DE60037267T2

DE60037267T2 - Oberflächenverstärkte spektroskopie-aktive zusammengesetzte nanopartikel

Info

Publication number: DE60037267T2
Application number: DE60037267T
Authority: DE
Inventors: Michael J. Los Altos NATAN
Original assignee: Oxonica Inc
Current assignee: Oxonica Inc
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2008-10-09
Anticipated expiration: 2020-10-07
Also published as: US6514767B1; EP2295954A1; AU8000400A; CA2386186A1; PT1226422E; EP1226422B1; JP4786096B2; ES2296648T3; DK2295954T3; EP1226422A1; PT2295954T; DK1226422T3; JP2003511557A; EP1226422A4; DE60037267D1; CY1118092T1; ES2584553T3; EP2295954B1; EP1804053A1; WO2001025758A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verbund-Nanoteilchen, die bei der oberflächenverstärkten Spektroskopie aktiv sind, Verfahren zur Herstellung der Teilchen und Verwendungsmöglichkeiten der Teilchen (einschließlich ihre Verwendung als molekulare oder zelluläre optische Markierungen). Insbesondere betrifft die Erfindung das Gebiet der Markierungen in Submikrongröße, die kovalent oder nicht-kovalent an Einheiten von Interesse befestigt werden können, um deren quantitative Bestimmung, Lokalisierung, Identifizierung und/oder Tracking vornehmen zu können.
Hintergrund der Erfindung
Wenn Licht auf ein Molekül gerichtet wird, wird der Großteil der einfallenden Photonen ohne Frequenzänderung elastisch gestreut. Diese Erscheinung wird als Rayleigh-Streuung bezeichnet. Jedoch ist die Energie von einigen der einfallenden Photonen (etwa 1 von jeweils 10⁷ einfallenden Photonen) an bestimmte Vibrationsarten der Molekülbindungen gekoppelt. Eine derartige Kopplung bewirkt, dass ein Teil des einfallenden Lichts durch das Molekül inelastisch gestreut wird, und zwar mit einem Bereich von Frequenzen, die sich vom Bereich des einfallenden Lichts unterscheiden. Diese Erscheinung wird als Raman-Effekt bezeichnet. Durch Auftragen der Frequenz eines derartigen, inelastisch gestreuten Lichts gegen die Intensität lässt sich das einzigartige Raman-Spektrum des beobachteten Moleküls erhalten. Eine Analyse des Raman-Spektrums einer unbekannten Probe kann Informationen über die molekulare Zusammensetzung der Probe liefern.
Das einfallende Licht für die Raman-Spektroskopie, das üblicherweise von einem Laser bereitgestellt wird, kann auf einen kleinen Lichtfleck konzentriert werden, wenn das Spektroskop mit der Konfiguration eines Mikroskops gebaut ist. Da das Raman-Signal sich linear mit der Laser-Stärke verändert, kann die Lichtintensität an der Probe sehr hoch sein, um die Empfindlichkeit des Instruments zu optimieren. Da außerdem die Raman-Response eines Moleküls im wesentlichen unverzüglich erfolgt (ohne jegliche langlebige, hochgradig energetische Zwischenstufen), ist eine Photobleichung des Raman-aktiven Moleküls (auch bei dieser hohen Lichtintensität) unmöglich. Damit steht die Raman-Spektroskopie in starkem Gegensatz zur Fluoreszenzspektroskopie, bei der eine Photobleichung zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten stark einschränkt.
Der Raman-Effekt kann signifikant verstärkt werden, indem man das oder die Raman-aktiven Moleküle nahe (≤ 50 Å) an eine strukturierte Metalloberfläche bringt. Dieses Feld nimmt exponentiell mit der Entfernung von der Oberfläche ab. Die Moleküle werden typischerweise dadurch in enge Nachbarschaft zu Metalloberflächen gebracht, indem man für eine Adsorption des Raman-aktiven Moleküls an in geeigneter Weise aufgerautem Gold, Silber oder Kupfer oder einem anderen Metall mit freien Elektronen sorgt. Eine Oberflächenverstärkung der Raman-Aktivität wird bei kolloidalen Metallteilchen, bei Metallfilmen auf dielektrischen Substraten und bei Metallteilchen-Anordnungen beobachtet. Der Mechanismus, gemäß dem diese oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) erfolgt, ist bekannt. Es wird angenommen, dass es sich um die Folge einer Kombination von (i) Oberflächen-Plasmon-Resonanzen im Metall, die die lokale Intensität des Lichts verstärken, und (ii) der Bildung und anschließenden Übergänge von Charge-Transfer-Komplexen zwischen der Metalloberfläche und dem Raman-aktiven Molekül handelt.
Die SERS ermöglicht den Nachweis von Molekülen, die an der Oberfläche eines einzelnen Gold- oder Silber-Nanoteilchens angebracht sind. Ein Raman-verstärkendes Metall, das mit einem oder mehreren Raman-aktiven Molekülen assoziiert oder daran gebunden ist, wird als ein SERS-aktives Nanoteilchen bezeichnet. Derartige SERS-aktive Nanoteilchen können als optische Markierungen geeignet sein. Beispielsweise können SERS-aktive Nanoteilchen in Immunoassays verwendet werden, wenn sie mit einem Antikörper gegen ein Zielmolekül von Interesse konjugiert sind. Wenn das Ziel von Interesse an einem festen Träger immobilisiert ist, kann die Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Zielmolekül und einem einzelnen, an ein Nanoteilchen gebundenen Antikörper nachgewiesen werden, indem man nach dem besonderen Raman-Spektrum des Raman-aktiven Moleküls sucht. Da ferner ein einziges Raman-Spektrum (von 100 bis 3500 cm^–1) zahlreiche verschiedene Raman-aktive Moleküle nachweisen kann, können die SERS-aktiven Nanoteilchen in Multiplex-Testformaten verwendet werden.
SERS-aktive Nanoteilchen bieten die Möglichkeit einer beispiellosen Empfindlichkeit, Stabilität und Multiplex-Funktionalität, wenn sie als optische Markierungen in chemischen Tests eingesetzt werden. Jedoch treten bei SERS-aktiven Nanoteilchen, die aus Metallen gebildet sind, erhebliche praktische Probleme bei der Verwendung in derartigen Tests auf. Metallnanoteilchen sind gegenüber einer Aggregation in wässriger Lösung überaus empfindlich. Nachdem sie einmal aggregiert sind, ist es unmöglich, sie erneut zu dispergieren. Ferner sind die chemischen Zusammensetzungen einiger Raman-aktiven Moleküle mit den chemischen Maßnahmen, die zum Anbringen anderer Moleküle (z. B. von Proteinen) an Metallnanoteilchen ergriffen werden, unverträglich. Dies schränkt die Wahlmöglichkeiten in bezug auf Raman-aktive Moleküle, in bezug auf die chemischen Bindungsmaßnahmen und in bezug auf andere Moleküle, die an den Metallnanoteilchen anzubringen sind, ein.
