TWI337623B

TWI337623B - Biomolecule analysis by rolling circle amplification and sers detection

Info

Publication number: TWI337623B
Application number: TW093101995A
Authority: TW
Inventors: Lei Sun; Xing Su
Original assignee: Intel Corp
Priority date: 2003-02-14
Filing date: 2004-01-29
Publication date: 2011-02-21
Also published as: ATE429515T1; EP1592812B1; US20040161750A1; JP2006520608A; US20060099636A1; US20060216729A1; EP1592812A2; CN1723290A; TW200424316A; WO2005014860A3; CN1723290B; JP4885712B2; US7192703B2; DE602004020736D1; WO2005014860A2

Description

1337623 玖、發明說明：【發^明屬t制斤領】發明領域本發明的具體例關於生物分子13〇分析之領域。特定地’關於與生物分子13〇的滾環式擴增法及拉曼偵測法相關之系統、組成物及方法。 C先前技術3 發明背景低濃度的生物分子（諸如：蛋白質、胜肽、寡核苷酸、 10 核酸、脂質、多醣 '激素、神經傳導想、代謝物等）之敏感的、正確的偵測、辨認及/或定量已被證實是一難以捉摸的目標’而其有廣佈的潛在用途於醫學診斷、病理學、毒物學、流行病學、生物戰、環境採樣 '法醫學以及其他領域。目前的偵測方法典型地涉及一可結合至目標生物分子 15之經螢光標記的捕捉分子或配位子之偵測。經螢光標記的抗鱧或探針募核苷酸係典型地被使用來結合且偵測目標蛋白質或核酸，個別地。交又反應（cross_reactivity)及非特異性結合可能使複合的檢體中的生物分子之螢光偵測更複雜。甚至於高特異性被獲得時’該螢光偵測的敏感度係不 20足以辨認低濃度生物分子。特別真實地，當欲被偵測的生物分子係低濃度且存在一其他分子的複合混合物中時，此處干擾、螢光猝滅（fluorescence quenching)及高背景螢光可心全都作用來模糊或減少來自該目標生物分子的訊號。其他偵測樣式已被嘗試用於生物分子偵測，諸如拉曼 5 1337623 光譜法及/或表面電漿共振。當光通過一有形媒介，一部份的光自其原始方向轉向，此現象稱為拉曼散射。某些散射光的頻率也與該原始激發光不同，導因於光的吸收及電子激發至一更高能量態，隨後光發射於一不同的波長。拉曼 5 發射光譜的波長係於一檢體中光吸收分子的化學組成及結構之特性’而光散射強度係依據該檢體中的分子濃度。檢體中一激發光線與一個別的分子之間發生拉曼交互作用的可能性很低，導致拉曼分析的低敏感度及有限的應用性。已觀察到分子接近粗糙巧銀表面會顯現增強多至六 10 到七階強度的拉曼散射。此表面增強拉曼光譜（SERS)效應係相關於電漿共振現象，其中金屬奈米顆粒對應於入射電磁輻射展現一顯著的光共振，導因於該金屬中傳導性電子的集體耦合。基本上，金、銀、銅以及某些其他金屬的奈米顆粒可作用為微型”天線”來增強定位的電磁輻射效應。 15 位於鄰近此等顆粒之分子展現更強的拉曼光譜分析之敏感性0 已嘗試進行開拓SERS來用於生物分子偵測及分析，典型地藉由塗覆金屬奈米顆粒或製造粗糙的金屬薄膜於一基材上以及之後施加一檢體至該經塗覆的基材。然而，可被 20沉積在一平面基材上的金屬顆粒數量係有限的，產生相當低的用於SERS以及利用這些基材的相關拉曼技術之增強係數。因此，目前的SERS偵測分法並不展現足夠敏感性來偵測低漢度的生物分子。存有對於高敏感及特定的生物分子偵測方法之需求。 6 1337623 【發明内容】圖式簡單說明隨後的圖式形成本說明書的一部份且被包括以進一步例示本發明的某些具體例。藉由參考一或更多這些圖式與 5 呈現於此的特定具體例之詳細描述，該等具體例可更佳被了解。第1圖描繪線性滾環式擴增（LRCA)方法。該經揭露的特定類型的檢測係一免疫RC A (滾環擴增）檢測，使用一經綴合至一寡核苷酸引子110的抗體120。該寡核苷酸引子110 10 可被雜交至一單股環形核酸模板150且起始該RCA過程。第2圖描繪指數滾環式擴增（ERCA)方法。第一引子220 (P1)雜交至一單股環形核酸模板210且起始該RCA過程。第二引子240 (P2)雜交至該經擴增的單股序列230中的另一處且起始互補股250之形成作用。當一第二擴增產物250到達 15 一鄰近擴增產物250的Υ端，股的取代作用發生，產生該等擴增產物230、250中的分支處260之形成作用。第3圖描繪一例示的關於含有多腺苷340 (polyadenylate 340)殘基之LRCA產物330之SERS偵測方法。第4圖描繪一例示的關於含有多腺苷420殘基之ERCA 20 產物410之SERS偵測方法。第5圖顯示對於一0.9 nM (奈莫耳濃度）的腺嘌呤溶液之SERS偵測。該偵測體積係100至150飛升（femtoliter)，含有估計為60個腺嘌呤分子。第6A圖顯示對於滾環擴增產物170、230、250、330、 7 1337623 410之SERS偵測’該等擴增係使用一單股的環形mi3 DNA 模板 150、210、310。第6B圖顯示一不存有DN A聚合酶160的負對照。該第6B 圖的吸收刻度已被變化以放大該基線（baseline)。 5 發明概要定義使用於此，” 一”可表示一或多於一的項目。 “核酸”涵蓋DNA (去氧核醣核酸）、rNa (核醣核酸）、單股的、雙股的或三股的以及任何其等化學修飾物。該用 10 語亦涵蓋任何已知核酸類似物，包括，但不限於：胜狀核酸（peptide nucleicacids，PNA)、類核酸胜肽（nucleic acid anal〇g peptides, NAAP)以及閉鎖核酸（locked nucleic acids, LNA)。一” 核酸”可為幾乎任何長度，從兩個或更多鹼基的寡核苷酸至一全長的染色體DNA分子。”核酸”包括，但不限於：募核 15 苷酸及多核苷酸。雖然自然地發生於核酸中的核苷酸殘基係典型地藉由磷酯鍵結合在一起，於所揭露的方法範嗜内’核苷酸殘基可藉由碟酯鍵或任何其他已知形式的共價接合來結合。該等，’蛋白質”、”多肽，，、”胜肽，，用語係可互換地使用於 20此，指稱由自然發生的胺基酸分子、非自然發生的胺基酸分子、胺基酸類似物及/或胺基酸衍生物所組成之聚合的分子。