願第６１／５０１，１７０号に対する優先権及び利益を主張し、この内容は、その全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本開示は、一般的に、核酸発現特性の検出及び同定の分野に関する。
発明の背景
特定の遺伝子発現プロファイルの正確な同定は、生物学的経路解析の橋渡し研究、多重バイオマーカーアッセイ及び診断アッセイに大変に重要である。とりわけ重要なことに、当該技術分野において、試薬ロット、操作者、装置、及び実験室の差を超えて、高い再現性を有する測定技術を提供する橋渡し研究及び診断のための信頼でき、且つ配布可能なツール及び技術に対する需要が存在する。本発明は、これらの需要を解決する。
発明の概要
本発明は、生体サンプルから複数の標的核酸分子を多重検出するための、複数のプローブ分子を含む組成物であって、ここで複数中のそれぞれのプローブ分子が、サンプル中の１つの標的核酸分子と特異的に結合する、組成物を提供する。該組成物は、複数の標的核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準分子であって、ここで該プローブ分子は複数の基準分子と特異的に結合し、そして複数の基準分子のそれぞれが既知の量で存在する、基準分子をさらに含むことができる。該プローブ分子は、標的核酸分子を酵素的又は非酵素的に直接検出することができる。好ましくは、該プローブ分子は、標的核酸分子の非酵素的直接検出をすることができる。好ましくは、標的核酸分子の検出は、標的核酸増幅することなく起こる。
複数の核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準分子は、合成された核酸を含むことができる。複数の核酸分子のそれぞれを代表する複数の合成された基準分子は、インビトロで転写されたＲＮＡ、又は化学的に合成された核酸を含むことができる。基準分子を、個別のアッセイの有効性における変動について補正するために用いることができる。有効性の変動は、ロット対ロット、場所対場所、及び利用者対利用者の変動を含むことができる。基準分子を、標準的な発現を定量し、そして／あるいは異なるアッセイ間の発現を標準化するために用いることができる。基準分子のそれぞれは、標的核酸分子を代表する標的特異的領域を含み；該標的特異的領域は、標的核酸分子と同一の核酸配列、又は用いられるハイブリダイゼーション条件下で、基準に対する結合が標的との結合を代表するような、標的核酸分子と高い相同性を有する配列でもよい。
複数のプローブ分子は、約８〜約５０のプローブ分子、約１５〜約５０のプローブ分子、約２５〜約５０のプローブ分子、約５０〜約１００のプローブ分子、又は１００超のプローブ分子を含んでもよい。該プローブ分子は、核酸プローブでもよい。各核酸プローブは、（ｉ）標的核酸分子と特異的に結合する標的特異的領域；及び（ｉｉ）数珠つなぎの複数の標識付着領域を含む領域であって、各標識付着領域は、各標的特異的プローブに対して特有のコードを作り出す複数の標識モノマーと付着し、前記コードは、異なる第二の標的核酸分子と結合する別の核酸プローブから、第一の標的核酸と結合する１つの核酸プローブを識別する検出可能なシグナルを有する、領域を含み得る。複数の該標識付着領域は、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つの標識付着領域を含むことができる。複数の標識モノマーは、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つの標識モノマーを含むことができる。用いられる標識モノマーの数は、複数の標的核酸分子の複雑さに依存して変化し得る。該標識モノマーのそれぞれは、蛍光色素部分、蛍光部分、色素部分、及び化学発光部分からなる群から選択することができる。該核酸プローブは、アフィニティータグをさらに含むことができる。
該生体サンプルは、組織又は細胞サンプルでもよい。該生体サンプルは、腫瘍サンプルでもよい。該腫瘍サンプルは、乳房組織サンプルでもよい。該生体サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプルでもよい。
本発明は、該複数中の各プローブ分子が、サンプル中の１つの標的核酸分子と特異的に結合する場合、生体サンプルから複数の標的核酸分子を多重検出するための、複数のプローブ分子を含む組成物、及び複数の標的核酸分子の多重検出のための使用説明書を含むキットも提供する。キット内に含まれる組成物は、複数の標的核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準分子であって、ここで前記プローブ分子は、複数の基準分子と特異的に結合し、そして複数の標的基準分子のそれぞれは、既知の量で存在する、基準分子を更に含むことができる。該プローブ分子は、標的核酸分子を酵素的、又は非酵素的に直接検出することができる。好ましくは、該プローブ分子は、標的核酸分子の非酵素的直接検出をすることができる。該キットは、キットに含まれるプローブ分子と結合し、そして任意で検出するのに適した表面を含む装置をさらに含むことができる。好ましくは、該プローブ分子は、表面と結合した場合、標的核酸又は基準分子とハイブリダイズする。該プローブ分子は、当該技術分野において知られている任意の手段により表面と結合してもよい。該キットは、生体サンプルから標的核酸の抽出のための組成物をさらに含んでもよい。該キットは、ハイブリダイゼーション試薬、精製試薬、固定化試薬、及びイメージング試薬からなる群から選択される試薬をさらに含んでもよい。
本発明は、生体サンプルから複数の標的核酸分子の発現を検出するための方法であって、生体サンプルを提供すること；複数のプローブ分子であって、該複数中の各プローブ分子が、前記サンプル中の１つの標的核酸分子と特異的に結合する、複数のプローブ分子を提供すること；少なくとも１つのプローブ分子と１つの標的核酸分子のハイブリダイゼーションに十分な条件下で、生体サンプルと複数のプローブ分子を接触させること；及び対応する各標的核酸分子のそれぞれと結合した複数のプローブ分子のそれぞれに関連するシグナルを検出することを含む、方法を提供する。前記検出は、酵素的又は非酵素的であってもよい。好ましくは、前記検出は、非酵素的である。好ましくは、前記シグナルは、標的核酸増幅をすることなく検出される。
該方法は、複数の標的核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準分子であって、複数の基準分子のそれぞれは、既知の量で存在する基準分子を提供すること；対応する基準核酸分子のそれぞれと結合した複数のプローブ分子のそれぞれに関連するシグナルを検出すること；及び対応する標的核酸分子のそれぞれと結合した複数のプローブ分子のそれぞれに関連するシグナルを、対応する基準核酸分子のそれぞれと結合した複数のプローブ分子のそれぞれに関連する対応するシグナルで標準化すること、これにより、複数の標的核酸分子の通常の（標準的な）発現を定量することをさらに含む。
複数の核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準分子は、合成された核酸を含むことができる。複数の核酸分子のそれぞれを代表する複数の合成された基準分子は、インビトロで転写されたＲＮＡ、又は化学的に合成された核酸を含むことができる。該基準分子は、個別のアッセイの有効性における変動について補正するために用いられることができる。有効性の変動は、ロット対ロット、場所対場所、及び利用者対利用者の変動を含むことができる。基準分子は、標準的な発現を定量し、そして／あるいは異なるアッセイ間の発現を標準化するために用いることができる。基準分子のそれぞれは、標的核酸分子を代表する標的特異的領域を含み；該標的特異的領域は、標的核酸分子と同一の核酸配列、又は用いられるハイブリダイゼーション条件下で、基準に対する結合が標的との結合を代表するような、標的核酸分子と高い相同性を有する配列でもよい。
複数のプローブ分子は、約８〜約５０のプローブ分子、約１５〜約５０のプローブ分子、約２５〜約５０のプローブ分子、約５０〜約１００のプローブ分子、又は１００超のプローブ分子を含んでもよい。該プローブ分子は、核酸プローブでもよい。各核酸プローブは、（ｉ）標的核酸分子と特異的に結合する標的特異的領域；及び（ｉｉ）数珠つなぎの複数の標識付着領域を含む領域であって、各標識付着領域は、各標的特異的プローブに対して特有のコードを作り出す複数の標識モノマーと付着し、前記コードは、第一の標的核酸と結合する１つの核酸プローブを、異なる第二の標的核酸分子と結合する別の核酸プローブから、識別する検出可能なシグナルを有する、領域を含み得る。複数の標識付着領域は、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つの標識付着領域を含むことができる。複数の標識モノマーは、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つの標識モノマーを含むことができる。用いられる標識モノマーの数は、複数の標的核酸分子の複雑さに依存して変化し得る。前記標識モノマーのそれぞれは、蛍光色素部分、蛍光部分、色素部分、及び化学発光部分からなる群から選択することができる。前記核酸プローブは、アフィニティータグをさらに含むことができる。
該生体サンプルは、組織又は細胞サンプルでもよい。該生体サンプルは、腫瘍サンプルでもよい。該腫瘍サンプルは、乳房組織サンプルでもよい。該生体サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプルでもよい。
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書では、単数形は、文脈に他に明確に規定しない限り、複数形も含む。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に用いられ得るが、好適な方法及び材料は、以下に記載される。全ての刊行物、特許出願、特許及び本明細書で言及する他の参考文献は、参照により組み込まれる。本明細書で引用する参考文献が、本発明に対する先行技術であることは認められない。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は、説明のためにあるにすぎず、限定することを意図しない。
本発明の他の特徴及び有利な点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
