CN1723290A - 通过滚环扩增和sers检测进行的生物分子分析 - Google Patents

通过滚环扩增和sers检测进行的生物分子分析 Download PDF

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Abstract

本方法、组合物和系统涉及利用滚环扩增(RCA)和拉曼检测的生物分子130检测、鉴定和/或定量。在发明的特定实施方案中，RCA是指数RCA或线性RCA。在本发明一些实施方案中，拉曼检测是SERS或SERRS。待扩增的环状DNA模板150、210、310可以包含一个或多个多聚胸苷320残基，从而产生含有多个多聚腺苷酸340、420残基的扩增产物170、230、250、330、410。多聚腺苷酸340、420可以直接用拉曼检测检测。可替代地，一个或多个拉曼标记可以被掺入扩增产物170、230、250、330、410，以方便拉曼检测。由于LRCA或ERCA产生的扩增和多个多聚腺苷酸340、420产生的增强的拉曼信号以及/或者拉曼标记的缘故，利用所公开的方法、组合物和/或系统进行单个拷贝的生物分子130的检测是可行的。

Description

通过滚环扩增和SERS检测进行的生物分子分析
技术领域
[0001]本发明的实施方案涉及生物分子130分析领域。特别地，涉及与生物分子130的滚环扩增和拉曼检测有关的系统、组合物和方法。
背景技术
[0002]要对低浓度的生物分子，诸如蛋白质、肽、寡核苷酸、核酸、酯类、多糖、激素、神经递质、代谢物等进行灵敏且准确的检测、鉴定和/或定量是一项困难的任务，但是它们在医疗诊断、病理学、毒理学、流行病学、生物战、环境取样、法医学和其它大量领域具有广泛而潜在的应用。目前的检测方法一般涉及对可以结合到目标生物分子上的荧光标记的捕获分子或配体进行检测。荧光标记的抗体或探针寡核苷酸一般被分别用来结合和检测目标蛋白或核酸。交叉反应和非特异性结合会使复杂样品中的生物分子的荧光检测变得复杂。即使获得高特异性，荧光检测的灵敏度也常常不足以鉴定低浓度的生物分子。当待检测的生物分子以低的浓度与其他分子共存于复杂混合物中时，就尤其会出现这种情况，其中，干扰、荧光猝灭和高背景荧光(highbackground fluorescence)都会模糊或减弱来自目标分子的信号。
[0003]已有其他的检测模式(modalities)被尝试应用于生物分子检测，诸如拉曼光谱术和/或表面等离子体共振。当光通过有形介质时，一定数量的光由其原来的方向发生转向，这就是被称作拉曼散射的现象。散射光中的一部分在频率上与原始的激发光不同，这是由于光被吸收和电子激发到更高的能态，以及随后以不同波长进行光发射的缘故。拉曼发射光谱的波长是样品中吸收光的分子的化学组成和结构的表征，而光散射的强度取决于样品中分子的浓度。
[0004]在激发光束和样品中的单个分子之间发生拉曼相互作用的概率是非常低的，这导致拉曼分析灵敏性低且应用有限。已经观察到，在粗糙的银表面附近的分子显示出增强为6至7个数量级的拉曼散射。这种表面增强拉曼光谱术(SERS)效应与等离子体共振现象有一定联系，其中，由于金属中的传导电子的集体耦合(collective coupling)，金属纳米颗粒对入射的电磁辐射显示出显著的光学共振。事实上，金、银、铜和某些其他金属的纳米颗粒能充当微型“天线”，来增强电磁辐射的局部效应。在这些颗粒附近的分子在拉曼光谱分析中显示出更大的灵敏性。
[0005]已经尝试着去开发SERS用于生物分子检测和分析，这通常是通过在基质(substrate)上涂布金属纳米颗粒或制备出粗糙的金属膜，然后将样品施于金属涂布的基质上来进行的。然而，能够沉积到平面的基质上的金属颗粒的数量是有限的，因而对于使用此类基质的SERS和相关拉曼技术，将产生相对低的增强因子(enhancement factor)。因此，目前的SERS检测方法对于检测低浓度的生物分子并不具有足够的灵敏性。对高灵敏和特异的生物分子检测方法的需要由此产生。
附图简述
[0006]下面的附图构成了本说明书的一部分，将它们引入说明书是为了进一步说明本发明的某些实施方案。通过参考其中一个或多个附图，并结合本文提供的具体实施方案的详细描述，这些实施方案可以被更好的理解。
[0007]图1显示了线性滚环扩增(LRCA)的方法。所公开的特定类型的分析是免疫RCA(滚环扩增)分析，其中使用了偶联到寡核苷酸引物110上的抗体120。该寡核苷酸引物110能与单链环状核酸模板150杂交，并引发RCA过程。
[0008]图2显示了指数滚环扩增(ERCA)的方法。第一引物220(PI)与单链环状核酸模板210杂交，并引发RCA过程。第二引物240(P2)与扩增的单链序列230中的另一位点杂交，并引发互补链250的形成。当第二扩增产物250到达邻近的扩增产物250的5′端时，发生链置换，导致扩增产物230、250中的分支位点260的形成。
[0009]图3显示了LRCA产物330的SERS检测的示范性方法，其中，LRCA产物330含有多聚腺苷酸340残基。
[0010]图4显示了ERCA产物410的SERS检测的示范性方法，其中，ERCA产物410含有多聚腺苷酸420残基。
[0011]图5显示了0.9nM的腺苷酸溶液的SERS检测。检测体积是100至150毫微微升，其含有估量的60个腺嘌呤分子。
[0012]图6A显示了滚环扩增产物170、230、250、330、410的SERS检测，其中使用了单链环状M13 DNA模板150、210、310。
[0013]图6B显示了阴性对照，其中不存在DNA聚合酶160。图6B的吸光度坐标刻度已被改变，以放大基线。
示范性实施方案描述
定义
[0014]如本文中所使用的，“一”可以表示一个或多于一个的项目。
[0015]“核酸”包括DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)，它们可以是单链、双链或三链和其任何化学修饰形式。该术语也包括任何已知的核酸类似物(analog)，包含但不局限于肽核酸(PNA)、核酸类似物肽(nucleic acid analog peptides，NAAP)和锁式核酸(locked nucleicacids，LNA)。“核酸”可以是几乎任何长度的，从两个或更多个碱基的寡核苷酸到全长的染色体DNA分子。“核酸”包括但不局限于寡核苷酸和多核苷酸。尽管天然发生的核酸中的核苷酸残基通常是通过磷酸二酯键连接在一起，但在所揭示的方法的范围内，核苷酸残基可以通过磷酸二酯键或任何其他类型的已知的共价连接方式来连接。
