JP4885712B2 - ローリングサークル増幅およびsers検出による生体分子の分析方法 - Google Patents
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Description
本発明の態様は、生体分子130の分析の分野に関する。特に、ローリングサークル増幅および生体分子130のラマン検出に関連するシステム、組成物、および方法に関する。
医学診断、病理学、毒物学、疫学、生物戦(biological warfare)、環境試料採取、法医学、および他の多くの分野において幅広い潜在的用途を有する、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、脂質、多糖類、ホルモン、神経伝達物質、代謝産物などの低濃度の生体分子の高感度かつ正確な検出、同定、および/または定量は、達成しがたい目標であることがわかっている。現在の検出方法は典型的に、標的生体分子に結合することができる蛍光標識した捕捉分子またはリガンドの検出を含む。蛍光標識抗体またはプローブオリゴヌクレオチドが、それぞれ標的タンパク質または核酸に結合しかつこれを検出するために、典型的に用いられる。交差反応性および非特異的結合は、複合試料中における生体分子の蛍光検出を複雑にすることがある。高い特異性が得られる場合であっても、蛍光検出の感度は低濃度の生体分子を同定するのに不十分であることが多い。このことは、検出される生体分子が他の分子の複合混合物中に低濃度で存在する場合であって、干渉、蛍光消光、および高いバックグラウンド蛍光が全て、標的生体分子からのシグナルを不明瞭にするかまたは減少させるように作用しうる場合に、特にあてはまる。
定義
本明細書で使用される、「1つの(a)」または「1つの(an)」は、項目の1つまたは複数を意味しうる。
本発明の様々な態様において、開示された方法は、ローリングサークル増幅(RCA)を含みうる。ローリングサークル増幅のための技術は当技術分野で公知である(例えば、Baner et al, Nucleic Acids Research, 26:5073-5078, 1998;Lizardi et al., Nature Genetics 19:226, 1998;Schweitzer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10113-119, 2000;Faruqi et al., BMC Genomics 2:4, 2000; Nallur et al., Nucl. Acids Res. 29:e118, 2001;Dean et al. Genome Res. 11:1095-1099, 2001;Schweitzer et al., Nature Biotech. 20:359-365, 2002;米国特許第6,054,274号、第6,291,187号、第6,323,009号、第6,344,329号および第6,368,801号を参照されたい)。線形RCA(linear RCA:LRCA)および指数RCA(exponential RCA:ERCA)を含む、RCAのいくつかの異なる変種が公知である。
図1にLRCAの一般的なプロトコルを例示する。この例において、RCA用のプライマー110を、生体分子130に結合し、かつこれを認識することができる抗体120に結合させる。したがって、このRCA変種は時にイムノRCA(immunoRCA)と称される(Schweitzer et al., 2000)。生体分子130は基板140に結合させてもよく、これによりシグナルの局在化および検出を可能にする。プライマー110に相補的な配列を有する一本鎖環状DNAテンプレート150を、プライマー110にハイブリダイズさせる。適切なdNTP(デオキシヌクレオシド三リン酸)前駆体および他の補助因子の存在下において、DNAポリメラーゼ160を添加すると、プライマー110が伸長される。テンプレート150の配列は環状であるため、テンプレート150の配列の複数のコピーが複製され、プライマー110に結合する。
非常に低い存在量の標的生体分子130の検出に関して、LRCAプロトコルは、高感度でかつ信頼性のある検出に十分なシグナル増幅を提供しない可能性がある。もう一つのRCA変種、指数RCA(ERCA)が、ローリングサークル技術を用いたさらなるシグナル増幅を提供するために開発された(図2)。
ラマン分光法
本発明の一定の態様において、標的生体分子130を検出、同定、および/または定量するために、ローリングサークル増幅をラマン検出と組み合わせて使用してもよい。表面増強ラマン分光法(SERS)、表面増強共鳴ラマン分光法(surface enhanced resonance Raman spectroscopy:SERRS)、通常ラマン散乱、共鳴ラマン散乱、コヒーレント反ストークスラマン分光法(coherent anti-Stokes Raman spectroscopy:CARS)、誘導ラマン散乱、逆ラマン分光法(inverse Raman spectroscopy)、誘導ゲインラマン分光法、ハイパーラマン散乱、分子光学レーザーエグザミナー(molecular optical laser examiner:MOLE)もしくはラマンマイクロプローブもしくはラマン顕微鏡法もしくは共焦点ラマン顕微分光法、三次元もしくは走査ラマン、ラマン飽和分光法、時間分解共鳴ラマン、ラマン脱共役分光法(Raman decoupling spectroscopy)、またはUV-ラマン顕微鏡法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意のラマン検出様式を使用してもよい。