該專用語之間的差異基本上在長度且熟習本項技藝者將會認知到隨後的揭示何處指蛋白質、多肽或胜肽，該等用語涵蓋任何長度的聚合物。雖然自然地發生於蛋白質、 8 1337623 多肽以及胜肽中的胺基酸殘基係典型地藉由胜肽鍵結合在 —起，於所揭露的方法範疇内，胺基酸殘基可藉由胜肽鍵或任何其他已知形式的共價接合來結合。使用於此，該等”生物分子”130 '，，分析物，，13〇以及，，目 5標”130用語指一生物檢體中所欲偵測的任何分子或分子聚集體。生物分子130之非限制性實例包括：蛋白質、胜肽、胺基酸、核酸、募核苷酸、核苷酸、核苷、破水化合物、多醣、醣蛋白、脂質、激素、生長因子、細胞激素、神經傳導體、受髅、酵素、抗原、過敏原、抗體12〇、代謝物、 10輔因子、營養物、毒素、毒物、生物戰劑、生物危險性劑、感染性劑、普恩蛋白（prion)以及維生素。”生物分子”130不限於單分子，且也可包含複合的聚集體，諸如：病毒、細菌、沙門氏菌（>Sa/mowe//a)、鍵球菌（57repiococc«·?)、退伍軍人菌（Legi〇ne"a)、大腸桿菌（£· co//)、梨形鞭毛蟲 15 、隱抱子蟲（OypiosponWwm)、立克次體 (Λ/cArefm’fl)、抱子、衡菌、酵母菌、藻類、阿米巴、渦鞭毛藻（dinoflagellate)、單細胞生物、病原或細胞。一”生物檢體”係任何獲自或可獲自一生物性來源的檢體及/或包括來自一生物性來源的物質。一”生物檢體”包 20 括，但不限於：血液、淋巴、腦脊髓液、痰、精液、尿液、糞、毛囊、淚液、上皮到取物、細胞檢體、組織檢體、器官檢體、活體檢體、培養的細胞以及細胞、組織或器官的萃取物及/或均質物等等。 9 1337623 滾環式擴增法本發明的多種具體例中，該等經揭露的方法可包含滾環式擴增法（RCA)»用於滾環式擴增法的技術係已知於習知技藝（參見 Bandr ei fl/，AciA ee<searc/t， 5 26:5073-5078, 1998; Lizardi et al., Nature Genetics 19:226, 1998; Schweitzer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10113-119, 2000; Faruqi et al., BMC Genomics 2:4, 2000; Nallur et al., Nucl. Acids Res. 29:ell8, 2001; Dean et al. Genome Res. 11:1095-1099, 2001; Schweitzer et al., Nature 10 Biotech. 20:359-365，2002;美國專利第 6,054,274、 6,291，187、6,323,009、6,344,329 及 6,368,801號）。些許不同的RCA變異係已知的，包括線性RCA(LRCA)以及指數 RCA (ERCA)。

LRCA 15 第1圖描繪LRCA的一般程序。在此例中，用於RCA的一引子110係經綴合至一抗體120，該抗體能結合且辨認一生物分子130。因此，此RCA變異係有時被稱為免疫RCA (Schweitzer ef α/.，2000)。該生物分子130可被附加至一基材140上，准許該訊號的定位作用及偵測作用。一單股環形 20 DNA模板150有與該引子110互補的序列，准許被雜交至該引子110。在添加一 DNA聚合酶160時，存在有適合的dNTP (去氧核苷三磷酸）前驅物以及其他輔因子，該引子110股係被延長。因為該模板150序列係環形，所以多重複數的模板150序列將被複製且被附加至該引子11〇。 10 1337623 多種偵測技術係可被獲得來辨認該LRCA擴增產物 170。如第1圖所示，一普遍的技術係添加一經螢光標記的寡核苷酸探針180其能特異地雜交至該環形DNA模板150的内在序列。探針180可結合至該擴增產物170中各重複的模 5 板150序列，准許來自該生物分子130-抗體120複合體之可偵測的螢光訊號倍增。一般地，LRCA提供約四階的（104) 訊號擴增而促進低量目標生物分子130之偵測。

ERCA 為了偵測非常低量的目標生物分子130，該LRCA程序 10 可能無法提供足夠的訊號擴增用於敏感且可靠偵測。另一變異RCA-指數RCA(ERCA)-係被發展以該滾環技術來供用於額外的訊號擴增（第2圖）。第2圖描繪一例示性ERCA程序（Lizardi ei W.，1998)。一環形單股DNA模板210係准許被雜交至一第一引子 15 220(P1)。一 DNA聚合酶160、dNTP、以及輔因子係被添加以及該模板210序列係被複製而形成一 RCA擴增產物230。當該擴增產物230繞著該環形模板210延伸時，其自該模板 210取代該第一引子220的5'端，產生一單股DNA分子230從該環形模板210處延伸而出。這部份的ERCA程序（第2圖） 20 係相似於該LRCA程序（第1圖）。 LRCA與ERCA之間最主要的差異係在於第二引子240 (P2)之添加，該第二引子可結合至位於遠離該第一引子220 處之互補的模板210序列。該第二引子240能雜交至該經延伸的單股擴增產物230。核苷酸添加至該第二引子240的3’ 11 1337623 端致使一第二股擴增產物250之形成（第2圖）。當該第二股 250的成長（3')端碰到鄰近的第二引子240的5,端，該引子 240及其附接的第二股250係自該起始的擴增產物230被取代。如此產生該等擴增產物230、250中的分支處260之形 5 成。額外重複數的第一引子220可結合至各分支處260，產生來自目標生物分子130可偵測訊號之進一步的擴增作用。該ERCA淨結果係一高度分支的擴增產物230、250，其提供指數訊號擴增。 ERCA提供約1〇9的擴增係數或大於LRCA所觀察到擴 10 增約1〇5。然而，ERCA—般地係不適於生物分子13〇藉由螢光標記的寡核苷酸探針180雜交作用之偵測。隨著該ERCA 裎序（第2圖），該主要擴增產物230、250係由雙股核酸構成。沒有像獲自LRCA之單股擴增產物170之延伸的未雜交部位。因此，經標記的寡核苷酸探針180的雜交作用係比 15 LRCA更難進行於ERCA。可以分開該雙股ERCA擴增產物 230、250成單股（諸如，加熱、低鹽、pH、清潔劑）之技術將使在一多重晶片檢測中的生物分子130偵測變複雜且困難。雖然螢光標記的核苷酸原則上可被直接納入ERCA擴增產物230、250中，但是該DNA聚合酶160的活性可能因大 20 量的基群共價地接附至一實質部份的dNTP前驅物而被負面地影響。並且.，鄰近的螢光染劑分子之自我淬滅 (self-quenching)將減少該訊號強度。