[0016]术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，它们是指由天然发生的氨基酸、非天然发生的氨基酸、氨基酸类似物和/或氨基酸衍生物装配而成的聚合分子。这些术语之间的区别主要是长度，本领域技术人员将认识到当下列公开在提及蛋白质、多肽或肽时，这些术语包括了具有任何长度的聚合物。尽管天然发生的蛋白质、多肽和肽中的氨基酸残基通常是由肽键连接在一起，但在所揭示的方法的范围内，氨基酸残基可以通过肽键或任何其他类型的已知的共价连接方式来连接。
[0017]如本文中所使用的，术语“生物分子”130、“分析物”130和“目标”130是指生物样品中欲检测的任何分子或分子聚集体。生物分子130的非限制性例子包括蛋白质、肽、氨基酸、核酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、碳水化合物、多糖、糖蛋白、酯类、激素、生长因子、细胞因子、神经递质、受体、酶、抗原、过敏原、抗体120、代谢物、辅因子、营养物、毒素、毒药、生物战试剂、生物危害试剂、传染原、朊病毒、维生素。“生物分子”130不限于单个分子，但也可以包括复杂的聚集体，诸如病毒、细菌、沙门氏菌(Salmonella)、链球菌(Streptococcus)、军团菌(Legionella)、大肠杆菌(E.coli)、贾弟虫(Giardia)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、立克次体(Rickettsia)、孢子、霉菌、酵母、藻类、阿米巴虫、腰鞭毛虫、单细胞生物、病原体或细胞。
[0018]“生物样品”是由生物源获得的或可以获得的任何样品，和/或包括来自生物源的材料。“生物样品”包括不限于血液、淋巴、脑脊髓液、唾液、精液、尿、粪便、毛囊、泪液、上皮屑(epithelial scrapings)、细胞样品、组织样品、器官样品、活体组织样品、培养的细胞，以及细胞、组织或器官的提取物和/或均浆。
滚环扩增
[0019]在本发明的各种实施方案中，所揭示的方法可以包括滚环扩增(RCA)。滚环扩增的技术是本领域已知的(参见如Banér et al，NucleicAcids Research，26：5073-5078，1998；Lizardi et al.，Nature Genetics19：226，1998；Schweitzer et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10113-119，2000；Faruqi et al.，BMC Genomics 2：4，2000；Nallur et al.，Nucl.Acids Res.29：e118，2001；Dean et al.Genome Res.11：1095-1099，2001；Schweitzer etal.，Nature Biotech.20：359-365，2002；美国专利6,054,274、6,291,187、6,323,009、6,344,329和6,368,801)。RCA的若干不同的变型也是已知的，包括线性RCA(LRCA)和指数RCA(ERCA)。
LRCA
[0020]图1显示了LRCA的一般性程序。在这个例子中，用于RCA的引物110被偶联至抗体120，抗体120能结合并识别生物分子130。因此，该RCA变型有时被称作免疫RCA(Schweitzer et al.，2000)。生物分子130可以被附着到基质140上，这使得信号能被定位和检测到。具有与引物110互补的序列的单链环状DNA模板150可以与引物110杂交。一旦加入DNA聚合酶160后，在合适的dNTP(脱氧核苷三磷酸)前体和其他辅因子存在的情况下，引物110链被延伸。因为模板150序列是环状的，所以将有模板150序列的多个拷贝被复制并连接至引物110。
[0021]可以利用各种检测技术来鉴定LRCA扩增产物170。如图1所示，一种常见的技术是加入荧光标记的寡核苷酸探针180，该探针180能与环状DNA模板150内的序列特异性杂交。探针分子180能结合到扩增产物170中的每一个模板150序列拷贝上，这使得可由生物分子130-抗体120复合物检测到的荧光信号能够得以放大。一般而言，LRCA可提供约4个数量级(104)的信号扩增，从而有利于低丰度的目标生物分子130的检测。
ERCA
[0022]对于非常低的丰度的目标生物分子130的检测，LRCA方案可能仍无法提供足够的信号扩增以进行灵敏而可靠的检测。RCA的另一种变型——指数RCA(ERCA)被开发出来，以利用滚环技术提供额外的信号扩增(图2)。
[0023]图2显示了示范性的ERCA方案(Lizardi et al.，1998)。环状单链DNA模板210可以杂交到第一引物220(P1)。加入DNA聚合酶160、dNTP和辅因子，模板210序列被复制从而形成RCA扩增产物230。由于扩增产物230是沿着环状模板210延伸，所以它将第一引物220的5′端从模板210上置换掉，从而产生由环状模板210延伸开来的单链DNA分子230。ERCA方案(图2)的这一部分类似于LRCA(图1)。
[0024]LRCA和ERCA之间主要的区别是在于加入了第二引物240(P2)，该引物能在远离第一引物220的一个位置结合到模板210序列的互补物上。第二引物240能杂交到延伸的单链扩增产物230上。核苷酸加入到第二引物240的3′端，导致第二链扩增产物250的形成(图2)。当伸长的第二链250的3′端碰到邻近的第二引物240的5′端时，那条引物240及其连接的第二链250便从最初的扩增产物230上被置换掉。这导致在RCA扩增产物230、250中形成分支260。第一引物220的额外的拷贝可以结合到各个分支260，从而导致可由目标生物分子130检测到的信号进一步扩增。ERCA的最终结果是高度分枝化的扩增产物230、250，它们提供了指数级的信号扩增。