Das bedeutendste Problem bei der Verwendung von Metallnanoteilchen bei Raman-Markierungen besteht in der Ähnlichkeit der Raman-Spektren der an die Nanoteilchen zu kuppelnden Moleküle. Beispielsweise ergeben sich bei einem Multiplex-Sandwich-Immunoassay hochgradige Ähnlichkeiten der Raman-Spektren der sekundären Antikörper, an die die Nanoteilchen gebunden sind, so dass ihre Auflösung unmöglich ist. Außerdem sind die Teile der sekundären Antikörper, die Unterschiede aufweisen, d. h. die Antigen-Bindungsdomänen, typischerweise von der Metalloberfläche zu weit entfernt, als dass sie signifikant verstärkt werden könnten.
Aus dem Stand der Technik ist es bekannt, dass Moleküle selbst als Raman-Markierungen verwendet werden können, vorausgesetzt, ihr Raman-Streuungsquerschnitt ist ausreichend groß. Somit ermöglicht beispielsweise ein direktes Anbringen von Farbstoffen an Antikörper deren Verwendung als Markierungen für Immunoassays. Diese Vorgehensweise unterliegt jedoch sehr erheblichen Einschränkungen: Die Molekülstrukturen/Merkmale, die zu intensiven Raman-Spektren führen (z. B. Polarisierbarkeit, aromatische Beschaffenheit, Konjugation, Heteroatome und insbesondere ein signifikanter Absorptionsquerschnitt), führen auch zur Entstehung von komplexen Raman-Spektren. Die Verwendung von molekularen Raman-Markierungen erfordert sehr hohe Extinktionen im sichtbaren Bereich des Spektrums, um zur Resonanz-Raman-Streuung zu gelangen, was das Raman-Signal um bis zu drei Größenordnungen erhöht. Es besteht eine grundlegende physikalische Unverträglichkeit zwischen Molekülen, die sichtbares Licht gut absorbieren, und solchen, die einfache Raman-Spektren aufweisen. Somit sind die Raman-Spektren der vorstehend beschriebenen Farbstoffe überaus kompliziert und es besteht keine Möglichkeit, diese Tests als Multiplextests durchzuführen.
Ein zweites grundlegendes Problem bei Markierungen auf Raman-Basis ist die Schwäche des Raman-Signals. Es ist nicht möglich, einzelne Moleküle (oder auch Tausende von Molekülen) durch Raman nachzuweisen, ohne dass man eine Oberflächenverstärkung anwendet.
Im einzelnen beschreiben Jing Ni et al (Jing Ni, Robert J. Lipert, G. Brent Dawson und Marc D. Porter, "Immunoassay Readout Method Using Extrinsic Raman Labels Adsorbed an Immunogold Colloids", Anal. Chem., Bd. 71 (1999), S. 4903–4908) folgendes:

– die Immobilisierung von eingefangenen Antikörpern an einer Goldoberfläche,
– die Verwendung der immobilisierten Antikörper zum Einfangen von Antigenen aus einer Lösung und
– den indirekten Raman-Nachweis über Gold-Nanoteilchen, die mit Antikörpern und von Natur aus starken Raman-Streuern (d. h. Raman-Reportermolekülen) markiert sind.

Liz-Marzan et al (L. M. LIZ-MARZAN, M. GIERSIG und P. MULVANEY, "Synthesis of Nanosized Gold-Silica-Core-Shell Particles", Langmuir, Bd. 12 (1996), S. 4329–4335) beschreiben die Herstellung von Gold-Nanoteilchen, die mit Siliciumdioxidschichten beschichtet sind. Die optischen Eigenschaften der Dispersionen von mit Siliciumdioxid beschichteten Goldteilchen mit variierenden Dicken der Mantelschicht werden untersucht. Idealerweise würde man eine Markierung auswählen, die die Verstärkungsfaktoren in Zusammenhang mit SERS sowie die Fähigkeit zum Anbringen einer derartigen Markierung an einer frei diffundierenden Spezies aufweisen (was klarerweise bei makroskopischen SERS-aktiven Oberflächen unmöglich ist).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Lösung für die vorerwähnten Schwierigkeiten bei der Verwendung von Raman-Streuungseinheiten als optisch adressierbaren Markierungen zu finden, insbesondere bei chemischen oder biomolekularen Tests. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Gruppe von mindestens 20 verschiedenen SERS-aktiven Nanoteilchen zur Verwendung als "spaltungsfreie" optische Markierungen bei chemischen Kombinationssynthesen auf der Basis von Perlen bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein optisches Nachweissystem für Multiplextests zu beschreiben.
Die vorliegende Erfindung ist auf bei der oberflächenverstärkten Spektroskopie aktiven Verbund-Nanoteilchen, einschließlich SERS-aktiven Metallnanoteilchen (SACNs) abgestellt. Unter die Erfindung fallen ferner Verfahren zur Herstellung der Teilchen und die Verwendung der Teilchen (einschließlich ihre Verwendung als molekulare oder zelluläre optische Markierungen). Die erfindungsgemäßen Markierungen von Submikrongröße können kovalent oder nicht-kovalent an Einheiten von Interesse (die im Größenbereich von Molekülen bis zu makroskopischen Objekten liegen) angebracht werden, um sie einer quantitativen Bestimmung, Lokalisierung, Identifizierung und/oder einem Tracking zuzuführen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme, die bei der Verwendung einer bei der oberflächenverstärkten Spektroskopie aktiven (SES-aktiven) Spezies, wie einer Raman-Streuungsspezies), als optischer Markierung auftreten. Erfindungsgemäß werden neue SES-aktive Verbund-Nanoteilchen, einschließlich SERS-aktive Metall-Nanoteilchen (SACNs) bereitgestellt, die aus einem Metall bestehen, das aus der Gruppe Au, Ag und Cu ausgewählt ist. Derartige Nanoteilchen umfassen jeweils ein SES-aktives Metall-Nanoteilchen, eine Submonolayer, Monolager oder Multilager einer SES-aktiven Spezies in enger Nachbarschaft zur Metalloberfläche und eine Verkapselungshülle aus Glas. Dies bringt das SES-aktive Molekül (alternativ hier auch als "Analyt" bezeichnet; nicht zu verwechseln mit der Spezies in Lösung, die letztlich quantitativ bestimmt wird) an die Grenzfläche zwischen dem Metall-Nanoteilchen und dem Verkapselungsmittel.