若該標記的探針18〇各自位置太過接近，自我淬滅也發生在LRCA。最後，螢光標記的探針180之使用添加了耗費及生物分子130偵測所需的 12 1337623 時間。拉曼偵測拉曼光譜學本發明的某些具體例中，滾環式擴增法可被與拉曼偵 5 測法一起使用來偵測、辨認及/或定量目標生物分子130。任何習知的拉曼偵測樣式可被使用，包括但不限於：表面增強拉曼光譜（SERS)、表面增強共振拉曼光譜（SERRS)、常規拉曼散射、共振拉曼散射、同調反-史托克拉曼光譜 (CARS)、激發拉曼散射、反向拉曼光譜（inverse Raman 10 spectroscopy)、激發增益拉曼光譜（stimulated gain Raman spectroscopy)、高拉曼散身十（hyper-Raman scattering)、分子光學雷射檢視器（molecular optical laser examiner, MOLE) 或拉曼微探針或拉曼顯微術或共軛拉曼顯微測譜學、三維或掃描拉曼、拉曼飽和光譜（Raman saturation 15 spectroscopy)、時間解析共振拉曼、拉曼去糕合光譜（Raman decoupling spectroscopy)或 UV-拉曼顯微術。本發明的特定具體例中，一表面增強拉曼技術，諸如 SERS或SERRS可被用以偵測RCA擴增產物170、230、250、 330、410。這些技術倚賴被吸收至某些金屬粗糙表面140之 20 分子的拉曼訊號之增強作用，該等金屬諸如：銀、始、銅、鋁或金。在SERS及SERRS中，該拉曼偵測的敏感度可被增強106係數或更多。生物分子130，諸如核酸，的拉曼偵測方法係已知於習知技藝。典型地，這些方法利用膠體金屬顆粒，諸如聚集的銀奈米顆粒，係被塗覆至一基材140及/ 13 1337623 或撐體上（如：美國專利第 5,306,403、6,149,868、6,174,677、 6,376,177號）。然而，先前的用於生物分子130偵測之SERS 或SERRS技術提供不足夠的敏感度及/或特異性。所請的方法、組成物及系統之範疇的額外細節係提供於下。 5 拉曼標幡（Raman labels) 在本發明的某些具體例中，RCA擴增產物170、230、 250、330、410可藉由直接偵測經納入的核苷酸被偵測。例如，含有腺嗓吟或鳥嗓吟基團（moiety)之嘻吟核苷酸展現獨特訊號可被SERS或SERRS偵測。任擇的具體例，某些欲被 10 納入該RCA擴增產物170、230、250、330、410中的核苷三磷酸前驅物可被標記有一或多個拉曼標幟以促進其等之偵測、辨認及/或定量。另外的任擇具體例，核苷三磷酸前驅物可被共價地修飾有一反應性基團，諸如：氫硫基、胺基、羧基、馬來醯亞胺基、生物素（biotin)及/或其他習知技藝已 15 知之反應團。在納入一 RCA擴增產物170、230、250、330、 410之後，該等經修飾的核苷酸可被標記有一或多個拉曼標幟，經設計而共價地或非共價地結合至該反應性基團。其他納入拉曼標記的方法可將該標記與具有與該RCA擴增產物170、230、250、330、410互補的序列之寡核苷酸探針180 20 綴合，且將該募核苷酸探針180雜交至該RCA產物170、 230、250、330、410。當該RCA程序產生一基本上為單股產物170、330時，此等雜交技術係簡化的。例如，大量存在拉曼標幟於核苷三磷酸前驅物上會干擾DNA聚合酶160 活性時，此擴增後的修飾作用可被使用。 14 1337623 多種用於偵測生物分子130之拉曼標幟係已知於習知技藝中（諸如：美國專利第 5,306,403、6,002,471、6，174,677 號）且任何此類已知的拉曼標幟可被使用。可用於拉曼光譜之標幟的非限定性實例包括：TRIT (四甲基玫紅異硫醇 5 (tetramethyl rhodamine isothiol) )、NBD ( 7-硝基笨-2-噁二0坐）、德州紅染劑（Texas Red dye)、鄰笨二甲酸、對笨二甲酸、間苯二曱酸、抗甲酚基紫、甲酚藍紫、煌甲酚藍、對胺笨曱酸、赤藻紅（erythrosine)、生物素、洋地黃毒 (digoxigenin)、5-羧基-4'，5'-二氣-2·，7·-二甲氧基螢光素 10 (fluorescein)、5-羧基-2'，4’，5、7|-四氣螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基玫紅、6-羧基玫紅、6-羧基四曱基胺肽花青、甲亞胺（azomethines)、花青（cyanines)、黃嘌呤（xanthines)、琥珀酸螢光素以及5-胺丫啶。這些及其他拉曼標幟可獲自商業來源（如.Molecular Probes、Eugene、OR)。 15 多環的芳香族化合物一般地可作為拉曼標幟，如習知技藝所知。其他可用於本發明特定實例的標幟包括：氰化物、硫醇、氣、溴、曱基、碌以及硫基。本發明某些實例中，碳奈米管（carbon nanotubes)可被使用作為拉曼標峨。標幟可被直接附接至該核酸或可經由多種連接化合物 20被附接。任擇地，經共價地附接至拉曼標幟之核苷酸前驅物可由標準商業來源購得（如：Roche M〇lecular Biochemicals, Indianapolis, IN ' Promega Corp., Madison, WI'Ambion, Inc., Austin, TX'Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway，NJ)。含有反應性基困而被設計來共價地與其他 15 1337623 分子（如：核苷酸或核酸）反應之拉曼標幟，係商業上可獲得者（如：Molecular Probes, Eugene, OR)。製備經標織的核苷酸以及將之納入核酸之方法係已知（如：美國專利第 4,962,037、5,405,747、6，136,543、6,210,896號）。 5 拉曼偵測單元多種可能用於拉曼光譜的偵測單元係習知技藝已知者且任何已知的拉曼偵測單元可被使用。一拉曼偵測單元的非限制性實例係揭露於美國專利第6,〇〇2,471號。在此實例中’該激發光係由一鈥：雅鉻（NchYAG)雷射產生於532 nm 10 (奈米）波長或由一鈦：藍寶石（Ti:sapphire)雷射產生於365 nm波長。脈衝雷射光或連續雷射光可被使用。該激發光通過共焦光學器以及一顯微物鏡，且可被對焦至一含有經附接的生物目標130之基材140 »來自該RCA擴增產物170、 230、250、330、410之拉曼發射光可被該顯微物鏡及該共 15焦光學器收集’連接至一單色器來用於光譜解晰。該共焦光學器可包括下述之組合：分色濾光器、屏障濾光器、共焦針孔、透鏡以及用以減低該背景訊號的鏡片。標準全視角光學器也可被用作為共焦光學器。