[0025]相比于在LRCA中观察到的扩增，ERCA可提供高约109或约105的扩增因子。然而，对于通过与荧光标记的寡核苷酸探针180杂交而进行的生物分子130检测，ERCA是不适合的。在ERCA过程(图2)之后，大部分的扩增产物230、250由双链核酸组成。没有未杂交的单链扩增产物170延伸区域，相反，这是可以由LRCA获得的。因此，ERCA的荧光标记寡核苷酸探针180的杂交比起LRCA要困难得多。能将双链ERCA扩增产物230、250分离为单链的技术(例如，加热、低盐、pH、去污剂)将使得应用多重芯片分析(multiplex chip assay)的生物分子130检测变得复杂而困难。尽管荧光标记的核苷酸在原则上可以直接掺入到ERCA扩增产物230、250中，然而DNA聚合酶160活性的效率会因为共价连接至相当部分的dNTP前体的大体积荧光基团的存在而受到不利的影响。此外，邻近的荧光染色分子的自猝灭将减弱信号强度。如果标记探针180相互靠得太近，自猝灭也能发生在LRCA中。最后，荧光标记探针180的使用增加了生物分子130检测所需要的时间和费用。
拉曼检测
拉曼光谱术
[0026]在本发明的某些实施方案中，滚环扩增可以与拉曼检测联合使用，以检测、鉴定和/或定量目标生物分子130。本领域已知的任何拉曼检测模式都可以被使用，包括但不局限于表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)、普通拉曼散射、共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)、受激拉曼散射、反拉曼光谱、受激获得性拉曼光谱术(stimulated gain Ramanspectroscopy)、超拉曼散射、分子光学激光检测器(molecular optical laserexaminer，MOLE)或拉曼微探针或拉曼显微技术或共聚焦拉曼显微光谱术、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱术、时间分辨共振拉曼、拉曼去偶合光谱术或紫外-拉曼显微技术。
[0027]在本发明的特定实施方案中，表面增强拉曼技术，例如SERS或SERRS可以被用来检测RCA扩增产物170、230、250、330、410。此类技术依靠吸附至某些金属的粗糙表面140上的分子的拉曼信号增强，其中所述金属诸如银、铂、铜、铝或金。在SERS和SERRS中，拉曼检测的灵敏性可以被增强106或更大的倍数。诸如核酸的生物分子130的SERS检测方法是本领域已知的。通常，此类方法利用了胶体金属颗粒，诸如聚集的银纳米颗粒，其被涂到基质140和/或支持物上(如，美国专利5,306,403；6,149,868；6,174,677；6,376,177)。然而，以前的用于生物分子130检测的SERS或SERRS技术不能提供足够的灵敏性和/或特异性。下面提供了在所要求保护的方法、组合物和系统范围内的拉曼检测的更多细节。
拉曼标记
[0028]在本发明的一些实施方案中，RCA扩增产物170、230、250、330、410可以通过掺入的核苷酸的直接检测而被检测。例如，包含腺嘌呤或鸟嘌呤部分的嘌呤核苷酸显示出可以通过SERS或SERRS检测的独特信号。在可替代的实施方案中，待掺入到RCA扩增产物170、230、250、330、410中的一些核苷三磷酸前体可以用一种或多种拉曼标记进行标记，从而方便它们的检测、鉴定和/或定量。在其他的可替代实施方案中，核苷三磷酸前体可以用活性基团，诸如巯基、氨基、羧基、马来酰亚胺、生物素和/或本领域已知的其它活性体(moieties)共价修饰。在掺入到RCA扩增产物170、230、250、330、410之后，修饰的核苷酸可以用一种或多种拉曼标记进行标记，这些拉曼标记被设计成能够共价或非共价结合到活性基团上。掺入拉曼标记的另一种方法可以是将标记与寡核苷酸探针180偶联，而寡核苷酸探针180具有与RCA扩增产物170、230、250、330、410互补的序列，并将寡核苷酸180与RCA产物170、230、250、330、410杂交。当RCA程序主要产生单链产物170、330时，这样的杂交技术就被简化。例如在核苷三磷酸前体上存在的大体积拉曼标记可能干扰DNA聚合酶160活性的情况下，就可以应用这样的扩增后修饰。
[0029]用于检测生物分子130的各种拉曼标记是本领域已知的(例如美国专利5,306,403；6,002,471；6,174,677)，并且任何已知的拉曼标记都可以被使用。可以用于拉曼光谱术的标记的非限定性例子包括TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑)、得克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱、菁、黄嘌呤、琥珀酰荧光素和氨基吖啶。这些和其他的拉曼标记可以从商业渠道获得(如Molecular Probes，Eugene，OR)。
[0030]多环芳香族化合物通常可以用作拉曼标记，这在本领域是已知的。其他可以用于本发明的特定实施方案的标记包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫基团。在某些实施方案中，碳纳米管可以用作拉曼标记。
[0031]标记可以直接连接于核酸或可以通过各种连接化合物(linkercompounds)附着至核酸。可替代地，共价连接着拉曼标记的核苷酸前体可以从标准的商业渠道购得(例如Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。含有设计用于与其他分子诸如核苷酸或核酸共价反应的活性基团的拉曼标记可从商业渠道获得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。制备经标记的核苷酸和将它们掺入到核酸的方法是已知的(例如，美国专利4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
拉曼检测装置