図１は、基準サンプルとして用いられる核酸の合成プールの概略図を示す。この例では、前記プールは、試験生体サンプル中で調べられる１０の内在性の遺伝子の標的配列に対応する１０の異なる標的配列を含む１０のインビトロ転写されたＲＮＡからなる。 図２は、遺伝子特異的プローブ対を示す概略図である。 図３は、過剰な捕捉及びレポータープローブの除去を示す概略図である。 図４は、ストレプトアビジン−ビオチン結合を介したnCounter（登録商標）カードリッジの表面上のランダムな位置へのプローブ−標的複合体の結合を示す概略図である。 図５は、プローブ／標的複合体のアライメント及び固定化を示す概略図である。 図６は、それぞれの標的分子について、どのようにカートリッジの表面上のレポータープローブを計測し、そして表にするのかを示す表である。 図７は、ＰＣＲ増幅産物を示すアガロースゲルを示す。 図８は、２６０ｎｍにおけるＵＶ光により可視化した、インビトロ転写されたＲＮＡ産物を含む変性したゲルを示す。 図９は、多変量遺伝子アッセイにおいてデータ標準化のための基準サンプルの使用を示す概略図である。
発明の詳細な説明
本発明は、生体サンプルから複数の標的核酸分子を多重検出するための、複数のプローブ分子を含む組成物であって、ここで該複数中のそれぞれのプローブ分子が、サンプル中の１つの標的核酸分子と特異的に結合する、組成物を提供する。該組成物は、複数の標的核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準分子であって、ここで該プローブ分子は複数の基準分子と特異的に結合し、そして複数の基準分子のそれぞれが既知の量で存在する、基準分子をさらに含むことができる。該プローブ分子は、標的核酸分子を酵素的又は非酵素的に直接検出することができる。好ましくは、該プローブ分子は、標的核酸分子を非酵素的に直接検出することができる。好ましくは、標的核酸分子の検出は、標的核酸増幅することなく起こる。
本発明は、該複数中の各プローブ分子が、サンプル中の１つの標的核酸分子と特異的に結合する場合、複数のプローブ分子を含む、生体サンプルからの複数の標的核酸分子の多重検出のための、及び複数の標的核酸分子の多重検出のための使用説明書を含むキットも提供する。キット内に含まれる組成物は、複数の標的核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準分子であって、ここで前記プローブ分子は、複数の基準分子と特異的に結合し、そして複数の標的基準分子のそれぞれは、既知の量で存在する、基準分子を更に含むことができる。該プローブ分子は、標的核酸分子を酵素的、又は非酵素的に直接検出することができる。好ましくは、該プローブ分子は、標的核酸分子を非酵素的に直接検出することができる。該キットは、キットに含まれるプローブ分子とハイブリダイゼーションし、そして任意で検出するのに適した表面を含む装置をさらに含むことができる。好ましくは、該プローブ分子は、表面と結合した場合、標的核酸又は基準分子とハイブリダイズする。該プローブ分子は、当該技術分野において知られている任意の手段により表面と結合してもよい。該キットは、生体サンプルから標的核酸の抽出のための組成物をさらに含んでもよい。該キットは、ハイブリダイゼーション試薬、精製試薬、固定化試薬、及びイメージング試薬からなる群から選択される試薬をさらに含んでもよい。
本発明は、生体サンプルから複数の標的核酸分子の発現を検出する方法であって、生体サンプルを提供すること；複数のプローブ分子であって、該複数中の各プローブ分子が、前記サンプル中の１つの標的核酸分子と特異的に結合する、複数のプローブ分子を提供すること；少なくとも１つのプローブ分子と１つの標的核酸分子のハイブリダイゼーションに十分な条件下で、生体サンプルと複数のプローブ分子を接触させること；及び対応する標的核酸分子のそれぞれと結合した複数のプローブ分子のそれぞれに関連するシグナルを検出することを含む方法も提供する。前記検出は、酵素的又は非酵素的である。好ましくは、前記検出は、非酵素的である。好ましくは、前記シグナルは、標的核酸増幅をすることなく検出される。
前記方法は、複数の標的核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準分子であって、複数の基準分子のそれぞれは、既知の量で存在する基準分子を提供すること；対応する基準核酸分子のそれぞれと結合した複数のプローブ分子のそれぞれに関連するシグナルを検出すること；及び対応する標的核酸分子のそれぞれと結合した複数のプローブ分子のそれぞれに関連するシグナルを、対応する基準核酸分子のそれぞれと結合した複数のプローブ分子のそれぞれに関連する対応するシグナルで標準化すること、それ故、複数の標的核酸分子の通常の（標準的な）発現を定量することをさらに含む。従って、本発明は、分子生物学、又は他の合成技術、及びこれらの人工的な混合を用いて、対象のそれぞれの遺伝子配列を作製することに依存する基準分子を作製する方法を提供する。この手法は、驚くべきことに、基準分子内の各遺伝子の量の優れた且つ正確な制御を提供し、これは様々な試薬ロットにおける基準分子の複製も可能にする。
複数の核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準分子は、合成された核酸を含むことができる。複数の核酸分子のそれぞれを代表する複数の合成された複数の基準分子は、インビトロで転写されたＲＮＡ、又は化学的に合成された核酸を含むことができる。基準分子は、個別のアッセイの有効性における変動について補正するための用いられることができる。有効性の変動は、ロット対ロット、場所対場所、及び利用者対利用者の変動を含むことができる。基準分子は、標準的な発現を定量し、そして／あるいは異なるアッセイ間の発現を標準化するために用いることができる。基準分子のそれぞれは、標的核酸分子を代表する標的特異的領域を含み；該標的特異的領域は、標的核酸分子と同一の核酸配列、又は用いられるハイブリダイゼーション条件下で、基準に対する結合が標的との結合を代表するような、標的核酸分子と高い相同性を有する配列でもよい。
複数のプローブ分子は、約８〜約５０のプローブ分子、約１５〜約５０のプローブ分子、約２５〜約５０のプローブ分子、約５０〜約１００のプローブ分子、又は１００超のプローブ分子を含んでもよい。該プローブ分子は、核酸プローブでもよい。各核酸プローブは、（ｉ）標的核酸分子と特異的に結合する標的特異的領域；及び（ｉｉ）数珠つなぎの複数の標識付着領域を含む領域であって、各標識付着領域は、各標的特異的プローブに対して特有のコードを作り出す複数の標識モノマーと付着し、前記コードは、異なる第二の標的核酸分子と結合する別の核酸プローブから、第一の標的核酸と結合する１つの核酸プローブを識別する検出可能なシグナルを有する、領域を含み得る。複数の標識付着領域は、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つの標識付着領域を含むことができる。複数の標識モノマーは、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つの標識モノマーを含むことができる。用いられる標識モノマーの数は、複数の標的核酸分子の複雑さに依存して変化し得る。前記標識モノマーのそれぞれは、蛍光色素部分、蛍光部分、色素部分、及び化学発光部分からなる群から選択することができる。前記核酸プローブは、アフィニティータグをさらに含むことができる。
該生体サンプルは、組織又は細胞サンプルでもよい。該生体サンプルは、腫瘍サンプルでもよい。該腫瘍サンプルは、乳房組織サンプルでもよい。該生体サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプルでもよい。
本開示は、１つのアッセイにおいて複数の核酸分子の量を測定するための組成物及び方法を記載する。本明細書に記載される該組成物及び方法は、経路分析の発見のための橋渡し研究、多重バイオマーカーアッセイ及び診断アッセイに用いることができる。本明細書に記載される該組成物及び方法は、基準分子の合成プールからなる基準サンプルと組み合わせて、標的核酸分子の多重測定を用いて、特定の核酸発現特性を決定するために用いることができる。これらの核酸発現特性は、様々な目的、例えば個人患者における疾患状態の診断、又は疾患の予後診断のために用いることができる。
本明細書に記載される該組成物及び方法は、基準サンプルの測定と組み合わせた核酸標的測定を用い、これは基準分子の合成プールからなり、標準化ツールであった。核酸標的及び基準サンプル測定の双方は、プローブ核酸分子を用いて行なわれる。各診断用核酸分子は、標的核酸分子と特異的に結合し、診断用核酸分子と標的核酸分子間の特異的な相互作用を検出するための手段を含む。核酸標的分子のために基準サンプル標準化を用いるいくつかの例、及びプローブ核酸分子を用いたこれらの検出のための方法を、以下に提供する。
基準サンプルは、プローブ核酸分子と同一の核酸標的に対応するように特別に設計され得る。該基準サンプルは、標的核酸分子と同一又は同様の配列を含む核酸分子を含む。これらの配列は、これらが標的核酸配列と結合するように、プローブ核酸分子が、基準サンプル中で核酸配列と特異的に結合するような配列である。
サンプルの大きなコホートを、単一のバッチの試薬を用いて、橋渡し研究の一部として発現特性を用いてアッセイする場合、データは、階層クラスタリング分析又は主成分分析等の方法を用いて分析され得る。これらの統計学的技術は、これらの特性が臨床結果と関連するように、同様の特徴を有するサンプルを分類する。より困難なタスクは、分配された診断試験を用いて個人のサンプルに関する臨床結果を強固に予測する。長期にわたる、異なるロットの試薬を用いた、異なる実験室における、異なる装置上でアッセイを行なう異なる利用者の更なる変動性は、不正確な分類を導き得る。基準サンプルのプールの総合的な性質は、基準核酸分子の濃度の正確な制御を可能にし、全ての標的がアッセイの線形範囲内に存在し、全て同様の分散を有することを確実にする。合成プール基準サンプルから得られる該シグナルは、試薬のロット対ロット、場所対場所、利用者間対利用者の変動を含む様々な原因により生ずるアッセイ効率の変動を補正するために用いられ得る。この診断方法に特有の特徴は、国及び世界にわたる様々な異なる場所において、そして異なる時間において、個別のサンプルに関して行なわれる、正確且つ精度の高い結果を有する複雑な多変量アッセイを可能にする。核酸のプールは、当該技術分野において知られている任意の方法に従って合成されてもよい。これらの方法としては、ＲＮＡのインビトロ転写及び化学合成が挙げられる。