Die erhaltenen, mit Glas beschichteten, mit dem Analyt beladenen Nanoteilchen (GANS) behalten die Aktivität der SES-aktiven Metall-Nanoteilchen, sequestrieren diese Aktivität aber stark in bezug auf die äußere Oberfläche des Nanoteilchens. Somit weisen im Fall der oberflächenaktiven Raman-Streuung (SERS), die erhaltenen GANs eine SERS-Aktivität auf, jedoch befindet sich der SERS-aktive Analyt an der Grenzfläche zwischen den Metall-Nanoteilchen und dem Verkapselungsmittel.
Das Analytmolekül kann so gewählt werden, dass es äußerst einfache Raman-Spektren aufweist, da es für die Spezies nicht notwendig ist, dass sie sichtbares Licht absorbiert. Dies ermöglicht wiederum die Herstellung von multiplen GANs-Teilchen, die jeweils verschiedene Analytmoleküle aufweisen, so dass die Raman-Spektren der einzelnen Analyten in einem Gemisch von verschiedenen Typen von GANs-Teilchen unterschieden werden können.
GANs lassen sich leicht handhaben und lagern. Sie sind auch gegen eine Aggregation beständig, gegen eine Zersetzung des Analyten in Lösungsmittel und Luft stabilisiert, chemisch inert und lassen sich ohne Verlust an SERS-Aktivität zentrifugieren und redispergieren.
Von besonderer Bedeutung ist, dass sich die gläsernen Hüllen der GANS leicht nach üblichen Techniken derivatisieren lassen. Dies ermöglicht die Konjugation der GANS an Moleküle (einschließlich Biomoleküle, wie Proteine und Nucleinsäuren) oder an feste Träger, ohne dass die Raman-Aktivität der GANs gestört wird. Im Gegensatz zu Metall-Nanoteilchen lassen sich GANs zur Trockene eindampfen und anschließend vollständig in einem Lösungsmittel redispergieren. Unter Anwendung der hier bereitgestellten Techniken ist es möglich, GANs herzustellen, die individuell unter Anwendung von SERS nachweisbar sind.
Bei den erfindungsgemäß bereitgestellten SACNs handelt es sich um in besonderer Weise identifizierbare Nanoteilchen. Sie können praktisch in jeder Situation verwendet werden, bei der es erforderlich ist, Moleküle oder Gegenstände (einschließlich Perlen und andere Typen von festen Trägern) mit einer optischen Markierung zu markieren. Biomoleküle lassen sich leicht nach üblichen Techniken mit dem Außenbereich von SACNs konjugieren, was es ermöglicht, dass die Teilchen als optische Markierungen in biologischen Tests wirken. SACNs lassen sich in praktisch jedem Test einsetzen, der sich einer optischen Markierung bedient, z. B. einer fluoreszierenden Markierung. Jedoch haben SACNs als optische Markierungen mehrere deutliche Vorteile gegenüber fluoreszierenden Markierungen. Zu diesen Vorteilen gehören ein erheblich empfindlicherer Nachweis, die chemische Gleichmäßigkeit, die absolute Beständigkeit der SERS-Aktivität gegen Photobleichung oder Photoabbau. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von SACNs als optische Markierungen besteht in der Einfachheit, mit der sich einzelne SACNs mit unterschiedlichen SERS-Aktivitäten voneinander trennen lassen. Mindestens 20 verschiedene SACNs sind unter Anwendung eines einfachen Raman-Spektroskops voneinander trennbar. Die Durchführung von Multiplex-Tests unter Anwendung einer Gruppe von verschiedenen SACNs, die jeweils eine einzigartige unterscheidbare SERS-Aktivität aufweisen, wird somit ermöglicht.
Ferner können die SACNs als neue "spaltungsfreie" optische Markierungen bei chemischen Kombinationssynthesen auf der Basis von Perlen verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform kann jede Synthesestufe im Schema von der Konjugation eines besonderen SACN mit der Perle begleitet sein. Die Reaktionsgeschichte der Perle und somit die Identität der synthetisierten Verbindung kann sodann durch Lesen des SERS-Spektrums der Perle bestimmt werden, ohne dass es zuerst erforderlich ist, die SACNs von der Perle zu spalten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A zeigt Aufnahmen mit einem Transmissionselektronenmikroskop von GANs mit 35 nm-Au-Kernen mit 40 nm Glas. 1B zeigt 60 nm-Au-Kerne mit 16 nm Glas.
2 zeigt Aufnahmen mit einem Transmissionselektronenmikroskop von 35 nm-Au-8 nm Glas-GANs nach Zentrifugation durch eine 50%-ige Glycerinlösung.
3 zeigt den Widerstand gegen Säureätzung des Goldkerns von GANs-Teilchen mit einem 35 nm-Au-Kern und einer 8 nm-Hülle aus Glas. Das Ätzen des Goldkerns führt zu einer Verringerung der Absorption. Dies ist in 3A aufgetragen (die Zeit nach Zugabe der Ätzlösung ist angegeben). Die Geschwindigkeit der Au-Ätzung ist in 3B in Form eines Diagramms der Absorption gegen die Zeit in der Ätzlösung dargestellt.
4 zeigt das Raman-Spektrum von GANs mit einem 40 nm-Au-Kern, der mit trans-4,4'-Bis-(pyridyl)-ethylen (BPE) bei Einkapselung in 4 nm Glas beschichtet ist. Die Spur A zeigt das charakteristische BPE-Raman-Signal. Die Spur B zeigt das Raman-Signal der gleichen Teilchen ohne den BPE-Analyten.
5 zeigt das Raman-Spektrum einer Suspension von GANs mit 40 nm Au bei Beschichtung mit trans-4,4'-Bis-(pyridyl)-ethylen (BPE)/4 nm Glas (Spur A); Überstand einer ersten Zentrifugation der GANs (Spur B); und Überstand einer zweiten Zentrifugation der GANs (Spur C).
6 zeigt die Raman-Spektren von GANs (80 nm-Au-Kern/20 nm Glas/2-Mercaptopyridin als Analyt) und einer 50 mM Lösung von 2-Mercaptopyridin bei Absorption an einem herkömmlichen dreischichtigen SERS-Substrat.
