CN101985654A

CN101985654A - 检测多样本多位点snp的检测方法

Info

Publication number: CN101985654A
Application number: CN 201010519401
Authority: CN
Inventors: 潘志强; 张励才; 张成标; 邵翠杰
Original assignee: Xuzhou Medical College
Current assignee: Xuzhou Medical College
Priority date: 2010-10-21
Filing date: 2010-10-21
Publication date: 2011-03-16

Abstract

本发明公开了一种检测多样本多位点SNP的检测方法，属于基于微阵列芯片的基因多态性(SNP)的多样本多位点检测技术。设计寡核苷酸DNA芯片；在单管中用不同Padlock探针捕获同一样本的不同SNP位点，然后用特异扩增引物与Padlock探针进行杂交并进行滚环扩增，最后将不同样本的不同SNP扩增产物按照一定的顺序固定在同一芯片上制备出待测多样本多位点SNP微阵列；最后用通用荧光探针进行检测，根据微阵列点荧光的颜色判断SNP的分型：有益效果是：实现了不同样本不同SNP位点的平行性检测和对同一样本不同SNP位点的检测。检测SNP位点信息的准确性与灵敏度高。由于Padlock探针识别SNP位点的特异性与准确性，从而保证了SNP位点识别的准确性。

Description

检测多样本多位点SNP的检测方法

技术领域

本发明属于基于微阵列芯片的基因多态性(SNP)的多样本多位点检测技术，特别涉及一种高灵敏高通量的多样本多位点SNP的检测方法。

背景技术

SNP检测方法的研究是研究疾病发生相关SNP的前提和基础。SNP的检测方法与核酸序列测定不同，它需要检测出基因组DNA中某一特定核苷酸位置上转换、颠换、插入或缺失碱基的变化，对检测的灵敏度、通量以及准确性等都有极高的要求，检测方法比DNA测序更为复杂和烦琐。截至目前已报导的SNP检测方法约有70种之多。针对单个或多个目的基因的分析，较常用的方法有以下几种。首先是1995年Livak等报导TaqmMan探针SNP分型法^[20]，该方法将引物设计在具有SNP位点的序列位置，通过检测PCR过程中产生的荧光信号来区分等位基因的SNP类型，具有分析简单的特点，经常被用于样本的SNP检测，但探针较为昂贵。限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)^[21]、随机扩增多态性(RAPD)^[22]和寡核苷酸连接分析(OLA)^[23]也是较为常用的三种方法，这几种方法检测信息准确，但都较为烦琐。以上这些方法一次只能检测一个基因或一个样本，无法实现高通量分析，不适合用于癌痛相关基因的SNP分析和筛选上。

为实现SNP的高通量分析，全世界许多实验室，包括国内多家实验室做了大量的研究工作并报导了多种高通量SNP分析方法。在这些报导的方法中，等位特异探针杂交法是最为成熟与完善的一种方法，该方法先将合成的探针固定到芯片上，然后待测基因经提取、片段化、扩增、荧光化学标记与纯化后，再与芯片进行杂交，即可检测出样本信息。该方法发展至今已实现一次实验对多个位点的SNP进行规模化筛选，适合用于疾病相关SNP位点的初筛。该方法虽已实现了商品化，但建立耗费巨大，仍无法实现对多样本的平行性检测，且约有20％SNP信息得不到证实。SNP分型的等位特异引物延伸法，该芯片由多对延伸探针构成，与扩增出的靶序列杂交后进行延伸。该方法能够实现SNP分型的自动化，成本较低。但是由于不同探针的融链温度相差较大而导致延伸条件难以被优化，进而造成对多位点SNP检测的困难。基于多相PCR及化学发光技术以链霉亲和素修饰的384微孔板为载体，发展了一种对多样本多位点SNP的检测方法，该方法具有检测特异性高、重复性好的优点，但微孔板的孔数和大小却限制了检测样本和SNP位点的数量，且因链霉亲和素修饰基底的背景高而导致了对微量样本的检测困难。以及其它多种方法都或多或少的存在不同的局限性。

发明内容

基于以上原因，本发明拟提供一种高灵敏度、高特异性、低成本、操作简便易行、平行性分析基因的多样本多位点SNP信息的有效方法。

本发明是以如下技术解决方案实现的：首先，设计寡核苷酸芯片；在单管中用不同Padlock探针捕获同一样本的不同SNP位点，有对应SNP位点存在的Padlock探针发生环化，否则不环化；然后用特异扩增引物与Padlock探针进行杂交并进行滚环扩增，环化的Padlock探针可以进行扩增，未环化的则无法扩增；最后将不同样本的不同SNP扩增产物按照一定的顺序固定在同一芯片上，制备出待测多样本多位点SNP微阵列；最后用通用荧光探针进行检测，根据微阵列点荧光信号的颜色判断SNP的分型：红或绿代表野生型或突变型，黄则代表杂合型。