本明細書に記載される該組成物及び方法を用いて検出され得る核酸分子としては、ＲＮＡ及びＤＮＡが挙げられる。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディーングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ又は組み換えＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖でもよい。特定の特別な実施形態では、本明細書に記載される該組成物及び方法を用いて検出され得る核酸分子としては、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡの混合物が挙げられる。
核酸発現特性は、様々な生物学的活性状態及び疾患状態を代表し得る。生物学的活性状態としては、生体サンプル、臨床サンプル、及びモデルシステムの発現特性が挙げられる。核酸発現特性は、生物学的活性状態を解明するためのバイオマーカー型アッセイとともに用いられ得る。これらの生物学的活性状態は、薬物活性及び薬物機構を含む生物学的経路の理解に関連し得る。疾患状態としては、癌、感染性疾患、慢性病理、及び神経障害が挙げられる。癌としては、結腸癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、精巣癌、肺癌、又は骨肉腫が挙げられる。癌としては、白血病、リンパ腫も挙げられる。感染性疾患としては、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、肝炎、結核、コレラ、マラリア、インフルエンザ及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染が挙げられる。慢性病理としては、心血管疾患、筋ジストロフィー、多発性硬化症（ＭＳ）、骨粗鬆症、貧血症、喘息、狼瘡、自己免疫障害、肥満、糖尿病、及び代謝障害が挙げられる。神経障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、鬱病、不安障害、双極性障害、認知症、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。
検出される核酸のセットとしては、Paik et al. N. Engl. J. Med., 351(27): 2817-26、及びPaik et al. Journal of Clinical Oncology 24(23): 3726-3734 (August 2006)に記載されるものが挙げられる（これらの全体において参照により本明細書に組み込まれ、下記の実施例においてより詳細に記載される）。本明細書に記載される核酸のセットは、全体又は部分的に見出され得る。例えば、Paikらは、２１の遺伝子セットを記載する。２１の遺伝子全ての発現レベルが、本明細書に記載される方法及び組成物に従って、検出されてもよい。また、２〜２０の遺伝子の発現レベルが、本明細書に記載される方法及び組成物に従って、検出されてもよい。特定の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の遺伝子の発現レベルが、本明細書に記載される方法及び組成物に従って検出されてもよい。
検出される核酸のセットは、国際公開第０９／１５８１４３号、及び米国特許出願第２０１１／０１４５１７６号に記載されるものを含み、これらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される核酸のセットは、全体又は部分的に見出され得る。例えば、国際公開第０９／１５８１４３号、及び米国特許出願第２０１１／０１４５１７６号はそれぞれ、８つのハウスキーピング遺伝子ともに５０の遺伝子を記載する。５０の遺伝子及び／又は８つの全てのハウスキーピング遺伝子の発現レベルは、本明細書に記載される方法及び組成物に従って、検出されてもよい。また、２〜５０の遺伝子の発現レベルが、本明細書に記載される方法及び組成物に従って、検出されてもよい。特定の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０の遺伝子の発現レベルが、本明細書に記載される方法及び組成物に従って、検出されてもよい。特定の実施形態では、２、３、４、５、６、７又は８つのハウスキーピング遺伝子の発現レベルが、本明細書に記載される方法及び組成物に従って、検出されてもよい。
検出される核酸のセットとしては、van't Veer et al. Nature 415: 530-536 (January 2002)に記載されるものも挙げられる（これらの全体において参照により本明細書に組み込まれ、下記の実施例においてより詳細に記載される）。本明細書に記載される核酸のセットは、全体又は部分的に見出される。例えば、van't Veerらは、７０の遺伝子セットを記載する。全ての７０の遺伝子の発現レベルは、本明細書に記載される方法及び組成物に従って、検出されてもよい。また、２〜６９の遺伝子の発現レベルが、本明細書に記載される方法及び組成物に従って、検出されてもよい。特定の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８又は６９の遺伝子の発現レベルが、本明細書に記載される方法及び組成物に従って、検出されてもよい。
様々な疾患状態の発現特性は、疾患の存在を診断するために用いられ得る。該発現特性は、疾患に罹患する患者についての予後診断を開発及び提供するために用いられてもよい。該発現特性は、疾患についての潜在的なバイオマーカーをスクリーニングするのに、あるいは潜在的な薬物標的を発見するのに用いられてもよい。
核酸発現特性を作成するために試験される遺伝子の数は、１超の遺伝子の任意の数でもよい。これは、２〜５，０００遺伝子、２５〜１０００、５０〜５００、又は１００〜５００を含む。試験される遺伝子の数は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０でもよい。
検出される核酸分子は、生体サンプルの任意の種類から単離されてもよい。該サンプルは、ホルマリン固定及び／又はパラフィン包理、又は新鮮凍結された組織サンプルでもよい。サンプルは組織サンプル、又は体液のサンプルに由来してもよい。
該基準サンプルは、検出される標的核酸を代表する限り、核酸分子の任意の種類からなってもよい。従って、該基準サンプルは、ＲＮＡ及びＤＮＡ等の核酸分子からなってもよい。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディーングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、インビトロで転写されたＲＮＡ又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ又は組み換えＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖でもよい。該基準サンプルは、当該技術分野においてよく知られるような、オリゴヌクレオチド又は人工的に修飾された若しくは目的に合わせて調製されたオリゴヌクレオチド（例えば、塩基又は主鎖への修飾）からなってもよい。特定の特別な実施形態では、該基準サンプルは、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡの混合物からなってもよい。
該基準サンプルは、図１Ａに示されるように、規定の濃度において提供される標的核酸分子を代表する核酸分子の合成プールであってもよい。規定の濃度は、基準サンプル中の全ての核酸分子について同一の濃度であってもよい。規定の濃度は、基準サンプルにおいて代表される対応する標的核酸分子の標準化された濃度を代表することができる。該基準サンプルは、標的核酸分子の発現レベルを決定するために用いられるアッセイに対する内部対照を代表する核酸分子を含むことができる。これらの内部対照は、標的核酸分子を含むサンプル中に存在するハウスキーピング遺伝子であってもよい。
該基準サンプルは、核酸分子の合成プールを含むことができる。プールの各メンバーは、所定のアッセイについて標的核酸分子を代表し、規定の量で存在する。特定の実施形態では、基準サンプル中の合成プールのメンバーの核酸配列は、標的核酸分子の１つと核酸配列共有する。この配列を共有することにより、プールのメンバーは、対応する標的核酸分子も検出する診断用核酸分子により特異的に検出されることができる。基準サンプルの合成プールのメンバーと標的核酸の間で共有される配列は、１００％同一である。これらは、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であり得る。
複数の基準サンプルの実行は、正確な標準化を確保するために各アッセイについて行なわれ得る。基準サンプルの２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の実行が、アッセイあたり用いられ得る。
新規の基準サンプルが生産される場合、これは、特定のアッセイに用いられるプローブ核酸分子を用いて試験され得る。各診断用核酸分子についてのシグナルは、各標的に対応する基準サンプル中の核酸に対して標準化され得る。基準サンプルからのシグナルは、先に作製された基準サンプルと比べられ得る。有効である基準サンプルの新しいロットについて、１０％未満の標準偏差を有する先に作製された基準サンプルと比べて、１の平均シグナルを有するべきである。１０％未満の標準偏差を有する１の平均が達成されない場合、基準サンプルの新しいロットは、先に作製された基準サンプルとの一致を改善させるために、基準サンプル中の任意の又は全ての量の核酸分子を調節して変更することができる。基準サンプルの新しいロットと古いロット間の比較は、一致が許容されまで、繰り返され得る。
基準サンプル及び存在する対応する標的核酸分子の量は、当該技術分野において知られている任意の方法により検出され得る。これらの方法の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく分析、及びプローブアレイに基づく分析が挙げられる。特定の実施形態では、これらの方法としては、標的核酸分子の存在及び量を検出するために、標的核酸分子と特異的に結合する１又は複数のプローブを用いることが挙げられる。
プローブ又は標的核酸分子は、検出のために固体表面上に固定化され得る。適切な固体表面としては、ニトロセルロース及び遺伝子チップアレイが挙げられる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、ファイバー（例えば光ファイバー）、ガラス、又は任意の他の適切な物質上で核酸と結合する。