7 zeigt die Raman-Spektren der folgenden vier Typen ("Flavors") von GANs-Teilchen: (A) GANs, markiert mit Furonitril; (B) GANs, markiert mit Furonitril (66%) und Cyanoessigsäure (33%); (B) GANs, markiert mit Furonitril (33%) und Cyanoessigsäure (66%); und (D) GANs, markiert mit Cyanoessigsäure.
8 zeigt die Ramen-Spektren von GANs (40 nm-Au-Kern/4 nm Glas) (a) markiert mit trans-4,4'-Bis-(pyridyl)-ethylen (BPE-GANs) oder (b) markiert mit Imidazol (IM-GANs) oder (c) unmarkiert.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung ist auf bei der oberflächenverstärkten Spektroskopie aktiven Verbund-Nanoteilchen abgestellt, unter Einschluss von SERS-aktiven Metall-Nanoteilchen (SACNs). Unter den Umfang der Erfindung fallen ferner Verfahren zur Herstellung der Teilchen und Verwendungsmöglichkeiten der Teilchen (unter Einschluss ihrer Verwendung als molekulare oder zelluläre optische Markierungen). Die erfindungsgemäßen Markierungen von Submikrongröße können kovalent oder nicht-kovalent an Einheiten von Interesse (diese können im Größenbereich von Molekülen bis zu makroskopischen Objekten liegen) gebunden sein, und zwar für die Zwecke einer quantitativen Bestimmung, Lokalisierung, Identifizierung und/oder Tracking.
Bevorzugte Ausführungsformen
SERS-aktive Verbund-Nanoteilchen (SACNs) bestehen aus einem Metall-Nanoteilchen, bestehend aus einem Metall, das aus der Gruppe Au, Ag und Cu ausgewählt ist, an dessen Oberfläche eine oder mehr Raman-aktive Moleküle (alternativ hier als "Analyten" bezeichnet) gebunden sind oder damit assoziiert sind. Dieser Komplex eines Raman-verstärkenden Metalls und eines Analyten (als SERS-aktives Metall-Nanoteilchen bezeichnet) wird sodann mit einem Verkapselungsmittel beschichtet oder darin eingekapselt. Beim Verkapselungsmittel handelt es sich um ein Glasmaterial. Das SACN wird dementsprechend als mit Glas beschichteter Analyt, der auf ein Nanoteilchen aufgebracht ist, (GAN) bezeichnet.
Bei bevorzugten Ausführungsformen werden SACNs bereitgestellt, indem man eine Hülle aus einem geeigneten Verkapselungsmittel über einem SERS-aktiven Metall-Nanoteilchenkern züchtet oder anderweitig platziert. Der Metall-Nanoteilchenkern besteht vorzugsweise aus Gold- oder Silberkügelchen mit einem Durchmesser von 20–200 nm. Besonders bevorzugt ist ein abgeflachtes oder gestrecktes Metallsphäroid aus den gleichen Materialien. Für SERS unter Verwendung von einfallendem roten Licht (∼633 nm) wird die optimale SERS-Reaktion mit Gold-Nanoteilchenkernen von 63 nm Durchmesser erhalten. Metall-Nanoteilchen der angestrebten Größe können aus einer Anzahl von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren als Metallkolloide gezüchtet werden. Beispielsweise wurde eine chemische oder photochemische Reduktion von Metallionen in Lösung unter Verwendung von beliebigen Reduktionsmitteln beschrieben. Gleichermaßen wurden Synthesen von Nanoteilchen in eingeschränkten Volumina durchgeführt, z. B. im Innern einer Vesikel. Nanoteilchen lassen sich über eine elektrische Entladung in Lösung herstellen. Es wurden Dutzende von weiteren Verfahren beschrieben, die bis auf die Mitte des 19. Jahrhunderts zurückgehen.
Vorzugsweise verändert das Verkapselungsmittel die SERS-Aktivität des Metall-Nanoteilchens nicht in messbarem Umfang. Jedoch werden die Vorteile der vorliegenden Erfindung immer noch erreicht, selbst wenn das Verkapselungsmittel einen gewissen messbaren Einfluss ausübt, vorausgesetzt, dass es die SERS-Aktivität nicht stört oder dem Raman-Spektrum eine signifikante Komplexität hinzufügt. Ferner sollte das Verkapselungsmittel bereitwillig zu modifizieren sein, um Moleküle, einschließlich Biomoleküle, an ihrer äußeren Oberfläche anzubringen. Glas ist ein geeignetes Verkapselungsmittel. Die Verkapselung wird nach oder während der Absorption am Kern-Nanoteilchen des Raman-aktiven Analyten, der die SERS-Aktivität des SACN bereitstellen soll, durchgeführt. Auf diese Weise wird der Raman-aktive Analyt vom umgebenden Lösungsmittel als eine Beschichtung an der Oberfläche des Metall-Nanoteilchenkerns eingeschlossen. Eine derartige Konfiguration verleiht dem Metall-Nanoteilchenkern eine stabile SERS-Aktivität. Ein Raman-aktiver Analyt kann eine Submonolayer-, vollständige Monolager- oder Multilayer-Anordnung auf der Oberfläche des Metall-Nanoteilchenkerns bilden. Ein Raman-aktiver Analyt kann eine einzelne Spezies eines Raman-aktiven Moleküls umfassen oder es kann sich um ein Gemisch von verschiedenen Spezies von Raman-aktiven Molekülen handeln.
Erfindungsgemäß handelt es sich beim Verkapselungsmittel um Glas (z. B. SiO_x). Um eine Verkapselung in Glas vorzunehmen, werden die Metall-Nanoteilchenkerne vorzugsweise zunächst mit einem Glasgrundiermittel (d. h. ein Material, das zu einem Wachstum einer gleichmäßigen Beschichtung aus Glas führen kann oder das die Haftung der Glasbeschichtung am Teilchen verbessert oder beide Wirkungen ausübt) behandelt. Glas wird sodann nach üblichen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren über dem Metall-Nanoteilchen gezüchtet. Die erhaltenen SACN-Kerne werden als Glas-Analyt-beladene Nanoteilchen (GANs) bezeichnet.