[0032]各种在拉曼光谱术中有潜在应用价值的检测装置是本领域已知的，且任何已知的拉曼检测装置都可以被使用。拉曼检测装置的非限制性例子被公开于美国专利6,002,471中。在这个例子中，激发束由Nd:YAG激光器在532nm(纳米)波长处产生，或者由Ti:蓝宝石激光器在365nm波长处产生。脉冲激光束或连续激光束都可以被使用。激发束穿过共聚焦光学器件和显微镜物镜，可以聚焦于基质140上，该基质140含有附着的生物分子目标130。来自RCA扩增产物170、230、250、330、410的拉曼发射光可以被显微镜物镜和共聚焦光学器件收集，并偶联至用于光谱离解(spectral dissociation)的单色器上。共聚焦光学器件可以包括分色滤波器、阻挡滤波器、共焦针孔、透镜和反光镜的组合，它们用于降低背景信号。标准的全视场光学器件也能同共聚焦光学器件一样被使用。拉曼发射信号可以用拉曼检测器来检测。所述检测器可以包括与用于计算和信号数字化的计算机相接的雪崩二极管。在目标生物分子130的阵列将被分析的情况下，光学检测系统可以被设计用于检测和将拉曼信号定位于芯片或栅格的特定位置上。例如，发射光可以被引导到CCD(电荷耦合器件)照相机或其它检测器，其能够同时测量在检测场中的多象素或多组象素的光发射。
[0033]例如，在美国专利5,306,403中，公开了拉曼检测装置的可供选择的实例，其包括Spex Model 1403双-光栅分光光度计，装备有砷化镓光电倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries ModelC3103402)，其以单光子计数模式进行操作。激发原是514.5nm光谱线的氩离子激光，来自SpectraPhysics，Model 166；和647.1nm光谱线的氪离子激光(Innova 70，Coherent)。
[0034]可供选择的激发源包括但不局限于337nm处的氮激光器(LaserScience Inc.)和325nm处的氦-镉激光器(Liconox)(美国专利6,174,677)。激发束可以用带通滤光片(Corion)来进行光谱纯化，并且可以用6X物镜(Newport，Model L6X)聚焦于基质140上。通过使用全息分束器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，物镜可以被用来激发RCA扩增产物170、230、250、330、410和收集拉曼信号，从而产生激发束和发射的拉曼信号的直角几何关系。全息陷波滤波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)可以被用于减少瑞利散射辐射。可供选择的拉曼检测器包括但不局限于ISA HR-320摄谱仪，其配备有红色增强的强化电荷耦合器件(red-enhanced intensified charge-coupleddevice，RE-ICCD)检测系统(Princeton Instruments)。其他类型的检测仪也可以被使用，诸如电荷注入器件(charged injection devices)、光电二极管阵列和光电晶体管阵列。
拉曼活性金属纳米颗粒
[0035]在本发明的某些实施方案中，拉曼活性金属颗粒，诸如金或银纳米颗粒，可以被加到含有附着的RCA扩增产物170、230、250、330、410的基质上，以方便利用SERS或SERRS的拉曼信号检测。例如，可以使胶体纳米颗粒浆状物流过生物分子130阵列，其纳米颗粒密度足以保证阵列上每个生物分子130位置的SERS或SERRS信号。可替代地，可以将纳米颗粒直接沉积在生物分子130阵列或其他基质140上，其纳米颗粒浓度足以保证每个位置的SERS或SERRS信号。尽管可以提供表面增强拉曼信号的任何纳米颗粒密度都可以被应用，在本发明的特定实施方案中，确保相邻纳米颗粒或纳米颗粒聚合体之间相离1nm至20nm的颗粒密度可以被应用。在本发明的一些实施方案中，纳米颗粒可以通过直接与RCA扩增产物170、230、250、330、410相互作用而形成。例如，含有附着的RCA扩增产物170、230、250、330、410的阵列可以用醛例如戊二醛处理(例如，Keren et al.，Science297：72-75)。醛基基团可以共价修饰核酸，使它们成为金属盐的还原试剂。修饰的核酸可以被暴露于金属盐溶液，该溶液含有金属阳离子，例如硝酸银溶液(含有约0.2至2.0M的AgNO3)。Ag+阳离子会被醛基基团还原，产生银纳米颗粒，其与RCA扩增产物170、230、250、330、410紧密结合。
[0036]制备纳米颗粒的其他可供选择方法是已知的(例如，美国专利6,054,495；6,127,120；6,149,868；Lee and Meisel，J.Phys.Chem.86：3391-3395，1982)。纳米颗粒可以制备成纳米棱柱的形式(Jin et al.，″Photoinduced conversion of silver nanospheres to nanoprisms，″Science294：1901，2001)。纳米颗粒也可以从商业渠道购得(如，Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。
[0037]在本发明的某些实施方案中，纳米颗粒可以是纳米颗粒的随机聚集体(胶体纳米颗粒)。在本发明的其他实施方案中，纳米颗粒可以被交联，产生特定的纳米颗粒聚集体，诸如二聚体、三聚体、四聚体或其他聚集体。本发明的某些可供选择的实施方案可以使用不同尺寸的聚集体的异质混合物，而其他的可供选择的实施方案可以使用纳米颗粒聚集体的均质群体。在本发明的某些实施方案中，含有选定数量的纳米颗粒的聚集体(二聚体、三聚体等)可以用已知的技术来富集或纯化，这样的技术诸如在蔗糖梯度溶液中进行超离心。
[0038]交联纳米颗粒的方法是本领域已知的(参见，例如Feldheim，″Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges，″TheElectrochemical Society Interface，Fall，2001，pp.22-25)。金纳米颗粒与具有末端硫醇或巯基基团的连接化合物的反应是已知的(Feldheim，2001)。在本发明的一些实施方案中，纳米颗粒可以相互交联形成聚集体。在其他实施方案中，纳米颗粒有可能被直接连接于RCA扩增产物170、230、250、330、410。适合于与其他纳米颗粒或RCA扩增产物170、230、250、330、410发生交联的修饰的纳米颗粒可以从商业渠道获得，诸如来自Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)的Nanogold纳米颗粒。Nanogold纳米颗粒可以通过将单个或多个马来酰亚胺、胺或其他基团粘附到每个纳米颗粒而获得。Nanogold纳米颗粒也可以是带正电或带负电的形式，以方便纳米颗粒在电场中的控制，从而使得能够通过电动力学或其他方法来操纵纳米颗粒。