該拉曼發射訊號可被一拉曼債洌器偵測。該偵測器可包含一崩瀉光二極體 20 (avalanche Phot〇di〇de)中間介有一電腦用於訊號之計算及數位化。目標生物分子130陣列欲被分析時，該光學偵測系統可被設計來偵測及定位拉曼訊號至晶片或方格上的特定位置。例如，發射的光線可被引導至一CCD (電荷耦合裝置）攝影機或其他偵測器，其係能同時測量一偵測視野中 16 1337623 來自多重像素或組群像素之發射光。拉曼偵測單元的任擇實例係被揭露，例如，美國專利第5,306,403號，包括一 Spex Model 1403雙光柵分光光度計，其配備有一鎵-砷光電倍增管（RCA Model C31034或 5 Burle Industries Model C3103402)操作於該單光子計算模式。該激發來源係一來自5卩〇(^3?11>^〇8，”〇(161166之514.5 nm氬離子雷射光，以及一 647.1 nm兔離子雷射光（Innova 70, Coherent) ° 任擇的激發來源包括，但不限於，一氮雷射（Laser 10 Science Inc.)於 337 nm 以及一氛-錫雷射（Liconox)於 325 nm (美國專利第6，174,677號）。該激發光可被以一帶通濾光器（bandpass filter) (Corion)分光地純化以及可藉由一6X 物鏡（Newport, Model L6X)被對焦至一基材140上。該物鏡可被用以激發該RCA擴增產物170、230、250、330、410以 15 及收集該拉曼訊號，藉使用一全像分光鏡（Kaiser Optical Systems, Inc.，Model HB 647-26N18)來產生該激發光及發射的拉曼訊號之直角幾何。一全像凹口滤光器（holographic notch filter) (Kaiser Optical Systems, Inc.)可被使用來減少瑞利（Rayleigh)散射輻射。任擇的拉曼偵測器包括，但不限 20 於，一1sa 光譜儀其配備有一紅光增強的積分式電荷耗合裝置（RE-ICCD)憤測系統（princet〇n Instruments)。其他類型的偵測器可被使用，諸如電荷注射裝置、光二極管陣列或光電晶體陣列《拉曼活性金屬之奈米顆粒 17 1337623 本發明的某些具體例中，拉曼活性金屬顆粒，諸如金或銀奈米顆粒，可被添加至一含有經接附的RCA擴增產物 170、230、250、330、410之基材140上而促進由SERS或 SERRS測量之拉曼訊號。例如，一膠趙奈米顆粒;於漿可被 5 湧入一生物分子130陣列，處於一奈米顆粒密度足以提供來自位於該陣列之各生物分子130的SERS或SERRS訊號。任擇的，該等奈米顆粒可被直接地沉積在一生物分子130陣列或其他基材140上，處於一奈米顆粒密度足以提供來自各位置的SERS或SERRS訊號。雖然任何供於表面增強拉曼訊號 10 之奈米顆粒密度可以被使用，本發明特定具體例中，一提供相鄰的奈米顆粒或奈米聚集物間介於1 nm至20 nm分隔之顆粒密度可被使用。在本發明某些具體例中，奈米顆粒可被形成藉與RCA擴增產物170、230、250、330、410之直接交互作用。例如，一含有經接附的RCA擴增產物170、 15 230、250、330、410之陣列可被以醛處理，諸如戊二醛（如，

Keren ei a/.，Sc/ence 297:72-75)。該等搭基可共價地修飾核酸，使其等成為金屬鹽類的還原劑。該經修飾的核酸可被暴露於一含有金屬陽離子的金屬鹽溶液中，例如一硝酸銀溶液（含有介於約0.2至2.0 M AgN03)。該Ag+陽離子將 20 被該等醛基還原，產生銀奈米顆粒而緊密地關連於該等 RCA擴增產物 170、230、250、330、410。任擇的用以製備奈米顆粒之方法係已知的（如，U.S. Patent Nos. 6,054,495; 6,127,120; 6,149,868; Lee 以及 Meisel，·/•尸/i：ys· C/iem. 86:3391-3395, 1982)。奈米顆粒可被 18 1337623 形成為奈米菱鏡（nanoprisms)形式（Jin ef fl/.，"Photoinduced conversion of silver nanospheres to nanoprisms," Science 294:1901，2001)。奈米顆粒也可獲自商業來源（如， Nanoprobes Inc., Yaphank, NY； Polysciences, Inc., 5 Warrington, PA) o 本發明的某些具體例中*該等奈米顆粒可為奈米顆粒的隨機聚集體（膠體奈米顆粒）。本發明的其他具體例中，奈米顆粒可經交聯（cross-linked)而生成特定的奈米顆粒聚集體，諸如二聚體、三聚體' 四聚體或其他聚集體。某些 10 任擇的本發明具體例可使用不同尺寸的非均質混合物之聚集體，而其他任擇的具體例可使用均質的奈米顆粒聚集體族群。本發明的某些具體例中，含有一經選擇的奈米顆粒 (二聚體、三聚體等）數量之聚集體可被濃縮或純化，藉由已知的技術，諸如於蔑糖梯度溶液中之超高速離心。 15 交聯奈米顆粒之方法係已知於習知技藝（參見，如

Feldheim, "Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges," The Electrochemical Society Interface, Fall，2001，pp. 22-25)。金奈米顆粒與帶有末端硫醇或氫硫基之聯合劑化合物反應係已知的（Feldheim，2001)。本發明 20 的某些具體例中，奈米顆粒可被相互交聯而形成聚集體。其他具體例中，該等奈米顆粒可能被直接地接附至該等 RCA擴増產物170、230、250、330、410。適於交聯至其他奈米顆粒或RCA擴增產物170、230、250、330、410之經修飾的奈米顆粒係商業上可獲得的，諸如來自Nanoprobes,丨nc. 19 1337623 (Yaphank，NY)的 Nanogold® 奈米顆粒。Nanogold®奈米顆粒可被獲得為每個奈米顆粒係與單一或多重的馬來醯亞胺、胺或其他基團接附。該等Nanogold®奈米顆粒也被獲得為正或負電荷形式來促進於一電場中操作奈米顆粒，使得能藉 5 由電動力學或其方式操作奈米顆粒。生物分子降列本發明的某些具體例中，該目標生物分子130及/或RCA 擴增產物170、230、250、330、410可被接附至一基材140、陣列及/或晶片。使用於此，該等用語”晶片”、”基材”140 10 及”陣列”係可交換地使用。