Es ist darauf hinzuweisen, dass Glas und zahlreiche andere Materialien funktionelle Gruppen enthalten, die einer Molekülhaftung zugänglich sind. Beispielsweise ermöglicht das Eintauchen von Glas in eine Base ein kovalentes Anhaften von Alkyltrichlorsilanen oder Alkyltrialkoxysilanen, wobei eine zusätzliche Funktionalität am Ende der Alkylgruppe verfügbar wird. Somit können Glasoberflächen mit sämtlichen Formen von Biomolekülen und biomolekularen Superstrukturen, einschließlich Zellen, sowie Oxiden, Metallen, Polymeren und dergl. modifiziert werden. Gleichermaßen können Oberflächen von Glas mit gut organisierten monomolekularen Schichten modifiziert werden. Kurz zusammengefasst, Glasüberzüge dienen als Träger für im wesentlichen beliebige und sämtliche Formen von chemischer Funktionalisierung (Derivatisierung). Dies gilt gleichermaßen für zahlreiche verschiedene Formen von Verkapselungsmitteln. Der wesentliche Punkt besteht darin, dass SACN-Teilchen an beliebigen Spezies mit chemisch reaktiven funktionellen Gruppen angebracht werden können. Sämtliche chemischen funktionellen Gruppen sind unter bestimmten Bedingungen reaktiv. Es gibt keine Beschränkungen hinsichtlich der Spezies, die an der Verkapselungsoberfläche immobilisiert werden kann.
Die Dicke des Verkapselungsmittels kann je nach den physikalischen Eigenschaften, die für das SACN erforderlich sind, leicht variiert werden. Beispielsweise können Überzüge, die zu dick sind (in der Größenordnung von 1 μm oder mehr) die Erzielung von intensiven Raman-Spektren ausschließen. Zu dicke Überzüge könnten zu einer Störung des Raman-Spektrums des Analyten durch die Moleküle an der Verkapselungsoberfläche führen. Gleichzeitig werden die physikalischen Eigenschaften, wie der Sedimentationskoeffizient, in klarer Weise durch die Dicke des Verkapselungsmittels beeinflusst. Im allgemeinen ist das Verschließen des oder der Raman-aktiven Analyten am Metall-Nanoteilchenkern gegenüber dem umgebenden Lösungsmittel umso wirksamer, je dicker das Verkapselungsmittel ist.
Für GANS liegt die bevorzugte Glasdicke im Bereich von 1–40 nm. In einigen speziellen Ausführungsformen umfassen die GANs Goldteilchen mit einem Durchmesser von 60 nm, die in einem 16 nm dicken Glaskügelchen verkapselt sind. Die Optimierung der Abmessungen der SACNs lässt sich leicht vom Fachmann vornehmen. Demzufolge kann man die Zusammensetzung des Teilchens oder dessen Größe und Gestalt erfindungsgemäß verändern, um die Intensität des Raman-Analytenmoleküls, das als Markierung verwendet wird, zu optimieren. Tatsächlich ist es bekannt, dass Kern-Mantel-Nanoteilchen (d. h. Au/AuS) die SERS unterstützen und sehr unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen, verglichen mit reinen Metall-Nanoteilchen. Gleichermaßen ist es bekannt, dass SERS von gestreckten Sphäroiden verstärkt ist, bezogen auf Kügelchen mit der gleichen Hauptachse. Ferner ist es bekannt, dass Einzelteilchenverstärkungen stark von der Wellenlänge abhängig sind. Somit kann man die Teilchengröße abstimmen, um ein maximales Signal für eine gegebene Anregungswellenlänge zu erhalten.
Häufig ist es erstrebenswert, echte SACNs von freien Teilchen des Verkapselungsmittels, die nicht um ein Metall-Nanoteilchen als Kern angeordnet sind, abzutrennen. Eine derartige Abtrennung verbessert die SERS-Aktivität des Nanoteilchenpräparats, da Teilchen von freiem Verkapselungsmittel nicht SERS-aktiv sind. Beispielsweise können GANs von freien Glasteilchen durch Größenausschlusszentrifugation in 50% Glycerin abgetrennt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft speziell die Bildung einer Gruppe von mindestens 20 verschiedenen SACNs, die jeweils ein einzigartiges SERS-Spektrum aufweisen. Da die Raman-Banden zahlreicher Moleküle äußerst eng sind (z. B. CN^– beträgt weniger als 1 nm bei FWHM), ist es möglich, eine Gruppe von SACNs zu synthetisieren, von denen jedes einen Raman-Analyten enthält, der sich von seinem nächsten Nachbarn im Spektrum in einem Abstand von 20 Wellenzahlen befindet. Beispielsweise lassen sich GANs-Teilchen mit ¹³CN als Analyt leicht von GANS mit ¹²CN als Analyt unterscheiden und ist auch leicht von einem C¹⁵N unterscheidbar. Auf diese Weise ist es möglich, 540 verschiedene und leicht auftrennbare Peaks in einem einzigen Raman-Spektrum bei 633 nm von 300 bis 3000 cm^–1 aufzulösen, wobei ein Spektrograph zur Ausbreitung der Photonen und eine CCD-Kamera als Detektor verwendet werden. Jedoch ist die erfindungsgemäße Praxis nicht auf die vorstehend beschriebenen Instrumente beschränkt: Raman-Experimente mit GANs oder SACNs lassen sich mit sichtbarer oder im nahen Infrarot liegender Strahlung durchführen, wobei Raman-Banden von 100 cm^–1 bis 5000 cm^–1 verwendet werden können, beliebige Formen von Monochromatoren oder Spektrometern zur räumlichen oder zeitlichen Auftrennung von Photonen und beliebige Formen von Detektoren für Photonen verwendet werden können. Diese Anordnung erleichtert die Herstellung von Gruppen von mindestens 10 auflösbaren SACNs und ergibt eine große Bandbreite für buchstäblich Hunderte von Gruppen von SACNs.
Um die Fähigkeit zur Unterscheidung einzelner SACN-Populationen in der Gruppe aus der Hintergrund-Raman-Aktivität zu unterscheiden, beschreibt die Erfindung die Verwendung von Raman-aktiven Analyten, die isotopische Zusammensetzungen aufweisen, im Unterschied zu den natürlich vorkommenden Spezies. Beispielsweise ist ¹³CN vollständig von beliebigem, möglicherweise im Hintergrund vorliegenden, natürlich vorkommenden ¹²CN abtrennbar. Selbstverständlich ist es für den Fachmann ersichtlich, dass Kombinationen von Isotopen sowie Verhältnisse von Isotopen gleichermaßen in wirksamer Weise zur Idenfizierung besonderer SACNs verwendet werden können.