生物分子阵列
[0039]在本发明的一些实施方案中，目标生物分子130和/或RCA扩增产物170、230、250、330、410可以被附着至基质140、阵列和/或芯片上。如本文中所使用的，术语“芯片”、“基质”140和“阵列”可以互换使用。生物分子130芯片的制备和使用方法是本领域已知的，任何此种已知的方法都可以被应用(诸如美国专利5,143,854；5,874,219；6,040,138；6,124,102；6,203,989；6,225,625；6,252,236；6,399,365；6,410,229；6,416,952)。可以使用不同的方法来制造生物分子130芯片，包括在芯片表面140上直接合成生物分子130或生物分子130的配体。可替代地，生物分子130或它们的配体可以先被合成或纯化，然后连接到芯片表面140上。许多可替代的方法是已知的，例如将第一捕捉抗体120附着到芯片，使用该第一抗体120结合并固定目标生物分子130，然后加入被标记的第二抗体120，以检测生物分子130。这样的“夹心”分析系统可以被用于所要求保护的方法中，第二抗体120则被共价连接到寡核苷酸引物110、220上，如图1所示的免疫RCA方案中的情况。在本发明的相关实施方案中，在生物分子130的配体被连接到芯片的情况下，该配体可以再被用于结合生物分子130。该配体-生物分子130复合体可以通过结合诸如抗体120的第二配体而被检测，该第二配体结合于生物分子130的不同区域。可以用于制造生物分子130阵列的各种芯片基质140可以商购得到(例如，NanoChipTM System，Nanogen，San Diego，CA；GeneChip，Affymetrix，Santa Clara，CA)并加以使用。
生物分子连接到基质上
[0040]在本发明的各种实施方案中，生物分子130可以通过连接到固体基质140上而被固定化。生物分子130可以通过多种已知的方法被固定化，这些方法涉及非共价连接或共价连接。例如，可以通过用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白涂覆固体基质140并结合偶联至生物素的生物分子130来实现固定化。也可以通过用聚-L-赖氨酸或氨基硅烷涂覆硅、石英、PDMS(聚二甲基硅氧烷)或其他固体基质140，然后使用双功能交联试剂共价连接含氨基或含巯基的生物分子130来进行固定化。可以使用的双功能交联试剂包括戊二醛、双功能环氧乙烷、乙二醇二缩水甘油醚和碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
[0041]在本发明的可供选择的实施方案中，将被连接到生物分子130的基质140可以先用标准的照相平版印刷术和蚀刻技术形成图案，以产生微米尺度或纳米尺度的生物分子130连接区域。例如，基质140可以用薄的一层金涂覆。金可以直接与生物分子130的巯基残基偶联。可替代地，可以使用连接基团诸如巯基苯甲酸和/或巯基棕榈酸，在金片上形成单层(例如，Liu and Amro，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：5165-70，2002)。在这种情况下，巯基部分结合到金片上，这使得生物分子130可以，例如，通过在所述单层上的酸性部分和生物分子130上的氨基基团之间经由碳二亚胺催化形成共价键，来进行连接。可替代地，单层上的羧基基团和生物分子130上的酸性残基之间能形成酸-酸二聚体氢键或酸酐键。
[0042]通过将生物分子130上的酸性残基直接共价连接到化学修饰的基质140例如酸处理过的硅上，可以进行固定化。生物分子130和固体基质140之间的共价键可以通过用交联试剂进行缩合而形成。
[0043]通过首先对基质140进行硅烷化处理，然后用碳二亚胺或戊二酸进行活化，可以将生物分子130连接到基质140上。可替代的程序可以使用诸如3-环氧丙基氧丙基三甲氧基硅烷或氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)，通过氨基连接物与生物分子130连接。其他的固定化生物分子130的方法是已知的，并可以被使用。在本发明的某些实施方案中，可以将捕获寡核苷酸连接到基质140上。捕获寡核苷酸能与核酸生物分子130上的特异性序列杂交。
[0044]待用于固定化生物分子130的基质140的类型是不受限制的。在各种实施方案中，固定化基质140可以是石英、PDMS、硅、氧化硅、二氧化硅、氮化硅、锗或本领域已知的任何其他基质140。
微电子机械系统(MEMS)
[0045]在本发明的一些实施方案中，含有附着的生物分子130和/或RCA扩增产物170、230、250、330、410的基质140、阵列和/或芯片可以被整合到更大的设备和/或系统中，诸如微流态系统。在某些实施方案中，基质140可以被整合到微电子机械系统(MEMS)中。MEMS是包括机械元件、传感器、执行器和电子器件的整合系统。所有这些组件通过已知的微加工技术在普通的芯片上制造，所述芯片包括硅基或等同的基质140(例如，Voldman et al.，Ann.Rev.Biomed.Eng.1：401-425，1999)。MEMS的传感器组件可以被用来测量机械、热、生物、化学、光学和/或磁现象，诸如拉曼发射信号。电子器件可以处理来自传感器的信息，并控制执行器组件，诸如泵、阀、加热器、冷却器、过滤器等，从而控制MEMS的功能。
[0046]MEMS的电子组件可以使用集成电路(IC)工艺(如CMOS、Bipolar或BICMOS工艺)制造。它们可以使用在计算机芯片制造中已知的光刻蚀和蚀刻方法来成型。微机械组件可以用相容的“微机械加工”工艺制造，该工艺选择性地蚀刻掉部分的硅晶片或加入新的结构层，从而形成机械和/或机电组件。
