JP2003009862A - ｃＤＮＡの標識方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 複数の試料から調製されたｃＤＮＡを、複数
の標識物質によって標識する場合に、標識物質の種類に
影響されることなく実質的に一定の標識効率でｃＤＮＡ
を標識する方法、該方法で標識した標識化ｃＤＮＡ、該
標識化ｃＤＮＡを用いた標的核酸の検出方法、該標識化
ｃＤＮＡを用いた発現遺伝子の解析方法を提供するこ
と。 【解決手段】 試料中のｃＤＮＡを物理的に、または化
学的に直接標識することによって、核酸の増幅反応、伸
長反応に伴なう標識物質の取込みによる核酸の標識方法
に比べて、標識物質の種類に影響されることなく実質的
に一定の標識効率でｃＤＮＡを標識する方法、該方法で
標識した標識化ｃＤＮＡ、該標識化ｃＤＮＡを用いた標
的核酸の検出方法、該標識化ｃＤＮＡを用いた発現遺伝
子の解析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学の分野
において有用な標識核酸、該核酸調製方法、該核酸を用
いた標的核酸の検出方法並びに発現遺伝子の解析方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ハイブリダイゼーション法は、細胞や組
織において発現するｍＲＮＡの種類を同定するために、
あるいは各ｍＲＮＡ分子量を定量するために通常よく利
用される方法である。それゆえ、ｍＲＮＡの同定、定量
のためのハイブリダイゼーション技術は、生物学ならび
に医学の分野において非常に重要である。また、ＤＮＡ
の種類および構造解析においても上記ハイブリダイゼー
ション法は重要である。上記ハイブリダイゼーション法
として例えば、全ＲＮＡまたは精製されたＲＮＡをナイ
ロン膜のような多孔性の担体上に固定化し、蛍光物質あ
るいは放射性同位元素（ＲＩ）等で標識した、検出しよ
うとする遺伝子（ＲＮＡ）に相補的なプローブと混合し
てハイブリダイズさせる方法がある。このカテゴリーに
属する技術としてノーザン・ハイブリダイゼーション法
が挙げられる。また、ゲノムＤＮＡやＤＮＡ増幅断片を
制限酵素等で断片化し、アガロース電気泳動により分離
し、アルカリ変性後、メンブレンにトランスファーして
標識プローブとハイブリダイズさせる、サザン・ハイブ
リダイゼーション法が例示される。さらに、別法として
は、検出しようとする遺伝子（ＲＮＡ）を含む混合物、
若しくは該混合物から精製したＲＮＡを蛍光物質あるい
は放射性同位元素等で標識し、これを膜上に固定された
プローブとハイブリダイズさせる方法がある。このカテ
ゴリーに属する技術としては、逆ドットブロット法が挙
げられる。一方、膜上に標的核酸を固定化し、該核酸と
標識プローブをハイブリダイズさせるいわゆるドットブ
ロット法がある。これら４法は、遺伝子工学分野の研究
の様々な実験で使用されている。

【０００３】従来のハイブリダイゼーション法では通
常、膜上に固定化された核酸が使用されてきたが、最
近、上記のハイブリダイゼーション技術について、ガラ
スのような非多孔性の硬質の担体上に、主として既知の
ＤＮＡ断片を固定化して使用するハイブリダイゼーショ
ン技術が開発されている。この技術においては、担体表
面上のあらかじめ定められた領域に数多くの種類のＤＮ
Ａ断片を極めて高密度に固定することができる。このよ
うな高密度にＤＮＡ断片が固定化された担体は、一般に
ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）と呼ばれてい
る。当該ＤＮＡマイクロアレイを使用することにより、
少量の試料中の多種類のｍＲＮＡの同定、定量を一度に
実施することが可能になった。

【０００４】上記ＤＮＡマイクロアレイを使用する場合
には、試料中の核酸を、例えば蛍光物質を用いて標識
し、担体上に固定化されたＤＮＡ断片とハイブリダイズ
させて検出するのが一般的である。すなわち、試料中の
ｍＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイで検出する場合には、
例えば、以下のような方法で試料を標識することができ
る。 １．試料中のｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成の際に
蛍光標識ヌクレオチドを添加して蛍光標識ｃＤＮＡを作
成する方法、あるいは ２．試料中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、蛍光
標識ヌクレオチド存在下に該ｃＤＮＡを鋳型としてＲＮ
Ａポリメラーゼで転写反応を行い、蛍光標識ＲＮＡプロ
ーブを作成する方法。 上記方法によって作製された標識ＤＮＡあるいはＲＮＡ
は、試料中のｍＲＮＡ由来の塩基配列、若しくはこれに
相補的な塩基配列を有しており、適切なＤＮＡ断片が固
定されたマイクロアレイ上で検出することができる。