Obgleich die SERS-Aktivität einer jeden Population von SACNs in der Gruppe einzigartig ist, werden die übrigen Eigenschaften der SACNs innerhalb der Gruppe einheitlich belassen. Da die SERS-Aktivität eines jeden SACN durch das Verkapselungsmittel vom umgebenden Milieu abgehalten wird, weisen individuelle Populationen keine unterschiedlichen Anforderungen an Lösungsmittel oder Lagerung auf. Ferner weisen die einzelnen SACNs den gleichen Außenmantel auf, was die Wahl der chemischen Gegebenheiten entweder für die Anhaftung von Molekülen an die SACNs oder für die Anhaftung der SACNs an feste Träger erleichtert.
Während sich die vorstehenden Beispiele auf die Raman-Streuung konzentrieren, und zwar insbesondere auf die oberflächenverstärkte Raman-Streuung als Nachweismechanismus, können eine Anzahl von analogen Verfahren gleichermaßen angewandt werden und fallen somit unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise kann man einen resonanzangeregten Analyten verwenden, wodurch man zur Technik der oberflächenverstärkten Resonanz-Raman-Streuung (SERRS) gelangt. Man kann sich auch einer veröffentlichten Arbeit über verstärkte IR-Absorptionsspektren (SEIRA) von aufgerauten Nanomaßstab-Oberflächen bedienen. Gleichermaßen haben Van Duyne und Mitarbeiter gezeigt, dass eine oberflächenverstärkte Hyper-Raman-Streuung (SERRS) auch an aufgerauten Nanomaßstab-Metalloberflächen auftritt (sowie das Resonanzanaloge SEHRRS). Es ist darauf hinzuweisen, dass für ein gegebenes Molekül mit besonderen 3N-5- oder 3N-6-Vibrationen (wobei N die Anzahl von Atomen bedeutet) sich sämtliche Vibrationen im Raman-, Hyper-Raman- oder IR-Spektrum finden lassen. Tatsächlich kann die Identifizierung bestimmter SACNs auf einer Kombination von optischen Abfrageverfahren, einschließlich SERS, SERRS, SEIRA, SERRS und SEHRRS, beruhen.
Es ist auch darauf hinzuweisen, dass bekanntlich ein signifikanter Betrag an (Rayleigh)-Lichtstreuung an Teilchen mit Dimensionen von mindestens 1/10 der Anregungswellenlänge auftritt, wodurch die Möglichkeit geschaffen wird, dass die Rayleigh- oder Hyper-Raleigh-Streuung bei der Identifizierung von SACNs verwendet werden kann. Außerdem können Kombinationen einer elastischen Streuung (z. B. Raleigh), einer inelastischen Streuung (z. B. Raman) und einer Absorption (z. B. IR) zur Identifizierung von Teilchen verwendet werden.
Verwendung von SACNs
Die erfindungsgemäß bereitgestellten SACNs können in praktisch beliebigen Tests, bei denen eine nachweisbare Markierung benötigt wird, verwendet werden. Bei einigen Ausführungsformen werden SACNs in biologischen und chemischen Tests als Ersatz für übliche fluoreszierende Markierungen verwendet. Tatsächlich besitzen SACNs eine Anzahl von Eigenschaften, die sie gegenüber optischen Markierungen auf der Grundlage von Fluorophoren zu weit überlegenen Produkten machen. Beispielsweise werden Tests unter Anwendung eines Fluorophornachweises üblicherweise durch das Auftreten von Autofluoreszenz und anderen Hintergrundeffekten behindert. Zusätzlich erfordern zahlreiche Tests die Verwendung einer Anzahl von verschiedenen Fluorophoren; verschiedene Fluorophore benötigen üblicherweise verschiedene chemische Anhaftungsvorgänge und weisen verschiedene Anforderungen an die Umgebung und unterschiedliche Empfindlichkeiten auf. Besonders bemerkenswert ist das Quenching von Fluoreszenzaktivität, das beobachtet wird, wenn einige Fluorophore mit Proteinen konjugiert werden. Schließlich stellt der irreversible Photoabbau, der sich aus der Schaffung eines angeregten Triplett- oder Singulettzustands unter anschließender nicht-reversibler chemischer Umsetzung ergibt, die den angeregten Zustand permanent beseitigt, eine starke Einschränkung der Empfindlichkeit des Nachweises dar. Im Gegensatz dazu können SACNs keiner Photobleichung oder keinem Photoabbau unterliegen, wobei sie gleichmäßige chemische und physikalische Eigenschaften aufweisen und leicht vom Hintergrund getrennt werden können. Am wichtigsten ist vermutlich, dass der SACN-Nachweis erheblich empfindlicher als der Fluorophornachweis ist. Es ist tatsächlich möglich, ein einzelnes Molekül mit einem einzelnen SACN zu markieren und anschließend die Anwesenheit dieses Moleküls unter Anwendung von Raman-Spektroskopie nachzuweisen. Eine derartige einfache Einzelmolekülauflösung ist auf dem Gebiet des Fluorophornachweises ohne Parallelen.
Ein Beispiel für einen biologischen Test, bei dem SACNs als optische Markierungen verwendet werden können, ist der Sandwich-Immunoassay. Bei Sandwich-Tests wird ein nachzuweisendes Ziel von einer festen Oberfläche eingefangen. Ein Antikörper (oder ein anderer Ligand) gegen das gleiche Ziel wird an einem SACN angebracht und sodann mit dem festen Träger in Kontakt gebracht. Das Vorliegen des SACN-SERS-Signals beim festen Träger zeigt die Anwesenheit des Antigens an. Im allgemeinen können SACNs mit beliebigen Molekülen, die zum Nachweisen der Anwesenheit eines spezifischen Ziels in einem Test verwendet werden, konjugiert werden.
Bei einer speziell in Betracht kommenden Ausführungsform werden SACNs mit Nucleinsäuremolekülen konjugiert. Auf diese Weise können sie bei praktisch beliebigen, aus dem Stand der Technik bekannten Tests verwendet werden, die spezielle Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung von optisch markierten Nucleinsäuresonden nachweisen.