所述的寡核苷酸DNA芯片由芯片和被固定到芯片上的的寡核苷酸组成。

所述的寡核苷酸DNA的芯片是普通玻璃片或是微球；其表面修饰是聚丙烯酰胺修饰、醛基修饰或链霉亲和素修饰；而相对应的被固定的寡核苷酸的5’端则是丙烯酰胺修饰、氨基修饰或生物素修饰。

所述的Padlock探针是一段合成的寡核苷酸组成，包括三部分，探针两端的每一端碱基长度为18-25bp，与待检测序列互补，用于检测靶序列；中间由一段碱基长度为40-60bp序列连接，Padlock探针与待测分子杂交后，中间形成一个缺口，该缺口在连接酶的作用下可连接成一个单链环，以此环为模板常温滚环扩增。

所述的的微阵列信号是通过和环形探针特定片段互补的荧光探针杂交得到；或通过滚环过程中荧光标记的dNTP参入到延伸核苷酸序列上得到；或者通过滚环扩增后得到的单链DNA延伸成双链DNA后，再同SUBGREEN染料结合后得到。

所述的多样本多位点SNP微阵列是同一个芯片上固定了不同的待测样本，而同一样本有又包含了不同的SNP位点。

本发明的有益效果是：a.实现不同样本不同SNP位点的平行性检测。通过不同Padlock探针对不同SNP位点信息的准确识别，从而实现对对同一样本不同SNP位点的检测。不同样本的每一SNP/Padlock探针杂交后的复合体，在不同单管中完成滚环扩增后，再固定到同一芯片上，则可实现对不同样本不同SNP的检测。

b.检测SNP位点信息的准确性与灵敏度高。由于Padlock探针识别SNP位点的特异性与准确性，从而保证了SNP位点识别的准确性；此外，基因的滚环扩增同普通的PCR扩增相比，具有扩增单分子DNA的能力，同时通过滚环扩增还能实现对检测信号成千上万倍的放大，因而具有灵敏度与特异性极高的特点，这进一步保证了对微量样本检测高灵敏度。c.靶标检测的高通量。因该芯片同时能检测不同样本与同一样本的不同的SNP位点，因而可实现对样本和SNP位点检测的高通量。d.低成本。对于芯片的检测来说，荧光探针是成本高的主要原因。本发明中应用通用荧光检测探针或直接将荧光标记的dNTP参入扩增产物，极大降低了试验成本。e.极好的重复性与均一性。f.该芯片还具有制备简单、操作方便的特点。

附图说明

图1是检测不同样本不同SNP位点的原理示意图；或称Padlock探针捕获SNP示意图。

其中：(a).Padlock探针序列结构示意图。A：靶标互补序列；B：通用荧光检测探针杂交序列；C：通用滚环引物杂交序列；D：连接序列。(b).不同Padlock探针捕获SNP示意图。A1、A2、A3……An为基因组DNA上不同SNP位点；P1、P2、P3……Pn为不同Padlock探针。

图2是检测多样本多位点热聚凝胶DNA芯片的制备方法示意图。

其中：(a).单管中Padlock探针捕获不同SNP位点；(b).特异扩增引物与环化探针的杂交；SP1、SP2、SP3......SPn为针对不同SNP位点的特异扩增引物；(c).待测多样本多位点凝胶DNA芯片；横向为不同杂交子(特异引物-环化Padlock探针)的微阵列，纵向为不同待测样本I、II、III......N。

图3是利用该方法同时检测4个人的5个氨基丁酸受体基因SNP的芯片结果。

4个人5个氨基丁酸受体基因SNP位点(rs34377097(G/T)、rs28362459(G/T)、rs61758388(G/T)、rs2228063(A/G)和rs29001653(A/G))的芯片结果。红色代表突变型；绿色代表野生型；黄色代表杂合型。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的方法和效果。

实施例1

实现COMT基因10个多态性位点(rs15761987，rs15761985，rs15761983，rs15761981，rs15761980，rs15761978，rs15761977，rs15761976，rs15761975，rs15761967)与术后芬太尼镇痛剂量的相关性研究。

针对上述10个SNP位点，设计对应的Padlock探针(两端各长18bp：分别与SNP所在位点两边的序列互补，SNP位点与5’端的碱基对应；中间长50bp(见附表1(1))；5’端有丙烯酰胺修饰的特异性扩增引物(同Padlock探针5’端18个碱基序列互补)以及通用荧光检测探针(见附表1(2)用来检测SNP突变型位点；见附表1(3)用来检测SNP野生型位点)；在同一反应管中用不同Padlock探针捕获同一样本的10个SNP位点，并用连接酶连接Padlock探针，有对应SNP位点存在的Padlock探针发生环化，否则不环化；然后用特异扩增引物与Padlock探针进行杂交并用高保真的Bst进行恒温滚环扩增，环化的Padlock探针可以进行扩增，未环化的则无法扩增；最后将400个人的不同扩增产物按照一定的顺序固定在同一张修饰有丙烯酰胺凝胶芯片上，并用通用荧光探针进行杂件。根据微阵列点荧光的颜色判断SNP的分型：红或绿代表野生型或突变型，黄则代表杂合型。最后进行COMT基因10多态性位点与术后芬太尼镇痛剂量的相关性分析。