【０００５】また、異なる複数の細胞や組織に存在する
核酸を比較するには、例えば米国特許第５８００９９２
号公報記載の核酸検出方法があげられる。該方法では、
複数の試料から調製した核酸をそれぞれ異なる標識物質
でラベルし、ＤＮＡマイクロアレイにおいてこれらの核
酸を同時にハイブリダイズさせ、それぞれの標識物質を
検出することにより試料中の核酸を比較することができ
る。この方法を利用して、２種類の試料からｍＲＮＡを
調製してｃＤＮＡを合成する際に、それぞれ異なる蛍光
標識ヌクレオチドを添加して蛍光標識ｃＤＮＡを作成す
る、あるいはｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを鋳型と
してＰＣＲ法などの核酸増幅方法で核酸を増幅する際
に、それぞれ異なる蛍光標識ヌクレオチドを取り込ませ
て蛍光標識ＤＮＡを作製して、マイクロアレイによって
検出することにより、２種類の試料で発現している遺伝
子の違いを明らかにすることが広く一般に行なわれてい
る。

【０００６】しかしながら、上記のような方法で試料中
のｍＲＮＡ由来の標識ｃＤＮＡ、標識ＲＮＡを作製する
場合には、複数の試料から調製されたｍＲＮＡをそれぞ
れ異なる標識物質で標識する場合において、試料によっ
て標識効率に差が生じることが多く、標識物質のシグナ
ル強度の測定後にそれぞれの測定値を補正してｍＲＮＡ
量の比較を行なわなければならない。さらに、個々のｍ
ＲＮＡ、鋳型ｃＤＮＡの鎖長、塩基配列などの影響で、
酵素によって取り込まれやすい標識物質、取り込まれに
くい標識物質が存在し、標識物質による標識効率にばら
つきが生じるため、測定結果の信頼性が低下する、バッ
クグラウンドが上昇するといったことが問題となってい
る。従って、複数の試料由来ｍＲＮＡの試料における、
標識物質による標識効率のばらつきを最小限に抑える核
酸の標識方法が求められていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、複数
の試料から調製されたｃＤＮＡを、複数の標識物質によ
って標識する時に、標識物質にかかわらず一定の標識効
率でｃＤＮＡを標識するｃＤＮＡの標識方法を提供する
ことにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、複数の標
識物質によるｃＤＮＡの標識方法について鋭意研究を行
ない、試料中のｃＤＮＡを直接標識することによって、
核酸の増幅反応、伸長反応に伴なう標識物質の取込みに
よる核酸の標識方法に比べて、標識物質の種類に影響さ
れることなく実質的に一定の標識効率でｃＤＮＡを標識
するｃＤＮＡの標識方法を見出し、本発明を完成させ
た。

【０００９】すなわち、本発明の第１の発明は、標識物
質をｃＤＮＡに直接又は間接的に結合させることを特徴
とするｃＤＮＡの標識方法であって、使用する標識物質
の種類に影響されることなく実質的に一定の標識効率で
ｃＤＮＡを標識するｃＤＮＡの標識方法に関する。

【００１０】本発明の第１の発明において、ｍＲＮＡか
らｃＤＮＡへの逆転写反応後に標識物質を付加させるこ
とができる。また、ヌクレオチドのグアニン残基を化学
的に標識することができる。また、標識物質は、放射性
同位元素、化学発光物質、蛍光物質、抗体、リガンドあ
るいはレセプターから選択される物質であるものが好適
に使用できる。該標識物質としては、特に限定はされな
いが、^３２Ｐ、^３３Ｐ、ＡＭＰＰＤ、フルオレセイン、
カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、
ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサ
スレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ビオチン、アビジン、ディ
ゴキシゲニン、ＤＮＰからなる群より選択されるものが
例示される。