SACNs eignen sich insbesondere für chemische Mehrfachtests, bei denen die Identität von SACNs für die Identität des Testziels kodiert. Herkömmmliche Mehrfachtests, bei denen Fluorophore, die für die Zielidentität kodieren, verwendet werden, unterliegen einer Anzahl von schweren Beschränkungen, die sich aufgrund der physikalischen und chemischen Eigenschaften der Fluorophore ergeben. Speziell weisen verschiedene Fluorophore unterschiedliche Anregungsmaxima auf, so dass eine gleichzeitige Anregung von mehreren fluoreszierenden Markierungen nicht möglich ist. Außerdem erfolgt die Fluoreszenzemission in breiten spektralen Banden, so dass sich die Banden eines Fluorophors häufig mit denen eines anderen überlappen. Infolgedessen erfordert selbst die Auflösung von nur drei verschiedenen Fluoreszenzaktivitäten eine komplizierte Optik, um die einzelnen Emissionswellenlängen zu trennen und sodann nachzuweisen. Aufgrund dieser Probleme beruhen Mehrfachtests, bei denen Fluorophore verwendet werden, auf Positionsinformationen zur Aufklärung der Zielidentität. Häufig bedienen sich Mehrfachtests mit Fluorophoren eines festen Trägers, auf dem Liganden in definierten Positionen angeordnet sind. Die Position des Fluorophorsignals ergibt die Identität des Ziels und die Größe des Fluorophorsignals an dieser Position gibt die Menge des Ziels an. Jedoch ist die Synthese von festen Trägern mit Reagenzien, die an speziellen Positionen lokalisiert sind, teuer und zeitaufwändig. Dabei bestehen Beschränkungen bezüglich der Anzahl von Merkmalen, die auf einer einzelnen Oberfläche definiert werden können.
Im Gegensatz dazu bieten die erfindungsgemäßen SACNs eine bemerkenswerte spektrale Verschiedenartigkeit und Auftrennbarkeit. Infolgedessen können SACNs in Mehrfachtests unter Erzielung von quantitativen und qualitativen Informationen verwendet werden, ohne dass eine positionsspezifische Lokalisierung von Reagenzien erforderlich ist. Jedes mit einem zielspezifischen Reagenz gekuppelte SACN kann für die Identität dieses spezifischen Ziels kodieren und die Intensität eines bestimmten Raman-Signals ergibt die Menge dieses Ziels. Beispielsweise kann bei den vorstehend beschriebenen Sandwich-Immunoassays die Identität von Zielen, die auf dem festen Träger festgehalten werden, durch Verwendung einer unterschiedlichen Nuance von SACN für jedes Ziel bestimmt werden.
Obgleich sich SACNs in perfekter Weise zur Verwendung bei Mehrfachanwendungen eignen, müssen sie nicht auf diese Weise zur Kodierung der Identität verwendet werden. Sie können in einfacher Weise als Ersatz für Fluorophore in Mehrfachtests verwendet werden, bei denen Reagenzien an speziellen Positionen auf festen Trägern lokalisiert sind. Wenn SACNs auf diese Weise verwendet werden, ermöglichen sie einen erheblich empfindlicheren Zielnachweis als Fluorphore.
Die Fließzytometrie stellt ein Beispiel für ein Mehrfachtestformat dar, bei denen die Verschiedenartigkeit und Auftrennbarkeit von SACNs in vollem Maße ausgenützt werden kann. Bei einer Ausführungsform dieser Anwendungsmöglichkeit werden Populationen von Perlen bereitgestellt, mit denen primäre Antikörper gegen die nachzuweisenden Ziele konjugiert sind. Die Perlen werden mit der Testlösung, die die Ziele enthält, in Kontakt gebracht, sowie mit einem zweiten Satz von Antikörpern gegen die Ziele. Jeder sekundäre Antikörper ist mit einem GAN kodiert, der für die Identität des Ziels, an das er bindet, konjugiert. Die Perlen werden sodann durch ein Fließzytometer geleitet, das das Raman-Spektrum jeder Perle aufnimmt. Da das Raman-Spektrometer den gesamten Frequenzbereich jeder Perle abtasten kann, ist es sogar möglich, zahlreiche verschiedene primäre Antikörper an einer einzigen Perle zu platzieren. Das Raman-Spektrum jeder Perle kann dekodiert werden, um festzustellen, welche SACNs in welcher Menge vorliegen. Dies lässt wiederum eine Aussage zu, in welcher Menge jedes Ziel an eine einzige Perle gebunden ist. Es ist ersichtlich, dass dieses Grundschema in verschiedenartiger Weise variiert werden kann, unter Einschluss der Verwendung von Reagenzien, bei denen es sich nicht um Antikörper handelt, zur Bindung der Ziele von Interesse. Demzufolge können SACNs in einer Vielzahl von Variationen dieses Schemas verwendet werden, bei dem es notwendig oder zweckmäßig ist, ein Reagenz zu markieren.
Bei bevorzugten Ausführungsformen werden die SACNs als optische Markierungen für die Mikrovolumen-Laser-Scanning-Zytometrie (MLSC) anstelle einer Fließzytometrie verwendet. MLSC wird in der US-Patentanmeldung SN-09/378,259 (Anmeldetag 20. August 1999) und in der US- Patentanmeldung SN-09/558,094 (Anmeldetag 26. April 2000), die beide vollinhaltlich durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht werden, beschrieben. Bei einer Ausführungsform dieses Systems tastet ein Raman-Mikroskop eine Kapillare ab, die die Reagenzien enthält, die vorstehend für fließzytometrische Anwendungen beschrieben wurden. Das Raman-Mikroskop misst das Raman-Spektrum einer jeden Perle in der Kapillare, wodurch man quantitative Daten für jedes nachzuweisende Ziel erhält. Auch hier ist es das Raman-Signal jedes SACN, das für die Zielidentität kodiert. Positionsspezifische Reagenzien sind nicht erforderlich.
Bei anderen Ausführungsformen werden SACNs als optische Markierungen bei der auf feste Träger gestützten chemischen Kombinationssynthese ("combi-chem") von Bibliotheken von neuen Verbindungen verwendet. Ein derartiges Verfahren ist als "Split-and-Pool"-Synthese bekannt. Bei diesem Verfahren wird ein Präparat von in geeigneter Weise derivatisierten harzartigen Perlen willkürlich in mehrere Populationen unterteilt. Jede Population wird in ein unterschiedliches Reaktionsgemisch eingeführt. Verschiedene Reaktionsgemische können unterschiedliche Reagenzien enthalten oder sie können gleiche Reagenzien jedoch unter Anwendung unterschiedlicher Reaktionsbedingungen, enthalten. Im Anschluss an die Reaktion werden die Perlen gewaschen, rekombiniert und erneut in einen Satz von Reaktionsgemischen unterteilt. Aufgrund der willkürlichen Art und Weise, in der die Perlen verteilt werden, unterliegt jede Perle einer einzigartigen Reaktionshistorie. Das Ergebnis ist eine auf Perlen gestützte Bibliothek, die sämtliche Verbindungen, die unter Anwendung der verschiedenen Permutationen der Reaktionsgemische synthetisiert worden sind, umfassen. Die Bibliothek kann sodann zur Identifizierung von Schlüsselverbindungen mit der angestrebten Aktivität einem Screening unterworfen werden. Die Schlüsselverbindungen können wiederum analysiert werden, um ihre Zusammensetzung und Struktur zu bestimmen. Das "combi-chem"-Verfahren wurde zur Synthese von Bibliotheken von Peptiden, Benzodiazepinen und dergl. verwendet.