他の検出方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、自家持続配列複製、転写増幅システム、ローリングサークル増幅、定量ＰＣＲ、又は任意の他の核酸増幅方法に続く当業者に既知の技術を用いて増幅された分子の検出が挙げられる。斯かる分子が大変に低い数で存在する場合、これらの検出スキームは、核酸分子の検出に特に有用である。
特定の実施形態に従って、ナノレポーターは、標的核酸分子を検出するために用いることができる。ナノレポーターは、ナノレポーターコードシステム（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システム）に従って用いられ得る。ナノレポーター及びｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムの双方を、以下に詳細に記載する。
ナノレポーター
好ましくは、本開示の方法に従って用いられる核酸プローブは、ナノレポーターである。完全に組み立てられ、且つ標識されたナノレポーターは、標的分子と結合することができる標的特異的配列、及び標的特異的配列に関連するシグナルの「コード」（「ナノレポーターコード」）を発する標識された領域の二つの主な部分を含む。
ナノレポーターと標的分子が結合した場合、ナノレポーターコードは、ナノレポーターと結合した標的分子を同定する。
単数形のナノレポーターとして本明細書で称される多くのナノレポーターは、１つの分子体から構成される。しかしながら、ナノレポーターの特異性の増加及び／又は標的分子とのその結合の動特性の改良に好ましいレポーターは、同一の標的分子の異なる領域と結合する異なる標的特異的配列をそれぞれ含む、２つの分子体から構成されるデュアルナノレポーターである。ナノレポーターを含むプローブは、「ナノレポータープローブ」として本明細書で称される。デュアルナノレポーターでは、２つのナノレポータープローブのうち少なくとも１つが標識される。この標識されたナノレポータープローブは、「レポータープローブ」と称される。他のナノレポータープローブは、必ずしも標識されない。デュアルナノレポーターのかかる未標識の構成要素は、「捕捉プローブ」として本明細書で称され、複合体の可視化及びイメージングを可能にするために、デュアルナノレポーター及び標的分子を含む複合体の固定化及び／又は伸長に有用である、付着されたアフィニティータグ、例えばビオチンをしばしば有する。双方のプローブが標識される、あるいは双方がアフィニティータグを有する場合、より多くの標識モノマー付着領域を有するプローブは、レポータープローブと称され、そして該ペア中の他のプローブは、捕捉プローブとして称される。
シングル及びデュアルナノレポーターの双方について、完全に組み立てられ、且つ標識されたナノレポータープローブは、標的分子と結合することができる標的特異的配列、及び標的特異的配列に関連するシグナルの「コード」を提供する標識された部分、の主に二つの部分を含む。ナノレポータープローブと標的分子が結合した場合、該コードは、ナノレポーターと結合した標的分子を同定する。
ナノレポーターは、モジュラー構造である。実施形態によっては、該ナノレポーターは、複数の異なる検出可能な分子を含む。実施形態によっては、標識されたナノレポーターは、特定の基本要素：（ｉ）特定の特有の線形組み合わせで付着された複数の特有の標識付着領域、及び（ｉｉ）主鎖の標識付着領域に付着する相補的なポリヌクレオチド配列を含むモジュラー体である。実施形態によっては、標識されたナノレポーターは、特定の特有の線形組み合わせで付着された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の特有の標識付着領域、及び主鎖の標識付着領域に付着する相補的なポリヌクレオチド配列を含む。実施形態によっては、標識されたナノレポーターは、特定の特有の線形組み合わせで付着された６又はそれ以上の特有の標識付着領域、及び主鎖の標識付着領域に付着する相補的なポリヌクレオチド配列を含む。ナノレポータープローブは、主鎖にも付着する標的特異的配列をさらに含む。
標識付着領域なる用語は、検出可能な分子について個別の付着点として役割を果たし得る、所定の主鎖内で規定されたポリヌクレオチド配列の領域を含む。
実施形態によっては、標識ナノレポーターは、定常領域を含む主鎖も含む。定常領域なる用語は、ナノレポーターと共有結合する約１０〜約２５ヌクレオチドのタンデム反復配列を含む。定常領域は、ナノレポーターの５'領域又は３'領域のいずれかに付着し得、例えば、定常領域と相補的な配列を固相基板に付着させることにより、イメージング又は検出のためのナノレポーターの捕捉及び固定化のために用いられ得る。特定の態様では、該定常領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のタンデム反復配列を含み、ここで該反復配列のそれぞれは、約１２〜１８、１３−１７、又は約１４〜１６ヌクレオチドを含む、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上のヌクレオチドを含む。
本明細書に記載されるナノレポーターは、合成の設計された配列を含み得る。実施形態によっては、該配列は、主鎖中にかなり一定間隔のパターンのヌクレオチド（例えば、アデニン）残基を含む。実施形態によっては、ヌクレオチドは、少なくとも平均で８、９、１０、１２、１５、１６、２０、３０、又は５０塩基間隔で配置される。実施形態によっては、ヌクレオチドは、少なくとも平均で８〜１６塩基間隔で配置される。実施形態によっては、ヌクレオチドは、少なくとも平均で８塩基間隔で配置される。これは、検出可能な分子をこれに付着させる相補的なポリヌクレオチド配列中の一定間隔に配置された相補的なヌクレオチドを可能にする。例えば、実施形態によっては、ナノレポーター配列が、主鎖中に、その相補鎖が相補的なＲＮＡ部分中の一定間隔のパターンのウリジン（Ｕ）残基である、かなり一定間隔のパターンのアデニン（Ａ）残基を含む場合、該部分のインビトロ転写は、該部分にわたり一定間隔で色素分子の共有結合的アミン結合を可能にする、アミノアリル修飾ウリジン塩基を用いて行なわれ得る。実施形態によっては、該配列は、配列中に少なくとも平均で８、９、１０、１２、１５、１６、２０、３０、又は５０塩基間隔で配置される約同数又はパーセンテージのヌクレオチド（例えば、アデニン）を含む。これは、検出可能な分子をこれに付着させる相補的なポリヌクレオチド配列中の同様の数又はパーセンテージを可能にする。従って、実施形態によっては、該配列は、一定間隔ではないが、少なくとも平均で８、９、１０、１２、１５、１６、２０、３０、又は５０塩基間隔で配置されたヌクレオチドを含む。実施形態によっては、相補的なヌクレオチドの２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％は、検出可能な分子と結合する。例えば、実施形態によっては、ナノレポーター配列が、主鎖中に同様のパーセンテージのアデニン残基を含み、相補的な部分のインビトロ転写が、アミノアリル修飾ウリジン塩基を用いて行なわれる場合、アミノアリル修飾ウリジン塩基の２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％は、検出可能な分子と結合し得る。あるいは、アミノアリル修飾ウリジン塩基とウリジン塩基の比は、検出可能な分子に付着し得る部位の所望の数を達成するために、インビトロ転写プロセス間で変化し得る。例えば、インビトロ転写プロセスは、幾らか又は全てのアミノアリル修飾ウリジン塩基が、検出可能な分子と結合し得る場合、１／１のウリジン対アミノアリル修飾ウリジン塩基の比を有する混合物の存在下で行なわれ得る。
実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、かなり一貫した融解温度（Ｔm）を有する。何れの理論にも限定されることなく、本明細書に記載されるナノレポーターのＴmは、ナノレポーター主鎖と検出可能な分子をこれに付着させる相補的なポリヌクレオチド配列間の強い結合を提供し、それ故、合成及びハイブリダイゼーション手順間の解離を防ぐ。加えて、ナノレポーターの集団間における一貫したＴmは、最適な条件が全てのスポット及び位置について同一であるので、合成及びハイブリダイゼーション手順間を厳密に最適化することを可能にする。実施形態によっては、ナノレポーターの配列は、列中にわずか３つのＧしか有さない、５０％グアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）を有する。従って、実施形態によっては、本開示は、集団中のナノレポーター間のＴmがかなり一貫している、ナノレポーターの集団を提供する。実施形態によっては、本開示は、その標識付着領域とハイブリダイゼーションする場合、相補的なポリヌクレオチド配列のＴmが、約８０℃、８５℃、９０℃、１００℃又はそれ以上である、ナノレポーターの集団を提供する。実施形態によっては、本開示は、その標識付着領域とハイブリダイゼーションする場合、相補的なポリヌクレオチド配列のＴmが約８０℃以上であるナノレポーターの集団を提供する。
実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、最小の構造を有するか、又は二次構造、例えば任意の安定的な分子内塩基対形成相互作用（例えば、ヘアピン）を有さない。何れの理論にも限定されることなく、ナノレポーターにおける最小の二次構造は、ナノレポーター主鎖及び検出可能な分子をこれに付着させるポリヌクレオチド配列間の優れたハイブリダイゼーションを提供する。加えて、ナノレポーターにおける最小の二次構造は、ナノレポーターにおける検出可能な分子の優れた検出を提供する。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、７５℃、１Ｘ ＳＳＰＥのアニーリング条件下で、著しい分子内対形成をしない。二次構造は、当該技術分野において知られているプログラム、例えばＭＦＯＬＤにより予測され得る。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、各鎖中に１％未満の逆方向反復を含み、ここで、逆方向反復は、９塩基以上である。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、各鎖中に逆方向反復を含む。実施形態によっては、該ナノレポーターは、１１００塩基対長である配列にわたり、９ヌクレオチド以上の任意の逆方向反復を含まない。実施形態によっては、該ナノレポーターは、任意の１００塩基対領域にわたり、７ヌクレオチド以上の任意の逆方向反復を含まない。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、各鎖中に１％未満の逆方向反復を含み、ここで、１１００塩基対長である配列にわたり、逆方向反復は、９塩基以上である。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、各鎖中に１％未満の逆方向反復を含み、ここで、任意の１００塩基対領域である配列にわたり、逆方向反復は、７塩基以上である。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、１つの鎖がＣＴリッチであり、他方がＧＡリッチであるように、偏った鎖特異的含量を含む。