本発明のいくつかの態様において、RCA増幅産物170、230、250、330、410を、組み込まれたヌクレオチドの直接検出によって検出してもよい。例えば、アデニン部分またはグアニン部分を含むプリンヌクレオチドは、SERSまたはSERRSによって検出することができる固有のシグナルを示す。別の態様において、RCA増幅産物170、230、250、330、410に組み込まれるヌクレオシド三リン酸前駆体の一部を、1つまたは複数のラマン標識で標識し、それらの検出、同定、および/または定量を容易にしてもよい。他の別の態様において、ヌクレオシド三リン酸前駆体を、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル、マレイミド、ビオチン、および/または当技術分野で公知の他の反応性部分などの反応性基で、共有結合的に修飾してもよい。RCA増幅産物170、230、250、330、410に組み込んだ後、修飾ヌクレオチドを、共有結合的または非共有結合的に反応性基に結合するよう設計された1つまたは複数のラマン標識で標識してもよい。ラマン標識を組み込むもう一つの方法は、標識をRCA増幅産物170、230、250、330、410に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ180と結合させ、オリゴヌクレオチド180をRCA増幅産物170、230、250、330、410にハイブリダイズさせるものである。そのようなハイブリダイゼーション技術は、RCAプロトコルが主に一本鎖の産物170、330を生じる場合に単純化される。そのような増幅後修飾は、例えば、ヌクレオシド三リン酸前駆体上のかさ高いラマン標識の存在が、DNAポリメラーゼ160の活性を妨げる可能性がある場合に使用されうる。
ラマン分光法において有用でありうる様々な検出ユニットが当技術分野において公知であり、任意の公知のラマン検出ユニットを用いてよい。ラマン検出ユニットの非限定的な例は、米国特許第6,002,471号に開示されている。この例において、励起ビームは、532nm(ナノメートル)波長のNd:YAGレーザー、または365nm波長のTi:サファイアレーザーのいずれかによって生成される。パルスレーザービームまたは連続レーザービームを使用してもよい。励起ビームは、共焦点光学系(optics)および顕微鏡の対物レンズを通過し、結合した生体分子標的130を含む基板140上に集束されうる。RCA増幅産物170、230、250、330、410からのラマン放射光は、スペクトル分離のためのモノクロメーターに連結された、顕微鏡の対物レンズおよび共焦点光学系によって収集されうる。共焦点光学系は、バックグラウンドシグナルを低減するための、二色フィルター、バリアフィルター、共焦点ピンホール、レンズ、およびミラーの組み合わせを含みうる。共焦点光学系と同様に、標準全領域光学系(standard full field optics)を使用することができる。ラマン放射シグナルをラマン検出器によって検出してもよい。検出器は、シグナルの計数およびデジタル化のためのコンピュータと接続(interfaced)したアバランシェフォトダイオードを含みうる。標的生体分子130のアレイを分析する場合、光学検出系は、ラマンシグナルを検出し、かつチップまたはグリッド上の特定の位置に限局化させるように設計されうる。例えば放射光は、CCD(電荷結合素子)カメラ、または検出領域内の複数のピクセルもしくはピクセル群からの光放射を同時に測定することができるその他の検出器に導かれうる。
本発明の一定の態様において、SERSまたはSERRSによるラマンシグナル検出を容易にするために、金または銀ナノ粒子などのラマン活性金属粒子を、結合したRCA増幅産物170、230、250、330、410を含む基板140に添加してもよい。例えば、コロイドナノ粒子のスラリーを、アレイ上の各生体分子130の位置からのSERSまたはSERRSシグナルを提供するのに十分なナノ粒子密度で、生体分子130のアレイ上に流すことができる。または、ナノ粒子を、各位置からのSERSまたはSERRSシグナルを提供するのに十分な密度で、生体分子130のアレイまたは他の基板140上に直接沈着することができる。表面増強ラマンシグナルを提供する任意のナノ粒子密度を使用してもよいが、本発明の特定の態様において、隣接するナノ粒子またはナノ粒子凝集物の間に1nmから20nmの分離を提供する粒子密度が使用されうる。本発明のいくつかの態様において、ナノ粒子はRCA増幅産物170、230、250、330、410との直接相互作用によって形成されてもよい。例えば、結合したRCA増幅産物170、230、250、330、410を含むアレイを、グルタルアルデヒドなどのアルデヒドで処理することができる(例えば、Keren et al., Science 297:72-75)。アルデヒド基は核酸を共有結合的に修飾することができ、核酸を金属塩の還元剤にする。修飾された核酸は、金属陽イオンを含む金属塩溶液、例えば硝酸銀溶液(0.2〜2.0MのAgNO3を含む)に曝露されうる。Ag+陽イオンはアルデヒド基により還元され、RCA増幅産物170、230、250、330、410と密接に結合した銀ナノ粒子を生じる。