实施例2

对200人的染色体6q25.1区域4个SNP位点分型(rs6929137(G/A)、rs1999805(T/C)、rs4870044(G/A)、rs1038304(A/G))的检测，进而研究基因多态性与绝经后妇女骨密度和椎体骨折的相关性

针对rs6929137(G/A)、rs1999805(T/C)、rs4870044(G/A)、rs1038304(A/G)4个SNP位点，设计对应的Padlock探针、特异性扩增引物以及通用荧光检测探针(序列特征均同实施例1)；在同一反应管中用不同Padlock探针捕获同一样本的四个SNP位点，并用连接酶连接Padlock探针，有对应SNP位点存在的Padlock探针发生环化，否则不环化；然后用特异扩增引物与Padlock探针进行杂交并用高保真的Bst进行恒温滚环扩增，环化的Padlock探针可以进行扩增，未环化的则无法扩增；最后将200人的800个扩增产物按照一定的顺序固定在同一芯片上，并用通用荧光探针进行杂件。根据微阵列点荧光的颜色判断SNP的分型：红或绿代表野生型或突变型，黄则代表杂合型。进而对200个样本与4个SNP位点的相关性进行研究。

实施例3

实现类风湿关节患者的疼痛程度与HLA-II类基因SNP的关联性进行研究

针对HLA-DRB1基因的3个SNP位点(rs1059576、rs1059582、rs1059586)、HLA-NOTCH4基因2个SNP位点(rs2071282、rs2071283)以及HLA-DQB2基因的1个SNP(rs1049110)位点，设计对应的Padlock探针(两端各长18bp，中间长50bp)，5’端有生物素修饰的特异性扩增引物以及通用荧光检测探针(序列特征均同实施例1)；在同一反应管中用不同Padlock探针捕获同一样本的6个SNP位点，并用连接酶连接Padlock探针，有对应SNP位点存在的Padlock探针发生环化，否则不环化；然后用带有生物素修饰的特异扩增引物与Padlock探针进的杂交并用高保真的Bst进行恒温滚环扩增，环化的Padlock探针可以进行扩增，未环化的则无法扩增；最后将400个人的不同扩增产物按照一定的顺序固定在链霉素修饰的玻片上，并用通用荧光探针进行杂件。最后对芯片进行扫描和数据处理。根据不同微阵列点荧光颜色判断SNP的分型：红或绿代表野生型或突变型，黄则代表杂合型。从而实现类风湿关节患者的疼痛程度与HLA-II类基因各SNP位点的关联性研究。

Claims

1.一种检测多样本多位点SNP的检测方法，其特征是：设计寡核苷酸DNA芯片；在单管中用不同Padlock探针捕获同一样本的不同SNP位点，有对应

存在的Padlock探针发生环化，否则不环化；然后用特异扩增引物与

进行杂交并进行滚环扩增，环化的Padlock探针进行扩增，未环化的则无法扩增；最后将不同样本的不同SNP扩增产物按照一定的顺序固定在同一芯片上，制备出待测多样本多位点SNP微阵列；最后用通用荧光探针进行检测，根据微阵列点荧光的颜色判断SNP的分型：红或绿代表野生型或突变型，黄代表杂合型。

2.根据权利要求1所属的检测多样本多位点SNP的检测方法，其特征是：所述的寡核苷酸DNA芯片由芯片和被固定到芯片上的的寡核苷酸组成。

3.根据权利要求1或2所属的检测多样本多位点SNP的检测方法，其特征是：所述的寡核苷酸DNA的芯片是普通玻璃片或是微球；其表面修饰是聚丙烯酰胺修饰、醛基修饰或链霉亲和素修饰；相对应的被固定的寡核苷酸的5’端是丙烯酰胺修饰、氨基修饰或生物素修饰。

4.根据权利要求1所属的检测多样本多位点SNP的检测方法，其特征是：所述的Padlock探针是一段合成的寡核苷酸组成，包括三部分，探针两端的每一端碱基长度为18-25bp，与待检测序列互补，用于检测靶序列；中间由一段碱基长度为40-60bp序列连接，Padlock探针与待测分子杂交后，中间形成一个缺口，该缺口在连接酶的作用下连接成一个单链环，以此环为模板常温滚环扩增。

5.根据权利要求1所属的检测多样本多位点SNP的检测方法，其特征是：所述的的微阵列点荧光信号通过和环形探针特定片段互补的荧光探针杂交得到；或通过滚环过程中荧光标记的dNTP参入到延伸核苷酸序列上得到；或者通过滚环扩增后得到的单链DNA延伸成双链DNA后，再同SUBGREEN染料结合后得到。

6.根据权利要求1所属的检测多样本多位点SNP的检测方法，其特征是：所述的多样本多位点SNP微阵列是同一个芯片上固定了不同的待测样本，而同一样本有又包含了不同的SNP位点。