本開示は、ユニークなナノレポーターも提供する。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、１％未満の直接反復を含む。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、直接反復を含まない。実施形態によっては、該ナノレポーターは、１１００塩基対長である配列にわたり、９ヌクレオチド以上の任意の直接反復を含まない。実施形態によっては、標識されたナノレポーターは、任意の１００塩基対領域にわたり、７ヌクレオチド以上の任意の直接反復を含まない。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、各鎖中に１％未満の直接反復を含み、ここで、１１００塩基対長である配列にわたり、直接反復は、９ヌクレオチド以上である。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、各鎖中に１％未満の直接反復を含み、ここで、任意の１００塩基対領域にわたり、直接反復は、７ヌクレオチド以上である。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、主鎖に用いられる任意の他の配列と、あるいはＲＥＦＳＥＱ公開データベースに記載される任意の配列と８５、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、又は５％未満のホモロジーを含む。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、主鎖に用いられる任意の他の配列と、あるいはＲＥＦＳＥＱ公開データベースに記載される任意の配列と８５％未満のホモロジーを含む。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、主鎖に用いられる任意の他の配列と、あるいはＲＥＦＳＥＱ公開データベースに記載される任意の配列とホモロジーの２０、１６、１５、１０、９、７、５、３、又は２未満の隣接する塩基を含む。実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポーターは、ナノレポーターの全長にわたり、主鎖に用いられる任意の他の配列と、あるいはＲＥＦＳＥＱ公開データベースに記載される任意の配列と、ホモロジーの１５以内の隣接する塩基、及び８５％以内の同一性を有する。
実施形態によっては、本明細書に記載されるナノレポータープローブの配列特性は、標的分子の感度の高い検出を提供する。例えば、標的分子の同定をもたらすナノレポータープローブの標的分子との結合は、ナノレポーターの存在下での個別の検出により行なわれ得る。これは、サンプル中の１又は複数のナノレポーターの存在を個別に計測することにより行なわれ得る。
ナノレポーター主鎖に付着する相補的なポリヌクレオチド配列は、ナノレポーター主鎖に、検出可能な分子又は標識モノマーを付着させる役割を果たす。相補的なポリヌクレオチド配列は、例えば相補的なポリヌクレオチド配列への１又は複数の検出可能な分子の共有結合的な組み込みにより、直接的に標識されてもよい。あるいは、相補的なポリヌクレオチド配列は、例えば相補的なポリヌクレオチド配列へのビオチン又は特異的なリガンド相互作用を可能にする他の分子の組み込みにより、間接的に標識されてもよい。かかる相互作用では、リガンド（例えば、相補的なポリヌクレオチド配列へのビオチン組み込みの場合、ストレプトアビジン）は、検出可能な分子に共有結合により付着してもよい。標識付着領域に付着する検出可能な分子は、相補的なポリヌクレオチド配列へ直接的に組み込まれない場合、この配列は、検出可能な分子及び標識付着領域の間の橋渡しとして役割を果たしてもよく、架橋分子、例えば架橋核酸として称されてもよい。
本明細書に記載される核酸に基づくナノレポーター及びナノレポーター−標的複合体は、核酸を含み、これは核酸、例えば定常領域又はナノレポーター又は標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを用いてアフィニティー精製又は固定化されてもよい。上述のように、実施形態によっては、該ナノレポーターは、精製及び／又は（例えば、固相表面への）固定化のためのフィニティータグとして役割を果たす少なくとも一つの定常領域を含む。定常領域は、典型的に、反復ヌクレオチドの２又はそれ以上のタンデム反復領域、例えば一連の１５塩基反復を典型的に含む。かかる典型的な実施形態では、標的分子又は他のものと複合体化したナノレポーターは、反復単位の逆相補鎖である１５塩基オリゴヌクレオチドでコートされるアフィニティー試薬により精製又は固定化され得る。
ナノレポーター、又はナノレポーター−標的分子複合体は、２又はそれ以上のアフィニティー選択工程で精製され得る。例えば、デュアルナノレポーターにおいて、１つのプローブは、第一のアフィニティータグを含み得、他のプローブは、第二の（異なる）アフィニティータグを含み得る。該プローブは、標的分子と混合され、そしてデュアルナノレポーターの２つのプローブを含む複合体は、１又は複数の個別のアフィニティータグに対するアフィニティー精製により、未結合の材料（例えば、標的又はナノレポーターの個別のプローブ）から分離される。第一の工程では、該混合物は、第一のアフィニティータグを含むプローブ及び所望の複合体のみが精製されるように、第一アフィニティータグに対するアフィニティー試薬と結合し得る。結合した材料は、第一のアフィニティー試薬から放出され、そして任意で第二のアフィニティータグのためのアフィニティー試薬と結合し、第一のアフィニティータグを含むプローブから複合体の分離を可能にする。この時点で、完全な複合体のみが結合する。複合体は、第二のアフィニティータグのためにアフィニティー試薬から最終的に放出され、その後、好ましくは、伸長及びイメージングされる。アフィニティー試薬は、アフィニティータグについての結合パートナーでコートされた任意の固体表面、例えばカラム、ビーズ（例えば、ラテックス又は磁気ビーズ）、又は結合パートナーでコートされたスライドでもよい。アフィニティー試薬を用いたナノレポーターの固定化及び伸長は、米国特許出願第２０１０／０１６１０２６号に完全に記載され、この全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
所定のナノレポーターの主鎖の様々な標識付着領域に関連する標識モノマーにより提供されるシグナルの配列は、ナノレポーター特有の同定を可能にする。例えば、蛍光標識を用いる場合、特有の同定又は特有のスペクトル特性を有するナノレポーターは、特異的な標的分子又はこれらの部分を認識する標的特異的配列と関連する。標的分子とナノレポーターの標的特異的配列との結合を可能にする条件下で、ナノレポーターが標的分子を含む混合物中に曝露される場合、標的特異的配列は、優先的に標的分子と結合する。ナノレポーターに関連するナノレポーターシグナル、例えば蛍光標識されたナノレポーターのスペクトルコードの検出は、混合物中の標的分子の存在の検出を可能にする（定性分析）。所定のスペクトルコード又は特性に関連する全ての標識モノマーを計測することは、ナノレポーターと結合した標的特異的配列に関連する混合物中の全ての分子の計測を可能にする（定量分析）。ナノレポーターは、従って、既知の生物学的マーカーの定量分析により、異なる生物学的状態（例えば、疾患対健康）の診断又は予後診断に有用である。さらに、本明細書に記載されるナノレポーターにより提供される個別の分子検出及び定量化の著しく高い感度は、様々な生物学的状態において変動が大変に僅かであるものを含む、新規の診断及び予後マーカーの同定を可能にし、従来の分子的方法を用いた特定の生物学的状態との相関性を見つける。ナノレポーターに基づく分子検出の感度は、小さな生体サンプル中の治療薬剤及び診断試薬の詳細な薬物動態分析を可能にする。
単数のナノレポーターとして称される多くのナノレポーターは、１つの分子体から構成される。しかしながら、ナノレポーターの特異性を増加させるために、ナノレポーターは、同一の標的分子の異なる領域と結合する異なる標的特異的配列をそれぞれ含む、２つの分子体から構成されるデュアルナノレポーターでもよい。デュアルナノレポーターでは、２つの分子体のうち少なくとも１つが標識される。他の分子体は、必ずしも標識される必要はない。デュアルナノレポーターのかかる未標識の構成要素は、捕捉プローブとして本明細書で用いられ、任意で付着されたアフィニティータグ、例えばビオチンを有し、これは、複合体の可視化及び／又はイメージングを可能にするために、デュアルナノレポーター及び標的分子を含む複合体の固定化及び／又は伸長に有用である。例えば、実施形態によっては、６位のナノレポーターコードを有するデュアルナノレポーターは、１つの６位のコードされたナノレポーター（本明細書でレポータープローブとも称される）及び捕捉プローブを用いる。実施形態によっては、６位のナノレポーターコードを有するデュアルナノレポーターは、アフィニティータグを有する１つの捕捉プローブ、及び１つの６位のナノレポーター構成要素を用いて、用いられ得る。実施形態によっては、アフィニティータグが任意で含まれ、そしてナノレポーターを精製するために、あるいは、イメージングの目的のためにナノレポーター（又はナノレポーター−標的分子複合体）を固定化するために、用いられ得る。
実施形態によっては、各ナノレポーター内の個別の標識付着領域のヌクレオチド配列は、ナノレポーター内の他の標識付着領域のヌクレオチド配列と異なり、標識ポリヌクレオチド配列の組み替え、共有又は交換などの再構成を防ぐ。主鎖上に形成される標識付着領域の数は、主鎖の長さ及び性質、ナノレポーターを標識する手段、及び主鎖の標識付着領域に付着するシグナルを提供する標識モノマーの種類に基づく。実施形態によっては、各標識付着領域の相補的なヌクレオチド配列は、特定の検出可能な分子が割り当てられる。