本発明の一定の態様において、標的生体分子130および/またはRCA増幅産物170、230、250、330、410を、基板140、アレイおよび/またはチップに結合させてもよい。本明細書において使用されるように、「チップ」、「基板」140、および「アレイ」という用語は交換可能に使用される。生体分子130チップの製造および使用方法は当技術分野で公知であり、そのような任意の公知の方法を使用してよい(例えば米国特許第5,143,854号;第5,874,219号;第6,040,138号;第6,124,102号;第6,203,989号;第6,225,625号;第6,252,236号;第6,399,365号;第6,410,229号;第6,416,952号)。異なる方法を用いて生体分子130チップを作製してもよく、これにはチップ表面140上に直接生体分子130または生体分子130のリガンドを合成することが含まれる。または、生体分子130またはそのリガンドを合成または精製し、その後チップ表面140に結合させてもよい。多くの別の方法、例えば、第1の捕捉抗体120をチップに結合させ、第1の抗体120を用いて標的生体分子130に結合しかつこれを固定化し、その後第2の標識抗体120を添加して生体分子130を検出する方法などが公知である。このような「サンドイッチ」アッセイ系を、図1に例示されるイムノRCAプロトコルにあるようなオリゴヌクレオチドプライマー110、220に共有結合的に結合した第2の抗体120と共に、本発明の方法において用いることができる。生体分子130に対するリガンドをチップに結合させる本発明の関連する態様において、その後リガンドを用いて生体分子130を結合させてもよい。生体分子130の異なる領域に結合する、抗体120などの第2のリガンドの結合により、リガンド-生体分子130複合体を検出してもよい。生体分子130アレイを作製するために使用してもよい様々なチップ基板140が市販されており(例えば、NanoChip(商標)System, Nanogen, San Diego, CA;GeneChip(登録商標), Affymetrix, Santa Clara, CA)、それらを使用してもよい。
本発明の様々な態様において、生体分子130は、固体基板140へ結合させることにより固定化されてもよい。生体分子130は、非共有結合または共有結合を伴う様々な公知の方法により固定化されてもよい。例えば、固定化は、固体基板140をストレプトアビジンまたはアビジンでコーティングし、ビオチンが結合した生体分子130を結合させることによって達成してもよい。固定化はまた、珪素、石英、PDMS(ポリジメチルシロキサン)または他の固体基板140をポリ-L-Lysまたはアミノシランでコーティングした後、アミノまたはスルフヒドリルのいずれかを含有する生体分子130を、二官能性架橋試薬を用いて共有結合させることによって起こりうる。潜在的に有用な二官能性架橋試薬には、グルタルアルデヒド、二官能性オキシラン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、およびカルボジイミド(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなど)が含まれる。
本発明のいくつかの態様において、結合した生体分子130および/またはRCA増幅産物170、230、250、330、410を含む基板140、アレイ、および/またはチップを、微小流体システムなどのより大きな装置および/またはシステムに組み込んでもよい。一定の態様において、基板140を微小電気機械システム(MEMS)に組み込んでもよい。MEMSは、機械的要素、センサー、アクチュエータ、および電子機器を含む統合システムである。それらの構成部分の全ては、シリコンベースの、または同等の基板140を含む通常のチップに対する、公知の微細加工技術により製造されうる(例えば、Voldman et al., Ann. Rev. Biomed. Eng. 1:401-425, 1999)。MEMSのセンサー構成部分は、機械的、熱的、生物学的、化学的、光学的、および/または磁気的現象(ラマン放射シグナルなど)を検出するために使用されうる。電子機器は、センサーおよび制御アクチュエータ構成部分(ポンプ、バルブ、加熱器、冷却器、フィルターなど)からの情報を処理することができ、それによりMEMSの機能を制御することができる。