[0047]制造MEMS的基本技术包括，在基质140上沉积薄膜材料，通过照相平版印刷成像或其他已知的光刻蚀方法在膜顶部施加具有一定图案的掩蔽，并选择性地蚀刻该膜。薄膜的厚度可以在几纳米至100纳米的范围内。使用的沉积技术包括化学方法，诸如化学气相沉积(CVD)、电沉积、外延生长和热氧化，和物理程序，诸如物理气相沉积(PVD)和铸造。制造纳米机电系统的方法可以被用于本发明的某些实施方案中(参见，例如Craighead，Science 290：1532-36，2000)。
[0048]在本发明的一些实施方案中，一个或多个基质140、阵列和/或芯片可以被连接到各种充满流体的腔室，诸如微流态通道、纳米通道和/或微通道。设备或系统的这些组件和其他组件可以形成为一个单元，例如，芯片的形式，正如在半导体芯片和/或微毛细管或微流态芯片中所知的。作为选择，基质140、阵列和/或芯片可以作为独立的单元，然后连接至该设备或系统的其他组件。已知用于制造基质140、阵列或芯片的任何材料都可以被使用，包括但不局限于硅、二氧化硅、氮化硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、塑料、玻璃、石英等。
[0049]分批制造芯片的技术是计算机芯片制造和/或微毛细管芯片制造领域已知的。此类芯片可以用本领域任何已知的方法制造，诸如照相平版印刷和蚀刻、激光烧蚀、喷射模塑、铸造、分子束取向生长、蘸笔纳米刻蚀、化学气相沉积(CVD)加工、电子束或聚焦离子束技术或印刷技术。非限定性例子包括：用可流动的、光学上清晰的材料诸如塑料或玻璃进行常规模塑；二氧化硅的光刻蚀和干法蚀刻；应用甲基丙烯酸甲酯抗蚀剂进行电子束刻蚀，使氮化硅基质140上的铝掩膜形成图案，随后进行活性离子蚀刻。各种形式的微制造芯片可以从商业渠道获得，例如Caliper Technologies Inc.(Mountain View，CA)和ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
[0050]在本发明的某些实施方案中，设备或系统的部分或全部可以被选择为对用于拉曼光谱术的处于激发和发射频率的电磁辐射是透明的，诸如玻璃、硅、石英或光学上清晰的其它任何材料。对于可以暴露于各种生物分子130诸如蛋白质、肽、核酸、核苷酸和类似物的充满流体的室，暴露于这些分子的区域可以通过涂覆被修饰，以便例如将疏水性区域转化为亲水性区域，和/或减少分子的吸附。对普通的芯片材料诸如玻璃、硅、石英和/或PDMS的修饰是本领域已知的(如美国专利6,263,286)。此类修饰可以包括但不局限于用可商业获得的毛细涂料(Supelco，Bellafonte，PA)、具有各种功能基团诸如聚乙烯氧化物或丙烯酰胺的硅烷，或本领域已知的任何其他涂料进行涂覆。
利用SERS和RCA进行的生物分子检测
[0051]滚环扩增技术可以与SERS或SERRS组合使用，以检测、鉴定和/或定量各种生物分子130。在本发明的实施方案中，当待检测的生物分子130是核酸、多核苷酸或寡核苷酸时，滚环扩增是直线前进的。环状DNA模板150、210、310被设计成包含能与目标核酸130的3′端杂交的序列。合适的前体、酶和辅因子被加入，RCA扩增产物170、230、250、330、410形成。取决于是进行LRCA还是ERCA，所得到的结果将是单链扩增产物170、330或分支的双链扩增产物230、250、410。在ERCA中，使用标记的寡核苷酸探针180进行荧光检测是不可行的。对于LRCA或者ERCA，拉曼检测都可以被用于检测、鉴定和/或定量目标生物分子130。
[0052]在本发明的可供选择的实施方案中，目标生物分子130可以是肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、糖脂或其他分子，对于它们，可以使用肽或蛋白配体诸如抗体120作为结合和检测试剂。在这些情况下，免疫RCA的某些变型可以与LRCA或者ERCA使用。单克隆抗体120、多克隆抗体120、抗体120片段(例如，FAb片段)、人源化抗体120、单链抗体120和嵌合抗体120可以由商业渠道购得或由已知的技术制备(例如，Harlow and Lane， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1988)。使用已知的方法，可以将寡核苷酸引物110、220的5′端连接到抗体120或其他的蛋白或肽配体(例如，Schweitzer et al.，2000；Schweitzer et al.，2002)。
[0053]将引物110、220连接到抗体120或其他蛋白上的各种方法是已知的。例如，巯基残基可以与acrydite修饰的引物110、220共价交联。巯基残基也可以与5′氨基标记的引物110、220共价交联，其中使用N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺丁酸作为交联试剂。赖氨酸、精氨酸或N-未端氨基酸的氨基基团可以与硫醇化的引物110、220交联，其使用同样的交联剂。可替代地，水溶性碳二亚胺可以用于交联5′羧化引物110、220到氨基酸的氨基部分。通过与IO4和硼氢化钠反应，羟基基团(如丝氨酸、苏氨酸)可以被交联到含有5′氨基基团的引物110、220上。将引物110、220交联到蛋白质或肽的许多可供选择的方法都是已知的，并且可以被使用。
[0054]本发明的示范性实施方案图示于图3，其显示了与LRCA联合的拉曼检测。如图1，目标生物分子130可以被附着到基质140。可以针对其获得抗体120或其他蛋白、肽或核酸配体的任何目标生物分子130，都可以被检测，只要所述配体以相对高的特异性与感兴趣的目标130结合。对于抗体120、肽或蛋白配体的情况，通过图3中的抗体120来示例的配体可以偶联到寡核苷酸引物110上，如同图1中所示的情况。
[0055]拉曼检测的若干变型都可以被使用。在示于图3的示范性实施方案中，被设计成含有一个或多个多聚胸苷320(T)残基的环状DNA模板310被杂交到寡核苷酸引物110上。一旦加入DNA聚合酶160、dNTP和辅因子，就可以形成延伸的单链RCA扩增产物330，其包含有多个多聚腺苷340(A)残基。多聚腺苷酸340可以直接被SERS或SERRS检测。作为选择，被设计成具有独特的拉曼特征的寡核苷酸探针180，可以被杂交到LRCA扩增产物330上，并被检测。