【００１１】本発明の第２の発明は、本発明の第１の発
明のｃＤＮＡの標識方法によって標識化された標識化ｃ
ＤＮＡに関する。

【００１２】本発明の第３の発明は、本発明の第２の発
明の標識化ｃＤＮＡを用いた標的核酸の検出方法に関す
る。

【００１３】本発明の第４の発明は、本発明の第２の発
明の標識化ｃＤＮＡを用いた発現遺伝子の解析方法であ
って、異なる標識物質を有する、少なくとも２種類の標
識化ｃＤＮＡを用いた発現遺伝子の解析方法に関する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本明細書において核酸とは、ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡのことをいい、例えばＤＮＡの場合、
糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレ
オチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シ
トシン、グアニン、チミン、ウラシルを有するものが挙
げられる。また、ＲＮＡの場合、糖部分がＤ−リボース
で構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にア
デニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが
挙げられる。さらに、当該核酸には、修飾ＤＮＡあるい
は修飾ＲＮＡのいずれもが包含され、例えばα位のリン
酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾ＲＮＡやこ
の他の誘導体なども含まれる。

【００１５】本明細書においてｃＤＮＡとは、ＲＮＡを
鋳型とし逆転写酵素によって合成されたＤＮＡのことを
いう。本発明の方法に適用することができるＲＮＡに
は、逆転写反応に使用できるプライマーが作製可能なも
のであれば特に限定はなく、試料中の全ＲＮＡのほか、
ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどのＲＮＡ分子群、あ
るいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。

【００１６】上記の逆転写反応に使用されるプライマー
は、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニール
するものであれば特に限定されるものではない。該プラ
イマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有す
るプライマー（特異的プライマー）のほか、オリゴｄＴ
（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有す
るプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。
逆転写用のプライマーの長さは、特異的なアニーリング
を行なう観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であ
り、さらに好ましくは９ヌクレオチド以上であり、プラ
イマー合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド
以下であり、さらに好ましくは３０ヌクレオチド以下で
ある。

【００１７】上記の逆転写反応に使用される酵素として
は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するもの
であれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイル
ス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネ
ズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａ
ｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２
ＲＴａｓｅ）など、種々の起源の逆転写酵素が挙げら
れる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラ
ーゼ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ
あるいはＢａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来
（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼを使用することもでき
る。

【００１８】本明細書において標識化ｃＤＮＡとは、標
識物質で標識された一本鎖核酸のことをいう。該標識物
質は、上記ＤＮＡあるいはＲＮＡに直接、またはリンカ
ーなどを介して結合しているものいずれもが含まれる。

【００１９】本明細書において標識のばらつきとは、個
々の分子に結合される標識物質の量の標識物質による違
いであり、使用する酵素の種類、核酸の塩基配列、鎖
長、２次構造などの条件により変化する標識物質の量の
分布である。

【００２０】本明細書において標的核酸とは、検出しよ
うとする核酸配列、例えば任意の遺伝子の核酸配列のこ
とをいう。該核酸配列は、ＤＮＡあるいはＲＮＡのいず
れであっても良い。

【００２１】本明細書において実質的に一定の標識効率
とは、使用する標識物質の種類に影響されることなく一
定の値でｃＤＮＡを標識化できる効率のことをいう。上
記実質的に一定の標識効率は、弱いシグナルに対する強
いシグナル度合いで表す場合、特に限定はないが２倍以
下、好ましくは１．６倍以下、さらに好ましくは１．４
倍以下の範囲である。

【００２２】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２３】（１）本発明のｃＤＮＡの標識方法 本発明のｃＤＮＡの調製方法は、標識物質によって生じ
る標識効率のばらつきが低減するように核酸に標識物質
を付加する方法であればよい。特に限定はされないが例
えば、生体試料から調製されたｍＲＮＡを鋳型として、
逆転写酵素によって１本鎖ｃＤＮＡを作製し、標識物質
を該１本鎖ｃＤＮＡに化学反応によって結合させて調製
することができる。該逆転写反応において、使用する酵
素は、本発明に用いることのできるｃＤＮＡを調製でき
るものであれば特に限定はなく、常温性、好熱性、超耐
熱性の酵素のいずれであってもよい。特に限定はないが
例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素、モロ
ニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素、ラウス関連
ウイルス２由来逆転写酵素、バチルス カルドテナック
ス由来ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス サーモフィラス
由来ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。