ローリングサークル増幅技術をSERSまたはSERRSと組み合わせて、広範な種類の生体分子130を検出、同定、および/または定量することができる。検出される生体分子130が核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドである本発明の態様において、ローリングサークル増幅は単純明快である。標的核酸130の3'末端にハイブリダイズする配列を含むように、環状DNAテンプレート150、210、310を設計する。適切な前駆体、酵素、および補助因子を添加し、RCA増幅産物170、230、250、330、410を形成させる。LRCAまたはERCAのどちらを行うかに応じて、結果は一本鎖増幅産物170、330となるか、または分岐した二本鎖増幅産物230、250、410となる。ERCAの場合、標識オリゴヌクレオチドプローブ180を用いた蛍光検出は実現可能でない。LRCAまたはERCAのいずれかを用いれば、ラマン検出を使用して標的生体分子130を検出、同定、および/または定量することができる。
実施例1:SERSによるRCA産物の検出
銀ナノ粒子の形成
SERS検出に使用する銀ナノ粒子を公知の方法により作成した(Lee and Meisel, 1982)。18mgのAgNO3を100mL(ミリリットル)の蒸留水に溶解し、加熱して沸騰させた。10mLの1%クエン酸ナトリウム溶液を、10分間にわたってAgNO3溶液に滴加した。溶液をさらに1時間沸騰させたままにした。得られた銀コロイド溶液を冷却して保存した。
励起ビームは、近赤外波長(750〜950nm)のチタン:サファイアレーザー(Spectra-PhysicsによるTsunami)、または785nmもしくは830nmの砒化アルミニウムガリウムダイオードレーザー(Process InstrumentsによるPI-ECLシリーズ)により生成された。パルスレーザービームまたは連続ビームを使用してもよい。励起ビームを、二色性ミラー(Kaiser Opticalによるホログラフィックノッチフィルター、またはChromaもしくはOmega Opticalによる干渉フィルター)により、収集されたビームと同一線上の幾何学へと反射させた。反射したビームは顕微鏡の対物レンズ(Nikon LUシリーズ)を通過し、標的生体分子130が位置する基板140上へ集束された。ラマン散乱光は同じ顕微鏡の対物レンズにより収集され、二色性ミラーを通過してラマン検出器へと入った。ラマン検出器は、集束レンズ、分光写真器、およびアレイ検出器を含んだ。集束レンズは、分光写真器の入口スリットを介してラマン散乱光を集束した。分光写真器(RoperScientific)は、光をその波長により分散させる格子を含んだ。分散された光は、アレイ検出器(operScientificによる背面照射(back-illuminated)深空乏型(deep-depletion)CCDカメラ)上に投影された。アレイ検出器は、データ転送および検出器機能の制御のためのコンピュータに接続した制御装置回路に接続された。
1mlの銀コロイド溶液を2mlの蒸留水で希釈した。希釈した銀コロイド溶液(160μl)(マイクロリットル)を、20μlの10nM(ナノモル濃度)アデニン溶液および40μlのLiCl(0.5モル濃度)とアルミニウムトレイ上で混合した。LiClはアデニンのラマン増強剤として作用した。試料中におけるアデニンの最終濃度は0.9nMであり、約100〜150フェムトリットルの検出容積において、推定60分子のアデニンを含んだ。ラマン放射スペクトルを、785nm励起での励起源を用いて、100ミリ秒の収集時間で収集した。
RCA増幅産物170、230、250、330、410を同定するためのSERS検出の有用性を実証した。1ピコモル(pmol)のRCAプライマー110、220を、0.1pmolの環状一本鎖M13 DNAテンプレート150、210、310に添加した。混合物を、1×T7ポリメラーゼ160緩衝液(20mM(ミリモル濃度)Tris-HCl、pH7.5、10mM MgCl2、1mM ジチオスレイトール)、0.5mM dNTP、および2.5単位のT7 DNAポリメラーゼ160とともに37℃で2時間インキュベートして、RCA増幅産物170、230、250、330、410を形成した。陰性対照は、同じ試薬をDNAポリメラーゼ160無しで混合し、インキュベートすることにより調製した。
1μLのRCA産物170、230、250、330、410、および1μLの陰性対照を、別々にアルミニウムトレイ上にスポットし、風乾させた。各々のスポットを5μLの1×PBS(リン酸緩衝食塩水)で濯いだ。濯ぎは3回繰り返し、最後の濯ぎの後にアルミニウムトレイを風乾させた。
Claims (31)
- a)1つまたは複数の標的生体分子を基板に結合させる段階;
b)1つまたは複数のローリングサークル増幅(RCA)産物を作製するために使用する第1のプライマーを標的生体分子に結合させる段階;
c)1つまたは複数のポリチミジン残基を含む環状一本鎖DNAテンプレートを、第1のプライマーにハイブリダイズさせる段階;
d)ローリングサークル増幅(RCA)を行ってRCA産物を得る段階;
e)LiClを含む溶液を加える段階;
f)各々のローリングサークル増幅(RCA)産物をラマン分光法によって検出する段階;および
g)1つまたは複数のローリングサークル増幅産物の存在によって、1つまたは複数の標的生体分子を同定する段階
を含み、LiClが結果として生じるRCA産物を構成するポリアデニンからのラマン放射を増強させる方法。 - 各々の増幅産物が標的生体分子に結合している、請求項1記載の方法。