本開示は、標識されたナノレポーターであって、１又は複数の標識付着領域が対応する検出可能な分子と付着し、各検出可能な分子はシグナルを提供する、ナノレポーターを提供する。例えば、実施形態によっては、本開示の標識されたナノレポーターは、少なくとも３つの検出可能な分子が、３つの対応する主鎖の標識付着領域に付着する場合に、これらの標識された標識付着領域又はスポットがこれらの特有の線形配置に基づいて識別することができるように、得られる。ナノレポーター検出において、「スポット」とは、ナノレポーター上の単一の標識付着部位に付着する標識モノマーから検出される凝集シグナルであり、これは、標識モノマー上の標識付着領域のサイズ及び性質（例えば、主な発光波長）に応じて、顕微鏡下で可視化される場合、単一の光源として現れてもよい。ナノレポーターからのスポットは、重複しても、重複しなくてもよい。その標的分子を同定するナノレポーターコードは、スポットの長さの任意の順列、他のスポットに対するその位置、及び／又はそのシグナルの性質（例えば、主な発光波長）を含み得る。一般的に、本明細書に記載される各プローブ又はプローブ対について、隣接する標識付着領域は、重複せず、そして／あるいは隣接する標識付着領域からのスポットは、少なくとも検出条件下で（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１０／０１１２７１０号に記載されるように、顕微鏡下でナノレポーターが固定化、伸長、及び観察される場合）、空間的及び／又はスペクトル的に識別することができる。
時折、特定の数の塩基又はヌクレオチドとして、スポットサイズを参照する。当業者に容易に理解されるように、対応する標識付着領域中の塩基又はヌクレオチドの数を参照する。
ナノレポーターからのスポットの順序及び性質（例えば、主な発光波長、任意で長さ）は、ナノレポーターの標的特異配列を介してナノレポーターにより結合することができる標的分子を同定するナノレポーターコードとして役割を果たす。ナノレポーターが標的分子と結合する場合、ナノレポーターコードはまた、標的分子を同定する。任意で、スポットの長さは、ナノレポーターコードの構成要素でもあり得る。
主鎖の異なる標識付着領域に関連するシグナルを提供する検出可能な分子は、検出条件下で識別できないシグナル（「類似の（ｌｉｋｅ）」シグナル）を提供する、あるいは少なくとも検出条件下で（例えば、ナノレポーターが固定化、伸長、及び顕微鏡下で観察される場合）識別できるシグナルを提供する。
本開示は、２又はそれ以上の検出可能な分子は標識付着領域に付着するナノレポーターを提供する。前記標識付着領域に関連する検出可能な分子により提供されるシグナルは、検出される凝集シグナルを生産する。生成される凝集シグナルは、類似のシグナル、又は少なくとも２つの識別可能なシグナル（例えば、スペクトル的に識別可能なシグナル）で構成されてもよい。
１つの実施形態では、ナノレポーターは、主鎖の３つの対応する標識付着領域に付着する類似のシグナルを提供する少なくとも３つの検出可能な分子を含み、前記３つの検出可能な分子は、空間的に識別可能である。別の実施形態では、ナノレポーターは、３つの近接する標識付着領域、例えば３つの隣接する標識付着領域に付着する３つの識別可能なシグナルを提供する、少なくとも３つの検出可能な分子を含み、これにより、前記少なくとも３つの標識モノマーは、スペクトル的に識別可能である。
他の実施形態では、ナノレポーターは、スペーサー領域により隔てられた類似又は非類似のシグナルを提供するスポットを含み、これにより、スペーサー領域の組み込みは、特有の検出可能なシグナルの潜在的な組み合わせを拡張するダークスポットの生成を可能にする。用語「ダークスポット」とは、ナノレポーター上の標識付着部位からのシグナルの欠乏を意味する。ダークスポットは、多くのコーディング順列を加え、ナノレポーター集団中の優れたナノレポーター密度を生成するために、ナノレポーターコードに組み込まれ得る。１つの実施形態では、スペーサー領域は、ナノレポーターの検出に用いられる装置の解像度により決定される長さを有する。
他の実施形態では、ナノレポーターは、１又は複数の「ダブルスポット」を含む。各ダブルスポットは、スペーサー領域により隔てられることなく、類似のシグナルを提供する２又はそれ以上（例えば、３、４、又は５）の隣接するスポットを含む。ダブルスポットは、これらのサイズにより同定され得る。
本明細書に記載されるシグナルを提供する検出可能な分子は、標識付着領域に付着する相補的なポリヌクレオチド配列と共有結合又は非共有結合により（例えば、ハイブリダイゼーションを介して）付着してもよい。標識モノマーは、例えば、相補的なポリヌクレオチド配列に組み込まれた分子（例えば、相補的なポリヌクレオチド配列に組み込まれたビオチン）との相互作用を介して付着するリガンド分子（例えば、ストレプトアビジン）との共有結合による付着により、相補的なポリヌクレオチド配列と間接的に付着し得、これは同様に、主鎖とハイブリダイゼーションを介して付着する。
ナノレポーターは、ナノレポーターの主鎖上の標識付着領域と（例えば、間接的に）付着する標識モノマーにより提供されるシグナルの配列により決定される、特有の検出可能なシグナル、例えばスペクトルコードと関連し得、これによりシグナルの検出は、ナノレポーターの同定を可能にする。
他の実施形態では、ナノレポーターは、アフィニティータグの支持体への付着が、主鎖伸長及び主鎖上の異なる標識付着領域に対応する標識モノマーにより提供されるシグナルの解析を可能にするような、レポータープローブ主鎖に付着するアフィニティータグも含む。ナノレポーター伸長は、物理的、流体力学的又は電気的手段等の手段を限定することなく含む、当該技術分野において知られている任意の伸長手段を含み得る。該アフィニティータグは、定常領域を含んでもよい。
他の実施形態では、ナノレポーターはまた、主鎖と結合した標的特異的配列も含む。該標的特異的配列は、選択され、ナノレポーターが標的分子を認識、結合、又は付着することを可能にする。本明細書に記載されるナノレポーターは、全ての種類の標的分子の同定に適している。例えば、適切な標的特異的配列は、ナノレポーターの主鎖と結合し得、標的分子の検出を可能にする。好ましくは、該標的分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
本開示の１つの実施形態は、本明細書に記載される標識モノマーを用いた標的分子検出において、増加した適応性（flexibility）を提供する。この実施形態では、隔たれた標的特異的領域をそれぞれ有する２つの異なる分子体を含むデュアルナノレポーターであって、そのうちの少なくとも１つは標識されるデュアルナノレポーターは、同一の標的分子と結合する。従って、デュアルナノレポーターの２つの構成要素の標的特異的配列は、選択される標的分子の異なる部分と結合し、これにより、デュアルナノレポーターに関連するスペクトルコードの検出は、前記デュアルナノレポーターと接触する生体分子サンプル中の選択された標的分子の検出を提供する。
本開示は、生体分子サンプル中の特定の標的分子の存在を検出する方法であって、（ｉ）デュアルナノレポーター中の標的特異的配列と、標的分子との結合を可能にする条件下で、前記サンプルと本明細書に記載されるナノレポーターとを接触させ、そして（ｉｉ）デュアルナノレポーターに関連するスペクトルコードを検出することを含む方法も提供する。ナノレポーター構成に応じて、デュアルナノレポーターは、標的分子との結合前又は後に標識されてもよい。
プローブの集団中の各ナノレポータープローブの独自性は、複数の標的分子の多重解析を可能にする。例えば、実施形態によっては、各ナノレポータープローブは、各主鎖の各標識付着領域が、同一の主鎖中の他の標識付着領域と異なる、６つの標識付着領域を含む。標識付着領域が４色のうち１色で標識され、標識付着領域について２４の可能な独自の配列が存在し、そして各標識付着領域が特定の色を指定する場合、各主鎖中の各標識付着領域は、４つの配列の内の１つからなる。この実施例において、４０９６の潜在的なナノレポーターが存在し得る。潜在的なナノレポーターの数は、色の数の増加、標識付着領域について独自の配列の数の増加、及び／又は主鎖当たりの標識付着領域の数の増加により、増加させることができる。同様に、潜在的なナノレポーターの数は、色の数の減少、標識付着領域について独自の配列の数の減少、及び／又は主鎖当たりの標識付着領域の数の減少により、減少させることができる。
特定の実施形態では、検出の方法は、多重アッセイで行なわれ、これにより、複数の標的分子は、同一のアッセイ（単一反応混合物）において検出される。好ましい実施形態では、該アッセイは、複数の標的分子が同時に検出されるハイブリダイゼーションアッセイである。特定の実施形態では、同一のアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、少なくとも２つの異なる標的分子、少なくとも５つの異なる標的分子、少なくとも１０の異なる標的分子、少なくとも２０の異なる標的分子、少なくとも５０の異なる標的分子、少なくとも７５の異なる標的分子、少なくとも１００の異なる標的分子、少なくとも２００の異なる標的分子、少なくとも５００の異なる標的分子、少なくとも７５０の異なる標的分子、又は少なくとも１０００の異なる標的分子である。他の実施形態では、同一のアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、最大５０の異なる標的分子、最大１００の異なる標的分子、最大１５０の異なる標的分子、最大２００の異なる標的分子、最大３００の異なる標的分子、最大５００の異なる標的分子、最大７５０の異なる標的分子、最大１０００の異なる標的分子、最大２０００の異なる標的分子、又は最大５０００の異なる標的分子である。更に他の実施形態では、検出される複数の標的分子は、前述の数の範囲の異なる標的分子、限定しないが、例えば２０〜５０の異なる標的分子、５０〜２００の異なる標的分子、１００〜１０００の異なる標的分子、５００〜５０００の異なる標的分子等である。
nCounter（登録商標）