製造及使用生物分子130晶片之方法係已知於習知技藝中且任何此類已知方法可被使用 (如，美國專利第 5，143,854號、第 5,874,219號、第 6,040，138 號、第6，124,102號、第 6,203,989號、第 6,225,625 號、第 6,252,236號、第 6,399,365號、第 6,410,229號、% 6,416,952 15 號）。不同的方法可被用來產生生物分子130晶片，包括直接地合成生物分子130或生物分子130之配位子於一晶片表面140上。任擇地，生物分子130或其等配位子可被合成或純化之後再被接附至一晶片表面140上。許多任擇的方法係已知，諸如將一第一捕捉抗體120接附至一晶片，利用該第 20 一抗體120來結合且固定一目標生物分子130，接著添加一第二經標記的抗體120來偵測該生物分子。此一 ”三明治”檢測系統可被使用於該等申請的方法中，以該第二抗體120共價地接附至一寡核苷酸引子110、220，如第1圖例示之免疫 RCA程序。本發明的相關具體例中，一生物分子130的配位 20 1337623 子係經接附至一晶片，該配位子之後可被用來結合一生物分子130。該配位子-生物分子130複合體可藉由一第二配位子之結合而被偵測，該第二配位子諸如一抗體120係結合至一生物分子130的不同區域。多種可被用來產生生物分子 5 130陣列之晶片基材140係商業上可獲得的（如，NanoChip™

System, Nanogen, San Diego, CA; GeneChip®, Affymetrix, Santa Clara，CA)可被使用。生物分子與基材之接附本發明的多種具體例中，生物分子130可藉接附至一固 10 態基材140而被固定。生物分子130可藉多種涉及非共價或共價接附的已知方法被固定。例如，固定化作用可藉將一固態基材140塗覆有鏈黴抗生物素蛋白（streptavidin)或抗生物素蛋白（avidin)以及與一生物素-綴合的 (biotin-conjugated)生物分子130結合。固定化作用也可藉由 15 將矽、石英、PDMS (聚二曱基矽氧烷）或其他固態基材140 塗覆有poly-L-Lys或胺基矽烷，隨後使用雙官能交聯劑來共價接附含有胺基或氫硫基之生物分子130。可能使用的雙官能交聯劑包括：戊二醛、雙官能環氧乙烷、甘醇二縮水甘油醚以及碳二亞胺，諸如1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳二 20 亞胺。本發明的任擇具體例中，欲被接附至生物分子130之基材14〇可先經圖樣化（patterned)，使用標準光刻法及蚀刻技術來產生用於生物分子130之微刻度（microscale)或奈刻度 (nanoscale)接附區域。例如，基材140可被塗覆有一薄金金 21 1337623 屬層。該金可被直接地綴合至生物分子13〇的硫氫基殘基。任擇地，一連接基（linking group)諸如硫醇苯甲酸及/或硫醇十六烷酸可被使用來形成單層物於該金斑片（patch)上（如， Liu and Amro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:5165-70, 5 2002)。此例中，該硫氩基困結合至該金斑片，准許生物分子130之接附作用，例如藉由碳二醯亞胺催化該單層物上的酸性基團與該生物分子130上的胺基之間共價鍵之形成。任擇地’酸-酸二聚體氫鍵結或酸酐鍵形成可發生於該單層物上的羧基與該生物分子130上的酸性殘基之間。 10 可藉生物分子130上的酸性殘基化學地修飾基材14〇 (例如’酸處理的矽）之直接共價接附作用而進行固定作用。該生物分子130與該固態基材140之間的共價鍵可藉與一交聯劑之縮合作用被形成。生物分子130可被結合至一基材140，藉由先使該基材 15 140矽烷化，再以碳二醯亞胺或戊二醛活化。任擇的程序可使用諸如’3-環氧丙氧丙基三甲氧基石夕坑 (3-glycidoxypropyltrimethoxysilane)或胺丙基三甲氧基矽烷（aminopropyltrimethoxysilane，APTS)之反應劑，而經由胺基連接物被與生物分子130連接。其他固定生物分子13〇 20 之方法係已知且可被使用。本發明某些具體例中，一捕捉募核苷酸可被結合至一基材140。該捕捉募核苷酸可與一特定的核酸生物分子130序列雜交。欲被用於生物分子130之固定作用的基材14〇類型係未侷限的。多種具體例中，該固定作用的基材14〇可為石英、 22 1337623 PDMS、矽、氧化矽、二氧化矽、氮化矽、鍺或其他習知基材 140。微機電系統（MEMS) 本發明的某些具體例中，含有經接附的生物分子130及 5 / 或 RCA 擴增產物 170、230、250、330、410 之基材 140、陣列及/或晶片可被併入一更大的設備及/或系統，諸如一微流體系統。某些具體例中，該基材140可被納入一微機電系統 (MEMS)。MEMS係包含機械元件 '感應器、引動器及電子儀器之整合的系統。所有這些組件可由已知微加工技術施 10 用於一普通晶片來製造，該普通晶片包含以矽為基底的基材 140 或相等者（如，Voldman ef α/·, Eng. 1:401-425, 1999)。該等MEMS的感應器組件可被用來測量機械的、熱的、生物性的、化學的、光學的及/或磁的現象，諸如拉曼放射訊號。該電子儀器可處理來自該感應器的訊 15 息及控制引動器組件，諸如幫浦、閥、加熱器、冷卻器、濾器等等，藉此控制該MEMS的功能。該等MEMS的電子組件可藉使用積體電路（1C)製程來製造（如，CMOS, Bipolar, or BICMOS processes)。其等可使用已知用於電腦晶片製造之光刻及蝕刻方法來製造。該微 20 機械組件可使用相符的”微機械”製程來製造，其選擇性地將該矽晶圓部份蝕刻而去或添加新的結構層來形成該機械及/或微機械組件。 MEMS製造之基礎技術包括：將材料薄膜沉積在一基材 140上，藉光刻影像或其他已知刻法將一圖樣罩施加於該薄 23 1337623 膜上方’以及選擇性地蝕刻該薄膜。一薄膜可具有一厚度為幾奈米至100微米。所使用的沉積技術可包括化學程序，諸如：化學氣相沉積（CVD)、電沉積、磊晶及熱氧化作用，以及物理程序如物理氣相沉積（PVD)與鑄造。用於製造奈機 5電系統的方法可被用於本發明的某些具體例（例如參見，