- 標的生体分子が、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドである、請求項1記載の方法。
- 核酸がRNAまたはDNAである、請求項3記載の方法。
- 環状一本鎖DNAテンプレートが標的生体分子にハイブリダイズする、請求項3記載の方法。
- 標的生体分子が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項1記載の方法。
- 標的生体分子が1つまたは複数のリガンドに結合する、請求項6記載の方法。
- リガンドが第1のプライマーに接合されている、請求項7記載の方法。
- リガンドが、抗体、抗体断片、単鎖抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項8記載の方法。
- ローリングサークル増幅が、線形RCA(LRCA)または指数RCA(ERCA)である、請求項1記載の方法。
- ラマン分光法が、表面増強ラマン分光法(SERS)または表面増強共鳴ラマン分光法(SERRS)である、請求項1記載の方法。
- 試験試料から得られるラマンシグナルと陰性対照試料から得られるラマンシグナルを比較する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- ローリングサークル増幅がERCAであり、1つまたは複数のローリングサークル増幅(RCA)産物にハイブリダイズする第2のプライマーを添加する段階をさらに含む、請求項10記載の方法。
- 増幅産物を銀コロイド溶液に曝露する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 金属塩水溶液と増幅産物との反応により、金属ナノ粒子を生成する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 増幅産物をアルデヒドで処理して還元剤を形成する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
- 金属塩が、Ag+、Cu+、Cu2+、Au+、Au3+、Pd2+、Pd4+、またはAl3+を含む、請求項15記載の方法。
- 1つまたは複数のラマン標識を増幅産物に組み込む段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 1つまたは複数の標的生体分子の量を定量する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 基板に結合した1つまたは複数の標的生体分子;
1つまたは複数のポリチミジン残基を含む環状一本鎖DNAテンプレート;
標的生体分子に結合している、1つまたは複数のポリチミジン残基を含む環状一本鎖DNAテンプレートを用いて増幅された1つまたは複数のローリングサークル増幅産物;および
該1つまたは複数のローリングサークル増幅産物から発生するラマン放射光を検出するためのラマン検出器
を含み、ラマン増強剤が該1つまたは複数のローリングサークル増幅産物からのラマン放射を増強させ、さらに該ラマン増強剤がLiClを含む、生体分子を検出するためのシステム。 - 増幅産物を励起するための励起光源をさらに含む、請求項20記載のシステム。
- 光源がレーザーを含む、請求項21記載のシステム。
- ラマン検出器が、CCDカメラ、アバランシェフォトダイオード、分光光度計、光電子増倍管、分光写真器、電荷注入素子(charged injection device)、フォトダイオードアレイ、アレイ検出器、およびフォトトランジスタアレイからなる群より選択される1つまたは複数のユニットを含む、請求項20記載のシステム。
- 金属ナノ粒子をさらに含む、請求項20記載のシステム。
- ナノ粒子が、銀、金、銅、白金、およびアルミニウムからなる群より選択される少なくとも1つの金属を含む、請求項24記載のシステム。
- 増幅産物に結合した1つまたは複数のラマン標識をさらに含む、請求項20記載のシステム。
- ラマン検出器からのデータを分析するためのコンピュータをさらに含む、請求項20記載のシステム。
- a)1つまたは複数の標的生体分子;
b)標的生体分子に結合している、1つまたは複数のポリチミジン残基を含む環状一本鎖DNAテンプレートを用いて増幅された1つまたは複数のローリングサークル増幅産物;
c)LiClを含む溶液;および
d)ラマンシグナル検出を容易にするために添加される、該増幅産物に、電磁放射の局所効果を増強するように近接するラマン活性金属のナノ粒子
を含む組成物。 - ローリングサークル増幅産物が1つまたは複数のプライマーによってプライミングされたローリングサークル増幅反応によって生成される、請求項28記載の組成物。
- 1つまたは複数のポリチミジン残基を含む環状DNAテンプレートをさらに含む、請求項28記載の組成物。
- ハイブリダイゼーション、インターカレーション、または増幅産物中の修飾塩基との反応を介して増幅産物に結合した、1つまたは複数のラマン標識をさらに含む、請求項28記載の組成物。
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