【００２４】上記ｃＤＮＡに標識物質を結合させる方法
としては、標識物質によって生じるばらつきが少なくな
るような結合方法であれば良く、また、物理的、化学
的、酵素学的な方法であっても良い。さらにｃＤＮＡに
直接あるいはリンカーなどを介して間接的に結合する方
法も本発明に包含される。本発明のｃＤＮＡの標識方法
において、標識物質の結合方法は、特に限定はされない
が例えば、ＬａｂｅｌＩＴ試薬（Ｐａｎ Ｖｅｒａ社
製）を用いて核酸のグアニン残基を化学的に修飾する方
法などが挙げられる。

【００２５】本発明の方法によって調製された標識化ｃ
ＤＮＡは、膜のような多孔性担体あるいはガラスのよう
な非多孔性担体の表面に固定化されたＤＮＡ配列とハイ
ブリダイズさせて、由来となるｍＲＮＡの発現を検出す
るために使用することができる。

【００２６】（２）本発明の標識化ｃＤＮＡ 本発明の標識化ｃＤＮＡは、１本鎖核酸に標識物質を直
接またはリンカーを介して結合させたものであれば良
く、標識物質によって生じる標識のばらつきが低減され
たものであれば良い。本発明の標識化ｃＤＮＡの長さ
は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応によって得ら
れたｃＤＮＡであれば特に限定はされない。上記１本鎖
ＤＮＡは、特に限定はされないが、ｍＲＮＡからの逆転
写反応により調製したｃＤＮＡ、あるいは公知の核酸増
幅方法で得られた２本鎖ＤＮＡを公知の方法で分離した
１本鎖ＤＮＡのいずれもが好適に使用できる。

【００２７】また、標識物質としては特に限定はされな
いが、例えば^３２Ｐ、^３３Ｐのような放射性同位元素、
ＡＭＰＰＤのような化学発光物質、フルオレセイン、カ
スケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ロ
ーダミングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサス
レッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のような蛍光物質、ビオ
チン、アビジン、ディゴキシゲニンなどのリガンドある
いはレセプターが標識物質として好適に使用できる。本
発明においては、好ましくは蛍光物質、特に好ましくは
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ，Ｃｙ３あるいはＣｙ５が好適
に使用できる。

【００２８】また、別の様態として、アミノ基やチオー
ル基などの官能基を有する修飾ヌクレオチドを用いて核
酸を合成した後に、該官能基を利用して上記標識物質を
付加させた標識化ｃＤＮＡも本発明に含まれる。

【００２９】特に限定はされないが例えば、試料から抽
出されたｍＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素を用いてｃＤ
ＮＡを合成し、該１本鎖ｃＤＮＡに直接又はリンカーを
介して標識物質を付加させた標識化ｃＤＮＡが好適に使
用できる。

【００３０】（３）本発明の標的核酸の検出方法 本発明の標的核酸の検出方法においては、多数の異なる
遺伝子あるいはＤＮＡの断片を膜、ガラスなどの固相担
体上の所定の領域あるいは所定の位置に整列させて固定
化した核酸固定化物が使用できる。該核酸固定化物とし
ては、特に限定はされないが例えば、ＤＮＡチップ（Ｄ
ＮＡアレイあるいはマイクロアレイ）が好適に使用でき
る。ＤＮＡチップは、試料より調製した核酸試料、好ま
しくは標識された核酸試料と接触させてハイブリダイズ
させることにより、核酸試料中に存在する、ＤＮＡチッ
プ上の所定の領域に整列させて固定化されたＤＮＡと相
補的な配列を有する核酸の存在を調べる目的で使用され
る。試料中の多数の核酸を一度の操作で検出、定量でき
ることから、ＤＮＡチップは遺伝子の発現解析や変異あ
るいは多型解析を飛躍的に加速させる手段として非常に
有用である。

【００３１】本発明の標的核酸の検出方法には、上記
（２）記載の本発明の標識化ｃＤＮＡを用いることがで
きる。すなわち、本発明の標識化ｃＤＮＡを用いること
により、複数の試料から調製した標識化ｃＤＮＡを使用
して、得られるシグナル強度においては、実質的に一定
の標識効率で標識されることから、標識物質によって生
じる標識効率のばらつきが低減される。従って、標識物
質を換えた場合においても個々の核酸のシグナル強度の
比に変化は見られない。このことは、複数の標識物質を
用いた標的核酸の検出方法において、信頼性の高いデー
タを取得する観点からも重要である。