NanoString nCounter（登録商標）分析システムを、任意又は全ての上述の遺伝子の発現レベルを決定するために用いることができる。NanoString nCounter（登録商標）分析システム（本明細書で、ナノレポーターコードシステムとしても称される）は、比較的豊富な数百のｍＲＮＡ転写産物のデジタル読み取りを介して、遺伝子発現の直接的な多重測定を実行する。nCounter（登録商標）分析システムは、結果において、バイアスを導入し得る任意の酵素反応を取り除く、溶液中のｍＲＮＡサンプルと直接的にハイブリダイズする遺伝子特異的プローブ対を使用する（図２）。ハイブリダイゼーション後、全てのサンプル処理工程は、nCounter（登録商標）Prep Station上で自動化される。まず、過剰の捕捉及びレポータープローブは、除去され（図３）、その後、ストレプトアビジン−ビオチン結合を介してnCounter（登録商標）カートリッジの表面上のランダムな位置にプローブ−標的複合体が結合する（図４）。最後に、プローブ／標的複合体は、nCounter（登録商標）サンプルカートリッジにおいて整列及び固定化される（図５）。該レポータープローブは、蛍光シグナルを運び；該捕捉プローブは、複合体がデータ収集のために固定化することを可能にする。特定の遺伝子にそれぞれ特異的な最大８００対のプローブは、CodeSetを形成する一連の内部対照と組み合わされ得る。サンプル処理の完了後、サンプルカートリッジは、データ収集のために、nCounter（登録商標）Digital Analyzer中に置かれる。対象の各標的分子は、レポータープローブ上に存在する６つの整列した蛍光スポットにより生成される「カラーコード」により同定される。カートリッジの表面上のレポータープローブは、その後各標的分子について計測され、集計される（図６）。
nCounter（登録商標）分析システムは、ハイブリダイゼーション後の処理に用いられるnCounter（登録商標）Prep Station、及びデータ収集及び解析に用いられるDigital Analyzerの２つの装置からなる。該アッセイは、ヒートブロック、及びＲＮＡ抽出のためのマイクロ遠心分離機、及びＲＮＡ生成物の濃度及び純度を測定するための低容量の分光光度計も要求する。加熱蓋を有するヒートブロックは、一定の上昇した温度においてハイブリダイゼーションを行なうために要求され、スイングバケット遠心分離装置は、Prep Stationへの挿入前に、Prep Platesをスピンするために要求される。
nCounter（登録商標）Prep Stationは、nCounter（登録商標）Digital Analyzer上でのデータ回収のためにこれらを調製するために、ハイブリダイゼーション後にサンプルを処理する自動液体ハンドリングロボットである。Prep Station上での処理の前に、ＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包理）組織サンプル又は他のサンプル種から抽出された合計ＲＮＡ又は他のＲＮＡ分子は、nCounter（登録商標）プロトコールに従って、レポータープローブ及び捕捉プローブとハイブリダイズする。標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、過剰なプローブにより行なわれる。これらのハイブリダイズした分子を正確に分析するために、これらは、ハイブリダイゼーション反応中の残る過剰なプローブから、まず精製される。Prep Stationは、２つの連続する磁性ビーズ精製工程を用いて、過剰なレポーター及び捕捉プローブからハイブリダイズしたｍＲＮＡ分子を単離する。これらのアフィニティー精製は、捕捉プローブ及びレポータープローブの双方と結合するｍＲＮＡ分子の３つの部分からなる複合体のみを保持するカスタムオリゴヌクレオチド修飾された磁性ビーズを用いる。次に、３つの部分からなる複合体のこの溶液は、NanoStringサンプルカートリッジ中のフローセルを介して洗浄される。このフローセルの１つの表面は、共有結合したストレプトアビジンを密に含浸させたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ハイドロゲルでコートされる。溶液がフローセルを通過するので、３つの部分からなる複合体は、各捕捉プローブに組み込まれるビオチン分子を介してハイドロゲル中のストレプトアビジンと結合する。ＰＥＧハイドロゲルは、３つの部分からなる複合体が、特異的に結合し得るストレプトアビジン濃厚表面を提供するだけではなく、任意の残る過剰なレポータープローブの非特異的な結合も阻害する。
複合体がフローセル表面と結合した後、電場は、各レポータープローブを構成する蛍光スポットの光学的同定及び整列を容易にするために、各サンプルカートリッジフローセルの長さに従って適用される。レポータープローブは、帯電した核酸であるので、印加電圧は、電場に従って、これらを均一に伸長及び方向付けるこれらに力を与える。電圧は印加される一方で、Prep Stationは、場が除去された後、細長い配置中のレポーターを閉じ込める固定化試薬を添加する。一度レポーターが固定化されると、カートリッジは、データ収集のためにnCounter（登録商標）Digital Analyzerに移され得る。Prep Station上でのサンプル処理のために要求される消耗される構成要素及び試薬は、nCounter（登録商標）Masterキットで提供される。これらの試薬は、nCounter（登録商標）Prep Stationのデッキ上でロードする準備がされ、約２時間において、１運転当たり１２のフローセルを含むサンプルカートリッジを処理することができる。１２のフローセルは、特定の試験に要求される、試験サンプル及び基準サンプルの混合物を含み得る。
nCounter（登録商標）Digital Analyzerは、顕微鏡対物レンズを介してＣＣＤカメラを用いたサンプルカートリッジ中の固定化された蛍光レポーターのイメージを得ることによりデータを収集する。蛍光レポータープローブは、可視光の波長よりも小さい特徴を有する小さい、単一の分子バーコードであるので、Digital Analyzerは、蛍光バーコード中のスポットの配列を解明するために、高い磁場、回折限界イメージングを用いる。Digital Analyzerは、数百又は数千の別々のレポータープローブをそれぞれ含み得る数百の連続する視野（ＦＯＶ）を捕捉する。各ＦＯＶは、異なる波長において捕捉される４つの単色イメージの組み合わせである。得られる重ね合わせは、青、緑、黄、及び赤の４色のイメージであると考えられ得る。各４色のＦＯＶは、ほんの数秒捕捉され、サンプル中の各蛍光バーコードについて「カウント」を提供するために、リアルタイムで処理される。各バーコードは、単一のｍＲＮＡ分子又は他の試験される核酸分子を特異的に同定するので、Digital Analyzerからの結果として生じるデータは、生体サンプル中の豊富な各ｍＲＮＡ又は対象の核酸の正確な目録である（図６）。
Digital Analyzerから得られる試験サンプルデータは、試験結果を生成するために、基準サンプルデータに対して標準化される。他の変換は、試験結果を一般化するためのアルゴリズムの一部として含まれてもよいが、記載される方法において、少なくとも１つの工程は、基準サンプルに対する試験サンプルデータの標準化を含む。
キット
本開示は、診断用キットも提供する。該キットは、サンプルからの核酸分子の抽出のための組成物を含み得る。これらの抽出に用いられる任意の既知の組成物を、用いてもよい。該キットは、サンプル中の標的核酸分子の検出のための一組のプローブ核酸分子を含み得る。該キットは、検出される標的核酸分子に対応する核酸分子の合成プールを組み込む基準サンプルを含み得る。基準サンプル中の各核酸分子は、既知の量で存在し得る。該キットは、診断用核酸分子のハイブリダイゼーション、精製、固定化、及びイメージングのための試薬、並びに基準サンプルシグナルに対して試験サンプルシグナルを標準化するために必要な任意のアルゴリズム及び／又はソフトウェアを含み得る。
実施例
実施例１．マルチ遺伝子基準サンプルの設計及び合成
本実施例は、５８の核酸標的遺伝子からなる基準サンプルを記載する。多変量遺伝子アッセイに使用のための基準サンプルを作製するために要求される各工程とともに、基準サンプルの設計を以下に記載する。以下の記載は５８の核酸標的遺伝子に関する一方で、これらの提供される技術に従って、当業者が他の核酸に対する基準サンプルを設計することができることを理解する。５８の標的遺伝子を検出するための基準サンプルの増幅は、下記の別の実施例に記載される。
５８の核酸標的遺伝子のためのプラスミド構築及び合成
全ての５８の基準サンプルプラスミドを、Blue Heron Biotechnologyにより調製されるｐＵＣ１１９の独占的な誘導体である、同一の３１７１ｂｐのベクター骨格において構築した。Blue Heron Biotechnologyにより、該プラスミドを調製し、大腸菌に形質転換し、精製した。精製しプラスミド及び大腸菌スタブの双方が提供された。５８のプラスミドのそれぞれは、表１のように、３'ＣＴＴＴＣ及び５'ＧＡＡＡＧ間に挿入された、対象の遺伝子配列（即ち、核酸標的）の断片に対応する特有の２７９ｂｐのインサートを有する。表に示されるプラスミド名は、全て大文字の遺伝子名を含む。
プラスミド形質転換及び精製
上記の精製されたプラスミドのそれぞれは、ＰＣＲ増幅反応に直接用いることができる（下記を参照のこと）。より多くのプラスミド鋳型が望まれる場合、各プラスミドは、大腸菌に形質転換され、その後標準的な分子生物学プロトコールを用いて、精製され得る。各プラスミドの濃度を、精製後に分光光度計で測定した。
精製されたプラスミドのＰＣＲ増幅
各プラスミド（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８中に希釈された５０ｎｇ／μＬ）を以下の成分を含む別々のＰＣＲ反応により増幅した。
共通のフォワードプライマー（Ｔ７）及び遺伝子特異的リバースプライマーを選択し、各核酸標的について２７９塩基対インサートを増幅した。
標準的なスケールは、５０μＬ反応容量である。該反応は、適宜、表２の比率で調整され、スケールアップ又はダウンされ得る。ＳＦＲＰ１を除いて、各プラスミドを、以下のプログラムを用いてサーモサイクラー上で増幅させた。
初期の変性：９４℃ ３分間
３０ｘサイクル：変性： ９４℃ ３０秒間
アニール：５５℃ ３０秒間
伸長： ７２℃ ３０秒間
最後の伸長：７２℃ １５分間
４℃ 放置
ＳＦＲＰ１について、以下のプログラムを用いてサーモサイクラー上で反応を実行した。
初期の変性：９４℃ ３分間
３０ｘサイクル：変性： ９４℃ ３０秒間
アニール：６５℃ ３０秒間
伸長： ７２℃ ３０秒間
最後の伸長：７２℃ １５分間
４℃ 放置