Craighead, Science 290:1532-36, 2000)。本發明的某些具體例中，一或多個基材14〇、陣列及/ 或晶片可被連接至多種填充有流體的區間，諸如微流體通道、奈通道（nanochannels)及/或微通道（microchannels)。一 10設備或系統的這些或其他組件可被形成為一單一單元，例如就像已知半導體晶片之一晶片形式，及/或微毛細管或微流體晶片。任擇地，一基材140、陣列及/或晶片可被形成為一分離的單元且之後被接附至一設備或系統之其他組件。任何已知可用以製造基材140、陣列或晶片之材料可被 15 使用，包括但不限於，矽、二氧化矽、氮化矽、聚二甲基矽氡烷（PDMS)、聚甲基丙烯酸酯（pmmA)、塑膠、玻璃、石英等等。用於晶片的批量製造技術係詳知於電腦晶片製造及/或微毛細管晶片製造領域。此等晶片可由任何習知技藝已知 20 之方法來製造，諸如藉由光刻法及蝕刻、雷射蒸鍍法、射出成型法、禱造法、分子束磊晶法、墨水筆奈米光刻術 (dip-pen nanolithography)、化學氣相沉積（CVD)製法、電子束或對焦離子束技術或印模技術。非限制性實例包括：傳統以一流動的、光學清晰的物質（諸如塑膠或玻璃）之成 24 1337623 型法；二氧化矽的光刻法與乾蝕刻；電子束光刻法其使用聚甲基丙烯酸酯阻抗物而圖樣化一鋁遮罩於二氧化矽基材 140上，接著界反應性離子來蝕刻。多樣的微製造晶片係商業上可獲得’例如’獲自 Caliper Technologies Inc. (Mountain 5 View, CA) and ACLARA BioSciences Inc. (Mountain View, CA)。本發明的某些具體例中’ 一設備或系統的部份或全部可被選擇為拉曼光譜儀之激發及發射頻率的磁電射線可穿透者’諸如玻璃、矽、石英或其他光學清晰物質。關於經 10 流體填充的區間其可被暴露至多種生物分子130，諸如蛋白質、胜肽、核酸、核苷酸及相似者，該被暴露至此等分子之區域可藉由塗覆而被修飾，例如將一疏水性區域轉成一親水性區域及/或減少分子的吸收。普遍的晶片材料諸如玻璃、矽、石英及/或PDMS之修飾作用係已知於習知技藝中 15 (如，美國專利第6,263,286號）》此等修飾作用可包括，但不限於，塗覆以上業上可獲得的毛細管塗覆劑（Supelc〇, Bellafonte, PA)、有多種官能基（諸如，聚環氧乙院或丙酿胺）的石夕烧’或任何其他習知技藝已知的塗覆劑。利用SERS及RCA之生物分子偵測 2〇滾環擴增技術可被與SERS或SERRS組合來偵測、辨認及/或定量廣泛種類的生物分子130。本發明的具體例中，當該欲被偵測的生物分子13 0係一核酸、多核皆酸或寡核皆酸時，滾環擴增係直接的環形DNA模板150、210、310 係被設計為包括會與該目標核酸130的3’端雜交之序列。適 25 1337623 當的前驅物、酵素及輔因子係被添加且一RCA擴增產物 170、230、250、330、410係被形成。依據 LRCA 或 ERCA 是否進行，該結果將是一單股擴增產物170、330或一分支的、雙股的擴增產物230、250、410 ° ERCA的狀況中’使 5 用經標幟的寡核苷酸探針180之螢光偵測係不可行的。對於 LRCA或ERCA，拉曼偵測可被使用來偵測、辨認及/或定量該目標生物分子130。本發明任擇的具體例中，該目標生物分子130可為一胜肽、蛋白質、醣蛋白、多聽、聽脂質或其他分子，而一胜 10 肽或蛋白質配位子（諸如一抗體120 )可被用來作為其等之結合及偵測劑。此等狀況中，某些免疫RCA的變異可被與 LRCA或ERCA—起使用。單株抗體120、多株抗體120、抗體120片段（如，FAb片段）、擬人化抗體120、單鏈抗體120 以及嵌合抗體120皆可購自商業來源或由已知技術製造 15 (如，Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor，NY，1988)。一寡核苷酸引子120、220的5’端可使用已知方法被接附至一抗想120或其他蛋白質或胜肽配位子（如，Schweitzer ei α/., 2000; Schweitzer ei fl/·，2002) ° 20 多種用以將引子110、220接附至抗體或其他蛋白質之方法係已知的。例如，一硫氫基殘基可被共價地與一經丙烯醯酸酯（acrydite)修飾的引子110、220交聯。硫氫基殘基也可被與5’胺基經標幟的引子110、220交聯，使用N-琥珀醯并胺-4·馬來酿并胺基丁酸醋（N-succinimidyl- 26 1337623 4 maleim丨dobutyrate)作為一交聯劑。離胺酸、精胺酸的胺基或N末端胺基酸可被交聯至硫醇化引子11〇、22〇，使用該相同的父聯劑。任擇地，水溶性碳二醯亞胺可被用來將5，羧酸化引子110、220與蛋白質的胺基困交聯。藉由與丨〇4及 5硼氫化鈉反應，羥基（如，絲胺酸、羥丁胺酸）可被交聯至含有5,胺基之引子110、22〇。許多任擇的將引子11〇、22〇交聯至蛋白質或胜肽之方法係已知且可被使用。本發明一例示具體例係描繪於第3圖，其呈現拉曼偵測與LRCA之組合。如第1圖中’ _目標生物分子13〇可被接附 10至一基材140。任何目標分子13〇 (其抗體12〇或其他蛋白質、胜肽或核酸配位子係可取得者）皆可被偵測，只要該配位子以相對高特異性結合至該有興趣的目標13〇。抗體 120、胜狀或蛋白質配位子狀況中，第3圖所例示的抗體12〇配位子將被綴合至一寡核苷酸引子丨1〇，如第1圖。 15 些許變異可被用於拉曼偵測。於第3圖所描繪的例示性具體例，一被設計含有一或多個多胸苷（p〇lythyniidine)⑺ 殘基320之環形DNA模板310係雜交至該寡核苷酸引子 110。當添加DNA聚合酶160、dNTP's及輔因子，一經延長的單股RCA擴增產物330係被形成，該擴增產物330含有多 20個多腺苷（A)殘基340 »該多腺苷340可被直接地由SERS或 SERRS偵測。任擇地，募核皆酸探針180被設計為具有獨特的拉曼記號可被雜交至該LRCA擴增產物330及被偵測。以下實例1揭露使用拉曼偵測單元，於含有少如60個腺嘌呤分子之檢體中，SERS訊號已被偵測到（實例1)。相對 27 1337623 於螢光偵測中一高濃度的螢光基團可能導致自我猝滅腺嘌呤納入核酸中產生一增強的訊號而不是自我猝滅。多腺苷分子340含有30各相連的腺嘌呤（A、而產生相當於十倍同數量去氧腺苷-5’-單磷酸（dAMP)分子所具有之SERS訊號 5 (數據未呈現）。一具有經納入的多腺苷340之單股lrCA擴增產物330可含有高達1〇5腺嘌呤殘基，提供一非常強烈擴增的SERS訊號350而可允許單一複製的目標生物分子13〇之偵測。該相同的方法也可與ErCA使用（第4圖），甚至有更高 10的訊號擴增作用。該程序始於一生物分子130其可被接附至一基材140。在非限制性實例第4圓_，該生物分子13〇結合一抗體120，該抗體係被綴合至一寡核苷酸引子n〇。如第3 圖中，一含有一或多個多胸苷殘基的單股DNA模板31〇係被雜交至該引子110。隨著一 ERCA程序，如例示於第2圖，結 15 果一高度分支的ERCA擴增產物410形成，其含有多重多腺苷420殘基。