【００３２】さらに、本発明の標識化ｃＤＮＡは、その
オリゴヌクレオチド中に複数箇所標識されており、末端
標識された標識核酸や標識ｃＤＮＡよりも強いシグナル
を得ることができる。従って、バックグラウンドに対す
るシグナルの比を向上させることができるため、標的核
酸を高感度に検出することができる。

【００３３】（４）本発明の発現遺伝子の解析方法 本発明の発現遺伝子の解析方法においては、上記（１）
記載の標識化ｃＤＮＡを用いる際、異なる標識を有する
少なくとも２種類の標識化ｃＤＮＡを用いることによ
り、異なる２種類の試料中の多種類の遺伝子の発現を比
較することができる。本発明の解析方法においては、標
識物質によって生じる標識のばらつきが低減された実質
的に一定の標識効率で標識された標識化ｃＤＮＡを用い
ることにより、標識効率の差あるいは標識のばらつきが
無く、信頼性、再現性の高い発現遺伝子の解析を行うこ
とができる。

【００３４】本発明の発現遺伝子の解析方法において、
多数の異なる遺伝子あるいはＤＮＡの断片を膜、ガラス
などの固相担体上の所定の領域あるいは所定の位置に整
列させて固定化した核酸固定化物が使用できる。該核酸
固定化物としては、特に限定はされないが例えば、ＤＮ
Ａチップ（ＤＮＡアレイあるいはマイクロアレイ）が好
適に使用できる。

【００３５】上記のような核酸固定化物に、異なる標識
を有する少なくとも２種類の本発明の標識ｃＤＮＡをハ
イブリダイズさせることにより、異なる２種類の試料中
の多種類の遺伝子の発現を比較することができる。ま
た、本発明の検出方法において、該標識ｃＤＮＡは標識
物質によって生じるばらつきを抑えることができるの
で、信頼性、再現性の高い情報が得られる。

【００３６】

【実施例】以下、本発明を実施例により、更に具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例によって限定される
ものではない。

【００３７】実施例１ 一般的に、複数の標識化合物を用いてＤＮＡを標識する
場合、標識化合物よって標識効率に差が生じるが、標識
方法によってその差が減少するのか検討した。ｍＲＮＡ
の調製は以下のようにして行なった。ヒトＡ４３１細胞
（大日本製薬社製）からＳｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡＩ（ナ
カライテスク社製）と、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜
Ｓｕｐｅｒ＞（宝酒造社製）を用い、それぞれのキット
のプロトコールに従いｍＲＮＡを調製した。

【００３８】標識プローブの作製は以下の３通りの方法
で行なった。上記で調製したｍＲＮＡ１μｇを鋳型とし
て、ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｉ
ｎｇＣｏｒｅ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、キット
のプロトコールに従いＣｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャム
ファルマシア社製）とＣｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャム
ファルマシア社製）のそれぞれで標識した。これを逆転
写プローブとする。次に、上記ｍＲＮＡ１μｇを用い
て、３００ｐｍｏｌ ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒ
（宝酒造社製）、２μｌ １０×ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ（宝酒造社製）、５０Ｕ ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎ
ｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ
社製）、２５Ｕ ＡＭＶ ＲＴａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ社製）を加えて全量を２０μｌとした。該溶
液を４２℃で１時間反応し、ｃＤＮＡを作製した。この
ｃＤＮＡ全量を、Ｌａｂｅｌ ＩＴ Ｃｙ３ Ｌａｂｅ
ｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｌａｂｅｌ ＩＴ Ｃｙ５ Ｌａｂ
ｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ともにＰａｎ Ｖｅｒａ社製）を
用いてそれぞれ標識した。これをｃＤＮＡ−Ｌａｂｅｌ
ＩＴプローブとする。最後に、上記で調製したｍＲＮＡ
１μｇを直接Ｌａｂｅｌ ＩＴ Ｃｙ３ Ｌａｂｅｌｉ
ｎｇ ＫｉｔとＬａｂｅｌ ＩＴ Ｃｙ５ Ｌａｂｅｌ
ｉｎｇ Ｋｉｔを用いてそれぞれ標識した。これをｍＲ
ＮＡ−ＬａｂｅｌＩＴプローブとする。以上の方法で調
製したプローブのうち、Ｃｙ３標識、Ｃｙ５標識したも
のをそれぞれ全量混合し、３種類の標識プローブを調製
した。