[0056]使用公开于实施例1中的拉曼检测装置，在包含有少至60个分子的腺嘌呤的样品中，SERS信号也已经被检测到(实施例1)。在荧光检测中，高浓度的荧光体可能导致自猝灭，相反，这里将腺嘌呤掺入核酸可产生增强的信号，而不是自猝灭。含有30个连续腺嘌呤残基(A)30的多聚腺苷酸340分子产生相当于10倍于同等数量的脱氧腺苷-5′-单磷酸(dAMP)分子的SERS信号(数据未显示)。具有掺入的多聚腺苷酸340的单链LRCA扩增产物330可以含有高达105个腺嘌呤残基，从而给出非常强的放大的SERS信号350，这使得能够检测单个拷贝的目标生物分子130。
[0057]同样的方法可以用于ERCA(图4)，其具有更大的信号扩增。该程序是以可以附着到基质140上的生物分子130作为起始。在图4的非限制性的实例中，生物分子130结合于抗体120，而抗体120被偶联到寡核苷酸引物110上。如同图3所示的情况，含有一个或多个多聚胸苷残基320的单链DNA模板310被杂交到引物110。如图2所图示，然后进行ERCA程序，导致高度分支的ERCA扩增产物410的形成，该扩增产物410含有多个多聚腺苷酸420残基。在ERCA产物410中的多聚腺苷酸420残基可以直接用拉曼技术，例如SERS或SERRS检测。可替代地，扩增产物410可以整合一个或多个拉曼标记，以方便检测、鉴定和/或定量。如上面所述，可以通过使用用拉曼标记共价标记的核苷酸前体，将拉曼标记直接掺入到扩增产物410中。可替代地，可以在扩增产物410被合成之后，再加入拉曼标记。在任何情况下，高度放大的拉曼信号430都会产生。
[0058]ERCA程序导致拉曼信号放大109倍或更多。考虑到通过多个多聚腺苷酸420残基产生的信号增强，ERCA与SERS或SERRS检测的联合将使得生物分子130的超高灵敏性检测可以达到单个分子的水平。相比起RCA扩增产物170、230、250、330、410的标准荧光检测方法，这些方法显示出明显高得多的灵敏性。相比起LRCA扩增产物170、330的荧光检测，ERCA扩增产物230、250、410的SERS检测在信号强度上应该能增加至少三个数量级。
[0059]对于任一RCA程序，可以使用任何已知的定量方法，通过拉曼光谱术对样品中的一种或多种目标生物分子130进行定量。例如，可以通过检测发射出的拉曼信号或定点计数(spot counting)，来进行定量。在定点计数中，可以使用窄的激光激发束(直径小于1μm)扫描表面或基质140，以确定独立扩增事件的数量，以及有多少种扩增事件与给定的目标130有关。定点计数方法可以避免由不完全或不充分的DNA扩增或胶体聚合所引起的强度变化。
                          实施例
实施例1：利用SERS的RCA产物检测
银纳米颗粒形成
[0060]用于SERS检测的银纳米颗粒用已知的方法生产(Lee andMeisel，1982)。将18毫克的AgNO3溶解于100mL(毫升)蒸馏水中，加热至沸腾。将10mL 1％柠檬酸钠溶液滴加到AgNO3溶液，滴加的时间为10分钟。溶液再保持沸腾1小时。将获得的银胶体溶液冷却并保存。
拉曼检测装置
[0061]激发束由钛:蓝宝石激光器(Tsunami，Spectra-Physics)在近红外线波长处(750-950nm)，或由砷化铝镓二极管激光器(PI-ECL系列，Process Instruments)在785nm或830nm处产生。可以使用脉冲激光束或连续光束。激发束被分色镜(Kaiser Optical的全息陷波滤波器，或者，Chroma或Omega Optical的干涉滤波器)反射，与收集的光束形成共线几何关系。反射束穿过显微镜物镜(Nikon LU系列)，聚焦到基质140上，该基质140上带有生物分子130。拉曼散射光用同样的显微镜物镜收集，并通过分色镜传至拉曼检测仪。拉曼检测仪包括聚焦透镜、摄谱仪和阵列检测器。聚焦透镜将拉曼散射光聚焦通过摄谱仪的入口狭缝。摄谱仪(RoperScientific)包含光栅，其按照波长将光分散。分散的光被成像在阵列检测仪(RoperScientific的Back-illuminatedDeep-depletion CCD照相机)上。该阵列检测仪被连接至控制器电路，其又被连接到用于数据转移和检测仪功能控制的计算机上。
腺嘌呤的SERS检测
[0062]将1mL的银胶体溶液用2mL的蒸馏水稀释。稀释的银胶体溶液(160μL)(微升)与20μL的10nM腺嘌呤溶液和40μL的LiCl(0.5M)在铝盘上混和。LiCl充当腺嘌呤的拉曼增强剂。腺嘌呤在样品中的最终浓度是0.9nM，检测体积约100至150毫微微升，含有估算出的60个腺嘌呤分子。使用激发原在785nm处激发，收集拉曼发射光谱，收集时间为100毫秒。
[0063]如图5所示，该程序显示了60个腺嘌呤分子的灵敏性检测，在约833nm和877nm处检测到强的发射峰。这些结果证明SERS能用于腺嘌呤的灵敏性检测，而腺嘌呤是RCA扩增产物170、230、250、330、410的组成成分。
滚环扩增
[0064]SERS检测在鉴定RCA扩增产物170、230、250、330、410时的有效性被证实。将1皮摩(pmol)的RCA引物110、220加入到0.1pmol的环状单链M13 DNA模板150、210、310。混合物用1×T7聚合酶160缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇)、0.5mM的dNTPs和2.5单位的T7 DNA聚合酶160在37℃温育2小时，导致RCA产物170、230、250、330、410的形成。通过在没有DNA聚合酶160的情况下混和和温育同样的试剂，制备阴性对照。
RCA产物的SERS检测
[0065]将1μL的RCA产物170、230、250、330、410和1μL的阴性对照样品在铝盘上分别点样，并在空气中干燥。每个样品点用5μL的1×PBS(磷酸盐缓冲液)漂洗。反复漂洗3次，在最后一次漂洗后，将铝盘在空气中干燥。