全長の増幅産物を、Qiagen QIAquick PCR精製キットを用いて精製し、キットに同梱される３０μＬの溶出バッファに溶出した。精製されたＰＣＲ産物の濃度をNanodrop分光光度計の「ｄｓＤＮＡ」モードを用いて決定した。ＰＣＲ産物が、基準としてハイパーラダーＩＶに対して比較される場合、得られたＰＣＲ産物を、SYBR goldで染色した１．８％アガロースゲルを用いて分析する。得られるＰＣＲ増副産物の主なバンドは、予想され、いくつかの代表的なＰＣＲ産物について図７に示されるように、３００ｂｐマーカーの近くに泳動される。
インビトロで転写されたＲＮＡ産物の調製
５８の核酸標的のそれぞれについてのインビトロで転写された（ＩＶＴ）ＲＮＡ産物は、Ambionにより製造されるMEGAShortscript T7キットを用いて対応するＰＣＲ増幅産物から調製される。
各ＩＶＴ反応を、３７℃で１６〜２０時間、加熱蓋を備えたサーモサイクラー中でインキュベートした。１６〜２０時間のインキュベーション後、ＩＶＴ反応から残ったＤＮＡを、MEGAShortScriptキットからの１μＬのTurbo DNase溶液を各２０μＬのＩＶＴ反応に添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより消化した。ＩＶＴ産物をQiagen RNeasyミニカラムを用いて精製し、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ（ｐＨ７）に溶出させた。熱変性後、精製されたＲＮＡ転写物を変性したゲル上で分析し、ここで主なバンドは、約２００塩基長に位置するＳＦＲＰ１を除いて、約２５０〜３００塩基長に典型的に位置する。各ＩＶＴ ＲＮＡ産物の濃度を、２６０ｎｍ波長においてＵＶ−可視分光光度計を用いて測定した。
基準サンプルを作製するためのＩＶＴ ＲＮＡ産物の混合
この実施例では、基準サンプルは、対象の核酸標的を代表する全ての等モル比の５８のＩＶＴ ＲＮＡ産物からなる。ＩＶＴ ＲＮＡは、各ＲＮＡの測定される濃度に基づいて混合され、その後NanoString nCounter（登録商標）分析システムで使用するために、ＴＥバッファ中に１２０ｆＭの各転写物の終濃度まで希釈される。基準サンプルの性能は、NanoString nCounter（登録商標）分析システム、及び実施例２に記載のこれらの遺伝子に特異的に設計されたCodeSetを用いて測定される。
実施例２．内在性の乳癌サブタイプを検出するために設計された多変量遺伝子アッセイのための基準サンプルの使用
この実施例に記載される多変量遺伝子アッセイは、遺伝子の発現レベルを分析する５０遺伝子の分類アルゴリズムを用いたホルマリン固定パラフィン包理乳腫瘍サンプルの内在性のサブタイプを同定する。この５０遺伝子の分類アルゴリズムは、国際公開第０９／１５８１４３号、及び米国特許出願第２０１１／０１４５１７６号により詳細に記載され、これらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。該試験は、表５に示すように、分類アルゴリズムについて使用される５０遺伝子（５０の標的遺伝子）、及び更なる８つのハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＰＵＭ１、ＲＰＬＰ０、ＳＦ３Ａ１、ＧＵＳＢ、ＴＦＲＣ）の発現レベルを同時に測定する。
５８の遺伝子は、遺伝子発現解析についての以下に記載される手順に従って、これらの遺伝子に特異的に設計されたnCounter（登録商標）遺伝子発現CodeSetを用いた、シングルハイブリダイゼーション反応において測定される（www.nanostring.com）、図９。CodeSetは、捕捉プローブのセットとともに、５８の遺伝子のそれぞれと特異的にハイブリダイズするように構築されたナノレポーターを含む。５８の遺伝子標的に加えて、CodeSetは、陽性アッセイ対照として、添加されたＲＮＡ標的及び対応するナノレポーター、並びに標的を含まないナノレポーターからなる陰性アッセイ対照のセットも含む。
ホルマリン固定パラフィン包理（ＦＦＰＥ）乳腫瘍サンプルをこの実施例に用いた。認定された病理学者は、各ＦＦＰＥブロック上の浸潤性乳癌の領域を丸で囲み、そして２ｘ１ｍｍ直径コア組織パンチを指定された領域内から採取し、あるいはスライドに載せる組織切片をブロックから切り出した。Roche diagnosticsから供給されるＲＮＡ単離キットを用い、組織を溶解するためのより長いプロテイナーゼＫ消化時間、及び３０ｕＬのより低い溶出容量を含む、提供された添付書類に対する多少の手順変更を加えて、ＲＮＡを各ＦＦＰＦ乳腫瘍サンプルから単離した。各腫瘍試験サンプルから単離されたＲＮＡの量を、Nanodrop分光光度計を用いて定量した。
対象の５８の遺伝子を、その後、nCounter（登録商標）分析システムにおいて、記載されるCodeSetを用いて、各腫瘍ＲＮＡサンプルにおいて分析した。このアッセイにおいて、各乳腫瘍組織試験サンプルから単離された２５０ｎｇのＲＮＡを２つの基準サンプル対照と並べて試験した。最大１０のＲＮＡサンプルの各組について、利用者は、２５０ｎｇのＲＮＡを１２の反応ストリップチューブ内の別々のチューブにピペットで移し、CodeSet及びハイブリダイゼーションバッファを加える。利用者は、基準サンプルをCodeSet及びハイブリダイゼーションバッファを含む残る二つのチューブにピペットで移す。nCounter（登録商標）アッセイプロセス後、基準サンプル及び試験サンプルの双方からの５０の核酸標的遺伝子は、ハウスキーパーで標準化される、図９。試験サンプルからの５０核酸標的遺伝子の発現レベルは、その後、基準サンプル内の対応する核酸標的遺伝子の発現レベルに対して標準化される。標準化されたデータは、その後、固有のサブタイプ、再発スコアのリスク、及び５０遺伝子内の増殖遺伝子サブセットに基づく増殖スコアを決定するために、アルゴリズムに入力される。

Claims (15)

  1. 生体サンプル中の複数の標的核酸分子の標準化された発現を定量する方法であって、
    複数の標的核酸分子を含む生体サンプルを提供すること；
    複数の標的核酸分子のそれぞれを代表する、複数の基準核酸分子を含む別の基準サンプルを提供すること、ここで、複数の基準核酸分子のそれぞれは、別の基準サンプル中に既知の量で存在する；
    複数のプローブ分子であって、前記複数のプローブ分子の各プローブ分子が、前記サンプル中の１つの標的核酸分子と特異的に結合し、及び別の基準サンプル中の１つの基準核酸分子に特異的に結合する、複数のプローブ分子を提供すること；
    少なくとも１つのプローブ分子と１つの標的核酸分子のハイブリダイゼーション、及び少なくとも１つのプローブ分子と１つの基準核酸分子のハイブリダイゼーションに十分な条件下で、生体サンプル及び別の基準サンプルのそれぞれを、複数のプローブ分子と接触させること；
    対応する標的核酸分子のそれぞれと結合する複数のプローブ分子のそれぞれに関連する標的シグナルを検出すること、ここで、前記検出は非酵素的である；
    標的シグナル及び基準シグナルをハウスキーピング遺伝子のセットで標準化すること；及び
    標的シグナルを対応する基準シグナルで標準化すること、
    生体サンプル中の複数の標的核酸分子は、少なくとも１０００の異なる標的核酸分子を含み、それにより、生体サンプル中の複数の標的核酸分子の標準化された発現を定量すること、
    を含み、
    前記プローブ分子が、核酸プローブであり、
    各核酸プローブが、
    （ｉ）標的核酸分子と特異的に結合する標的特異的領域；及び
    （ｉｉ）数珠つなぎの複数の標識付着領域を含む領域であって、各標識付着領域は、各標的特異的プローブに対して特有のコードを作り出す複数の標識モノマーと付着し、前記コードは、第一の標的核酸と結合する１つの核酸プローブを、異なる第二の標的核酸分子と結合する別の核酸プローブから識別する検出可能なシグナルを有する領域を含み、
    前記標的核酸分子が標的ＲＮＡ分子であり、前記基準核酸分子が基準ＲＮＡ分子である、方法。
  2. 前記複数の核酸分子のそれぞれを代表する複数の基準核酸分子が、合成されたＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記複数の核酸分子のそれぞれを代表する複数の合成された基準核酸分子が、インビトロで転写されたＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記複数の核酸分子のそれぞれを代表する複数の合成された基準核酸分子が、化学的に合成されたＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記基準核酸分子が、個別のアッセイの有効性の変動を補正するために用いられる、請求項１に記載の方法。
  6. 前記複数の標識付着領域が、少なくとも４つの標識付着領域を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記複数の標識モノマーが、少なくとも４つの標識モノマーを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記標識モノマーのそれぞれが、蛍光色素部分、蛍光部分、色素部分、及び化学発光部分からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記核酸プローブが、さらにアフィニティータグを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記生体サンプルが、組織又は細胞サンプルである、請求項１に記載の方法。
  11. 前記生体サンプルが、腫瘍サンプルである、請求項１に記載の方法。
  12. 前記腫瘍サンプルが、乳房組織サンプルである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記生体サンプルが、ホルマリン固定パラフィン包理組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
  14. 前記シグナルが、標的核酸増幅することなく検出される、請求項１に記載の方法。
  15. ハウスキーピング遺伝子が、以下の遺伝子セット：ＡＣＴＢ、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＰＵＭ１、ＲＰＬＰ０、ＳＦ３Ａ１、ＧＵＳＢ、及びＴＦＲＣを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
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