【００３９】次に、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ Ｈｕｍａ
ｎ ＣＨＩＰ １Ｋ Ｓｅｔ Ｉ、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅ
ｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣＨＩＰ ｖｅｒ．
２．１（ともに宝酒造社製）を用いて、取扱説明書に従
って上記３種類のプローブとマイクロアレイとのハイブ
リダイゼーションをそれぞれ行ない、洗浄、乾燥の操作
を行なった。次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４２８
Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（アフィメトリックス社
製）を用いて、Ｃｙ３（励起波長：５３２ｎｍ、検出波
長：５７０ｎｍ）とＣｙ５（励起波長：６３５ｎｍ、検
出波長：６６０ｎｍ）の蛍光画像を取得し、各スポット
のシグナル強度を画像定量解析ソフトＩｍａＧｅｎｅ
４．０（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）を用いて解析
した。Ｈｕｍａｎ ＣＨＩＰ １Ｋの結果を図１に示
す。Ａは逆転写プローブ、ＢはｍＲＮＡ−ＬａｂｅｌＩ
Ｔプローブ、ＣはｃＤＮＡ−ＬａｂｅｌＩＴプローブを
使用した結果であり、横軸にＣｙ３の蛍光強度、縦軸に
Ｃｙ５の蛍光強度を示す。Ｈｕｍａｎ ＣＨＩＰ １Ｋ
の結果から、有効スポットをスポット領域の各ピクセル
のシグナル平均値（Ｍｅａｎ値）が［スポット周辺の各
ピクセルのシグナル平均値＋２標準偏差］よりも大きい
スポットとした時、有効スポットのうち９５％、９９％
のスポットのシグナル強度が何倍以内に収まるのかを表
１に示す。表１中、数値はＣｙ３、Ｃｙ５のシグナル強
度のうち、強いシグナルが弱いシグナルに対して何倍な
のかを示している。

【００４０】

【表１】

【００４１】ｃＤＮＡ−ＬａｂｅｌＩＴプローブは、逆
転写プローブ、ｍＲＮＡ−ＬａｂｅｌＩＴプローブに比
べて、Ｃｙ３、Ｃｙ５のシグナル強度に差が少なく、実
質的に一定の標識効率であることが確認できた。また、
同様の実験をＨｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣＨＩＰにつ
いても行い、標識物質にかかわらず実質的に一定の標識
効率でｃＤＮＡが標識化されていることが確認できた。

【００４２】

【発明の効果】複数の標識物質によるｃＤＮＡの標識方
法について、試料中のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて
１本鎖ｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを直接標識するこ
とによって、標識物質間で生じる標識効率の差を実質的
に一定にすることができる。

【００４３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明により得られる標識化ｃＤＮＡを用い
て行った、ＤＮＡチップ解析の蛍光強度を表す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 HA13 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR32 QR56 QS03 QS34 QX01

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標識物質をｃＤＮＡに直接又は間接的に
   結合させることを特徴とするｃＤＮＡの標識方法であっ
   て、使用する標識物質の種類に影響されることなく実質
   的に一定の標識効率でｃＤＮＡを標識することを特徴と
   するｃＤＮＡの標識方法。
2. 【請求項２】 ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応後
   に標識物質を付加させることを特徴とする請求項１記載
   のｃＤＮＡの標識方法。
3. 【請求項３】 ヌクレオチドのグアニン残基を化学的に
   標識することを特徴とする請求項１又は２記載のｃＤＮ
   Ａの標識方法。
4. 【請求項４】 標識物質が、放射性同位元素、化学発光
   物質、蛍光物質、抗体、リガンドあるいはレセプターか
   ら選択される物質であることを特徴とする請求項１〜３
   のいずれか１項に記載のｃＤＮＡの標識方法。
5. 【請求項５】 標識物質が、^３２Ｐ、^３３Ｐ、ＡＭＰＰ
   Ｄ、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリ
   ーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ
   Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ビオ
   チン、アビジン、ディゴキシゲニン、ＤＮＰからなる群
   より選択されることを特徴とする請求項４記載のｃＤＮ
   Ａの標識方法。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のｃ
   ＤＮＡの標識方法によって標識化された標識化ｃＤＮ
   Ａ。
7. 【請求項７】 請求項６記載の標識化ｃＤＮＡを用いた
   標的核酸の検出方法。
8. 【請求項８】 請求項６記載の標識化ｃＤＮＡを用いた
   発現遺伝子の解析方法であって、異なる標識物質を有す
   る、少なくとも２種類の標識化ｃＤＮＡを用いた発現遺
   伝子の解析方法。