於該ERCA產物410中的多腺苷420殘基可直接地由拉曼技術（諸如SERS或SERRS )偵測。任擇地，該擴增產物410可納入一或多個拉曼標幟來促進偵測、辨識及/ 或定量。如上述討論，拉曼標幟可藉由使用經共價地標記 20有拉曼標幟之核苷酸前驅物而被直接地納入該擴增產物 410中。任擇地，拉曼標幟可在該擴增產物41〇合成之後被添加。任何狀況下，一極度擴增的拉曼訊號43〇將被產生。該ERCA程序導致109或更多拉曼訊號擴增。與該多重多腺苷420殘基之訊號增強作用組合，erca與SERS或 28 1337623 SERRS偵測之組合將准許超高敏感度的生物分子130偵測，達到單一分子的程度。相較於RCA擴增產物170、230、 250、330、410之標準螢光偵測方法，這些方法展現顯著地更好的敏感度。相較於LRCA擴增產物170、230之螢光偵測 5 法，ERCA擴增產物230、250、410之SERS偵測應提供至少三倍量的訊號強度增加。以任一 RCA程序，一檢體中的一或多種目標生物分子 130的量可被拉曼光譜定量，其使用任何已知的定量方法。例如，可藉由偵測該發射的拉曼訊號強度以及點計數（spot 10 counting)來定量。於點計數中，一窄雷射激發光束（小於1 μπι半徑）可被用來掃描一基材140的表面藉以辨認個別的擴增事件之數目以及多少種的擴增事件係關連於一設定的目標130。該點計數可避免因不完整的或不足的DNA擴增作用或膠體聚集所引起之強度差異。 15 I[實方式1 較佳實施例之詳細說明實例1 :藉由SERS之RCA產物偵測銀奈米顆粒之形成 20 用於SERS偵測之銀奈米顆粒係由已知方法製造（Lee and Meisel, 1982)。18毫克 AgN03係被溶解於 100 mL(毫升）的蒸餾水中且被加熱至滾沸。10 mL的1%檸檬酸鈉溶液係於10分鐘期間被滴入該AgN03溶液。該溶液係再被維持滾沸一小時。該產生之銀膠體溶液係被冷卻及保存。 29 1337623 拉曼債測單元該激發光束係由一鈦：藍寶石雷射（Spectra-Physics之 Tsunami)產生於一近紅外光波長（750〜950 nm)或一砷化鎵铭二極想雷射（Process Instruments 之 P丨-ECL series)產生 5 於785 nm或830 nm。脈衝雷射光束或連續光束可被使用。該激發光束係被一分色鏡（Kaiser Optica丨之全像凹口遽光器或Chroma或Omega Optical之干涉濾光鏡）反射成一共線幾何之集中光束。該經反射的光束通過一顯微鏡物鏡 (Nikon LU series)，且被對焦至一基材;14〇上’目標生物分 10子13〇係位於該基材處。該拉曼散射光係被該相同的顯微鏡物鏡集中’且通過該分光鏡到一拉曼偵測器。該拉曼偵測器包含一聚焦透鏡、一光譜儀以及一陣列偵測器。該聚焦透鏡將該拉曼散射光對焦而通過一光譜儀的入口狭縫β該光譜儀（RoperSciendfic)包含一光栅，該光栅依波長分散該 15光。該經分散的光係映至一陣列偵測器（R0perScientific之背·照明深空乏CCD攝影機）。該陣列偵測器係被連接至一控制迴路’其係連接至一電腦而用於資料傳輸及控制該偵測器功能。腺嘌呤之SERS偵測 20 1 mL的銀膠體溶液係被以2 mL的蒸餾水稀釋。該經稀釋的銀膠體溶液（160 μι)(微升）係被與20 0]1的1〇 nM(奈莫耳濃度）腺嘌呤溶液以及40 pL的LiCl(0.5莫耳濃度）混合於—銘盤上《該LiC丨作用為腺嘌呤之拉曼增強劑。該檢體中的腺嘌呤最終濃度係0.9 nM，於一偵測體積為約1〇〇至 30 1337623 150飛升（femtoli ter)，估計含有60個腺嗓吟分子。該拉曼發射光譜係使用一激發源在785 nm激發，以100毫秒收集時間。如第5圖所顯示，此程序屐現對60個腺嘌呤分子的敏感 5 性偵測，在約833 nm及877 nm偵測有發射尖峰。這些結果展現SERS可被使用於腺嘌呤、一RCA擴增產物170、230、 250、330、410之敏感性偵測。滚環式擴增用於RC A擴增產物170、230、250、330、410之辨認的 10 SERS偵測係被展現。1塵莫耳（picomole)(pmol)的RCA引子 110、220係被添加至0.1 pmol環形、單股M13 DNA模板 150、210、310。該混合物係被與IX T7聚合酶160緩衝液（20 mM (毫莫耳濃度）Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mM 雙硫蘇醣醇）、〇.5mMdNTPs以及2.5單位的T7DNA聚合 15 酶160培育於37°C共2小時，導致一 RCA產物170、230、250、 330、410之形成。一負對照組係藉混合及培育該相同的反應劑，但無DNA聚合酶160之下被製備。 RCA產物之SERS偵測 1 pL的 RCA產物 170、230、250、330、410以及 1 pL的 20 負對照組檢體係被分別地點潰在一鋁盤上且被風乾。各點係被以5 μί的IX PBS (磷酸鹽緩衝液）潤洗。該潤洗係重複三次且最後潤洗之後該鋁盤係被風乾。如前述製備之1毫升的銀膠體溶液係被以2 mL蒸餾水稀釋。8微升的經稀釋銀膠體溶液係被與2 μί的0.5 M LiCl 31 1337623 混合且添加至該鋁盤上的RCA產物170、230、250、330、 410點。該拉曼訊號係如上所述被收集。該等結果係呈現於第6A及6B圖。如第6A圖所展示，一 RCA產物170、230、250、 330、410係容易地由SERS偵測，有發射尖峰在約833與877 5 nm。在此等步驟狀況下，有一 LiCl增強劑，該來自腺嘌呤基團的訊號強度係較強於來自鳥嘌呤、胞嘧啶與胸嘧啶者。該負對照組（第6B圖）呈現該拉曼訊號係特定於該RCA 產物170、230、250、330、410，而無擴增反應下就未觀察到訊號。當只有一引子110、220被添加，第6圖描繪SERS 10 有效用於偵測LRCA擴增產物170、330。因為ERCA供給更多倍的擴增作用，該ERCA擴增產物230、250、410應呈現甚至更強的訊號。這些結果展示LRCA及ERCA可被用以與 SERS偵測組合來辨認目標生物分子130。氺氺氺 15 所有揭示及申請於此之方法、組成物及系統皆可在本發明整體揭露下無須過度實驗而被製造與使用。對於熟習本項技藝者明顯的是，變異可被施加於此所描述之方法、組成物及系統而不背離所申請標的之概念、精神及範疇。更特定地，明顯的是當該相同或相似的結果可被達成時， 20 相關的某些藥劑可被用來取代描述於此之藥劑。所有明顯於熟習本項技藝者之相似的取代物及修飾係被視為落於所申請標的之精神、範疇及概念。 