[0066]如上制备的1毫升的银胶体溶液用2mL的蒸馏水稀释。将8微升的稀释的银胶体溶液与2μL的0.5M LiCl混合，并加到在铝盘上的RCA产物170、230、250、330、410样品点上。同样的溶液被加到阴性对照样品点上。按如上公开的方法收集拉曼信号。结果如图6A和图6B所示。如图6A所示，RCA产物170、230、250、330、410很容易地用SERS检测到，发射峰约在833和877nm。在该程序条件下，应用了LiCl增强剂，腺嘌呤部分的信号强度比鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的强。阴性对照(图6B)显示拉曼信号对RCA产物170、230、250、330、410具有特异性，因为在缺少扩增的情况下未观察到信号。因为只有一种引物110、220被加入，所以图6显示的是SERS在检测LRCA扩增产物170、330中所起的作用。由于ERCA提供了更多倍的扩增，所以ERCA扩增产物230、250、410会显示出更强的信号。这些结果表明，LRCA和ERCA可以与SERS检测联合用来鉴定目标生物分子130。
[0067]在本公开内容的教导下，无需过度的实验，便可以制造和应用本文中所有公开和要求保护的方法、组合物和系统。很明显地，对本领域的技术人员来说，可以对本文中描述的方法、组合物和系统进行变化，而不会脱离所要求保护的主题的概念、精神和范围。更特别地，某些相关的试剂明显可以替代本文中描述的试剂，同时能获得同样的或类似的结果。所有对本领域技术人员显而易见的替代和修饰都被认为在所要求保护的主题的精神、范围和概念内。

Claims (32)

1.一种方法，包括：
a)将一种或多种目标生物分子连接到基质上；
b)使用第一引物来产生一种或多种滚环扩增(RCA)产物；
c)通过拉曼光谱术来检测每一种扩增产物；和
d)通过一种或多种扩增产物的存在来鉴定一种或多种目标生物分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中，每种扩增产物都附着于目标生物分子上。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述目标生物分子是核酸、多核苷酸或寡核苷酸。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述核酸是RNA或DNA。
5.如权利要求3所述的方法，其中，所述第一引物包含目标生物分子的3′端。
6.如权利要求3所述的方法，其中，所述第一引物杂交到所述目标生物分子。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述目标生物分子是肽、多肽或蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述目标生物分子结合到一个或多个配体上。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述配体偶联到所述第一引物上。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述配体是抗体、抗体片段、单链抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述滚环扩增是线性RCA(LRCA)或指数RCA(ERCA)。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述拉曼光谱术是表面增强拉曼光谱术(SERS)或表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)。
13.如权利要求1所述的方法，进一步包括将环状的单链DNA模板与所述第一引物杂交，所述模板包含一个或多个多聚胸苷残基。
14.如权利要求11所述的方法，其中，所述滚环扩增是ERCA，并且第二引物被加入到扩增反应混合物中。
15.如权利要求1所述的方法，进一步包括将所述扩增产物暴露于银胶体溶液。
16.如权利要求1所述的方法，进一步包括通过含水金属盐与扩增产物之间的反应产生金属纳米颗粒。
17.如权利要求16所述的方法，进一步包括用醛处理所述扩增产物，从而形成还原试剂。
18.如权利要求16所述的方法，其中，所述金属盐包括Ag+、Cu+、Cu2+、Au+、Au3+、Pd2+、Pd4+或Al3+。
19.如权利要求1所述的方法，进一步包括将一种或多种拉曼标记掺入到扩增产物中。
20.如权利要求1所述的方法，进一步包括对一种或多种目标生物分子进行定量。
21.一种用于检测生物分子的系统，包括：
a)连接到基质上的一种或多种目标生物分子；
b)与所述目标生物分子相联系的一种或多种滚环扩增产物；和
c)用于检测所述扩增产物的拉曼检测仪。
22.如权利要求21所述的系统，进一步包括用来激发所述扩增产物的激发光源。
23.如权利要求22所述的系统，其中，所述光源包括激光器。
24.如权利要求21所述的系统，其中，所述拉曼检测仪包括选自下列的一种或多种部件：CCD照相机、雪崩二极管、分光光度计、光电倍增管、摄谱仪、电荷注入器件、光电二极管阵列、阵列检测器和光电晶体管阵列。
25.如权利要求21所述的系统，进一步包括金属纳米颗粒。
26.如权利要求25所述的系统，其中，所述纳米颗粒包括至少一种选自银、金、铜、铂和铝的金属。
27.如权利要求21所述的系统，进一步包括附着到所述扩增产物的一种或多种拉曼标记。
28.如权利要求21所述的系统，进一步包括用来分析从所述拉曼检测仪获得的数据的计算机。
29.一种组合物，包括：
a)一种或多种目标生物分子；
b)与目标生物分子相联系的一种或多种滚环扩增产品；和
c)一种或多种纳米颗粒，其靠近所述的扩增产品。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述扩增产品包括一种或多种引物。
31.如权利要求29所述的组合物，进一步包括环状DNA模板，所述模板包括一个或多个多聚胸苷残基。
32.如权利要求29所述的组合物，进一步包括一种或多种拉曼标记，其通过杂交、嵌入或与扩增产物中的修饰碱基反应而附着到所述扩增产品上。
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