32 1337623 r：圖式簡單說明3 第1圖描繪線性滾環式擴增（LRCA)方法。該經揭露的特定類型的檢測係一免疫RCA (滾環擴增）檢測，使用一經綴合至一寡核苷酸引子110的抗體120。該寡核苷酸引子110 5 可被雜交至一單股環形核酸模板150且起始該RCA過程。第2圖描繪指數滾環式擴增（ERCA)方法。第一引子220 (P1)雜交至一單股環形核酸模板210且起始該RCA過程。第二引子240 (P2)雜交至該經擴增的單股序列230中的另一處且起始互補股250之形成作用。當一第二擴增產物250到達 10 一鄰近擴增產物250的5'端，股的取代作用發生，產生該等擴增產物230、250中的分支處260之形成作用。第3圖描繪一例示的關於含有多腺苷340 (polyadenylate 340)殘基之LRCA產物330之SERS偵測方法。第4圖描繪一例示的關於含有多腺苷420殘基之ERCA 15 產物410之SERS偵測方法。第5圖顯示對於一0.9 nM (奈莫耳濃度）的腺嘌呤溶液之SERS偵測。該偵測體積係100至150飛升（femtoliter)，含有估計為60個腺嘌呤分子。

第6A圖顯示對於滾環擴增產物170、230、250、330、 20 410之SERS偵測，該等擴增係使用一單股的環形M13 DNA 模板 150、210、310。第6B圖顯示一不存有DNA聚合酶160的負對照。該第 6B圖的吸收刻度已被變化以放大該基線（baseline)。 33 1337623 【圖式之主要元件代表符號表】 110···寡核苷酸引子、引子 230···擴增產物 120…抗體 240···第二引子(P2) 130···生物分子 250···擴增產物 140…基材 260··分支處 150···環形核酸模板、環形DNA 310…環形DNA模板模板 320…多胸苷(T)分子 160—DNA聚合酶 330…擴增產物 Γ70…擴增產物 340…多腺苷(A)分子 180···寡核苷酸探針、探針 350…擴增訊號 210…環形核酸模板、環形DNA 410…擴增產物模板 420…多腺苷分子 220···第一引子(P1) 430…擴增訊號 34

Claims

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拾、申請專利範圍：第093101995號專利再審查案申請專利範圍替換本修正日期：99年9月21曰 1. 一種方法，其包含： a) 將一或多個目標生物分子貼附至一被納入一微機電系統的基材； b) 使用一第一引子來製造一或多個滾環式擴增法(RCA)產物，包含： (l) 將一第一引子綴合至一結合至該一或多個目標生物分子的抗體； (11)提供一環形模板，其具有序列互補於該第一引子； (m) 將該環形模板雜交至該第一引子； (iv)添加DNA聚合酶至該第一引子；（v)藉添加多重複數的該模板序列來延長該第一引子以產生一或多個擴增產物； c) 藉拉曼光譜法使用一整合至該微機電系統内的拉曼偵測器來偵測各擴增產物；以及 d) 藉一或多個擴增產物之存在來辨認一或多個目標生物分子。如申4專利範圍第1項之方法，其中各擴增產物係經貼附至 —目標生物分子。如申请專利範’丨項之方法其巾該等目標生物分子係核酸、多核苷酸或寡核苷酸。如申清專利範圍第3項之方法其中該等核酸係RN A或 35 dna。 5·如申清專利範圍第3項之方法其中該第一引子包含該目標生物分子的3,端。 5 6·如申请專利範圍第3項之方法其中該第〆引子雜交至該目標生物分子。，其中該等目標生物分子係胜 ’其令該等目標生物分子係結，其_該等配位子係被綴合至 7·如申請專利範圍第丨項之方法肽、多肽或蛋白質。 8. 如申請專利範圍第7項之方法合至一或多個配位子。 9. 如申請專利範圍第8項之方法該第一引子。 10·如申請專利範圍第9項之方法，其中該等配位子係抗體抗體片段、單鏈抗體、擬人化抗體或嵌合抗體。 15 4 U利範圍第1項之方法’其令該滾環式擴增法係線性 RCA(LRCA)或指數 rca(erca)。 12·如申請專利範圍第1項之方法，其中該拉曼光譜係表面增強拉曼光譜(SERS)或表面增強共振拉曼光譜(SERRS)。 13·如申請專利範圍第1項之方法，其進1包含將-環形、單 20 股嶋模板雜交至該第—引子，該模板含有一或多個㈣苷殘基。如申請專利範圍第叫之方法，其進—步包含提供—第二引子，該第二引子可結合至位於遠離該第一引子處之互補的模板序列。 15.如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含將該擴增產物 36 曝露至一銀膠體溶液。. 16·如申請專利範圍第】項之方法，其進一步包含藉由水性金屬鹽與該等擴增產物之間的反應作用而生成金屬奈米顆粒。 17. 如申4專利㈣第丨6項之方法，其進一步包含將該等擴增產物以醛處理來形成—還原劑。 18. 如申清專利範圍第16項之方法其中該等金屬鹽包含々+、 Cu、Cu2+、Au+、Au3+、Pd2+、Pd4+ 或 Al3+。 A如申請專利範項之方法，其進—步包含將—或多個拉曼標幟納入該擴增產物。 2〇‘如申請專利範圍第】項之方法其進一步包含定量該等一或多個目標生物分子的數量。 21· —種用於偵測生物分子的系統，其包含： a) 一或多個經貼附至一基材的目標生物分子； b) —或多個擴增產物，其之製得係藉： Ο將一或多個目標生物分子貼附至一被納入一微機電系統的基材， u) 將一第一引子綴合至一結合至該一或多個目標生物分子的抗體，出）提供一環形模板，其具有序列互補於該第一引子； iv)將該環形模板雜交至該第一引子， v) 添加DNA聚合酶至該第一引子，以及 vi)藉添加多重複數的該模板序列來延長該第一引子；以及 c) 一整合至該微機電系統内的拉曼偵測器用以偵測該等擴 37 1337623 增產物。 22. 如申請專利範圍第2】項之系統，其進一步包含一激發光源用以激發該等擴增產物。 23. 如申請專利範圍第22項之系統，其中該光源包含一雷射。 5 24‘如申請專利範圍第2丨項之系統，其中該拉曼偵測器包含一或多個單元係選自於以下所構成之組群：一CCD攝影機、一朋渴光二極體、一分光光度計、—光學倍增管、一光譜儀、一電荷注射裝置、一光二極體陣列、一陣列偵測器以及一光電晶體陣列。 φ 1〇 25.如申請專利範圍第2丨項之系統，其進一步包含金屬奈米顆粒。 26·如申請專利範圍第25項之系統，其中該奈米顆粒包含至少、 —金屬係選自於以下所構成之組群‘·銀 '金、銅' 鉑以及鋁。 15 27·如申請專利範圍第2丨項之系統，其進一步包含一或多個經貼附至該等擴增產物之拉曼標幟。 28.如申請專利範圍第21項之系統，其進_步包含_電腦用以 # 分析來自該拉曼偵測器之數據。 20 38