Wenn die Reaktionshistorie einer individuellen Perle bekannt ist, so können die chemische Zusammensetzung und die Struktur der daran gebundenen Verbindung bestimmt werden. Es gibt mehrere bekannte Wege zur Kodierung von Perlen mit ihrer Reaktionshistorie. Bei einigen Verfahren enthält jedes Reaktionsgemisch ein einzigartiges Identifizierungsmolekül, das während der Reaktionsstufe an die Perle gebunden wird. Bei Beendigung der Synthese können die Identifizierungsmoleküle von der Perle von Interesse abgespalten werden und die Reaktionshistorie der Perle kann bestimmt werden, indem man die einzelnen, von der Perle freigesetzten Identifizierungsmoleküle nachweist. Beispielsweise bedienen sich herkömmliche Verfahren kurzer Oligonucleotide zur Kodierung der Reaktionshistorie. Diese Oligomeren müssen von den Perlen abgespalten, amplifiziert und anschließend sequenziert werden, um die Reaktionshistorie zu dekodieren. Dies stellt einen zeitaufwändigen Vorgang dar. Da derartige Identifizierungsmoleküle zunächst von der Perle abgespalten werden müssen, ist es erforderlich, ein chemisches Verfahren auszuwählen, bei dem (a) die Abspaltung des Identifizierungsmoleküls von der Perle die Schlüsselverbindung nicht modifiziert oder diese von der Perle nicht abspaltet; und/oder (b) die Abspaltung der Schlüsselverbindung von der Perle das Identifizierungsmolekül weder modifiziert noch abspaltet. Außerdem können der chemische Weg, der zur Kupplung des Identifizierungsmoleküls angewendet wird, und häufig sogar die Anwesenheit der Identifizierungsmoleküle selbst auf der Oberfläche der Perlen die tatsächlichen "combi-chem"-Reaktionen stören. Derartige Überlegungen führen zu erheblichen Einschränkungen bezüglich sämtlicher Aspekte der chemischen Wege, die bei der kodierten "combi-chem"-Synthese angewandt werden.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten SACNs können zur Kodierung der Reaktionshistorie von Perlen in derartigen Kombinationsschemata verwendet werden. Jedes Reaktionsgemisch kann eine einzigartige Spezies von SACNs enthalten, so dass jede Reaktionsstufe durch das Anheften einer Anzahl von SACNs an der Perle, an der die Kombinationssynthese stattfindet, begleitet ist. Beispielsweise kann ein Reaktionsgemisch A durch SACN¹ bei Verwendung in Stufe 1 im Syntheseschema kodiert werden, und durch SACN² bei Verwendung in Stufe 2 im Syntheseschema, wobei dies fortgesetzt wird, bis SACNⁿ bei Verwendung in Stufe n im Syntheseschema. Am Ende des Syntheseschemas können die einzelnen Perlen einem Screening auf die angestrebte Aktivität der Schlüsselverbindung unterzogen werden. Perlen mit der angestrebten Aktivität der Schlüsselverbindung werden sodann durch Raman-Spektroskopie geprüft. Das Raman-Spektrum der einzelnen Perlen wird sodann automatisch dekodiert, um die individuelle Spezies von SACNs, die an den einzelnen Perlen gebunden sind, zu erfassen. Diese Information ergibt die Reaktionshistorie der Perle und somit die Struktur der Schlüsselverbindung.
Die Verwendung von SACNs zur Kodierung von "combi-chem"-Syntheseschemata stellt einen erheblichen Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik dar. Die gesamte Reaktionshistorie einer Perle kann durch Vornahme einer einzigen spektralen Messung ermittelt werden, ohne dass es erforderlich ist, dass die Perle irgendwelchen physikalischen oder chemischen Manipulationen unterzogen wird. Tatsächlich kann das Raman-Spektrum sogar in Vertiefungen von Mikrotiterplatten erhalten werden. Da die Raman-Aktivität der SACNs gemessen werden kann, ohne dass diese von der Perle abgespalten werden, ergibt sich eine erhebliche Verringerung der Einschränkungen bezüglich der Wahl der chemischen Möglichkeiten, wie sie vorstehend geschildert wurden. Gleichermaßen handelt es sich bei den einzigen chemischen Gruppierungen, die bei den SACNs an der Oberfläche der Perlen frei liegen, um die Derivatisierungsgruppen, die für die Anbringung des SACN an der Perle sorgen, und das stabile Verkapselungsmittel. Auch dadurch werden die Probleme der Störungen zwischen dem Identifizierungsmolekül und der "combi-chem"-Synthese erheblich verringert. Schließlich ermöglicht die unvergleichliche spektrale Vielfältigkeit, die durch die SACNs erreicht wird, die robuste Kodierung der "combi-chem"-Schemata, die wesentlich komplexer sind, als es bei den herkömmlichen Verfahren zulässig ist.
Beispiele
Beispiel 1
Synthese von Glas-Analyt-beladenen Nanoteilchen (GANs)
Materialien: Beim Wasser für sämtliche Präparate handelte es sich um durch ein Barnstead-Nanopure-System destilliertes Wasser mit 18,2 MΩ. Schlangenhaut-Dialyseschlauch 3500 MWCO wurde von der Firma Pierce bezogen. 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS), 3-Mercaptotrimethoxysilan (MPTMS) und 3-Mercaptopropylmethyldimethoxysilan (MPMDMS) wurden von der Firma United Chemical bezogen. HAuCl₄·3H₂O, Trinatriumcitrat-dihydrat, Natriumhydroxid, trans-1,2-Bis-(4-pyridyl)-ethylen (BPE), Pyridin, 2-Mercaptopyridin, Natriumsilicat, Tetraethylorthosilicat (TEOS) und Ammoniak wurden von der Firma Sigma-Aldrich bezogen. BPE wurde vor der Verwendung mehrmals umkristallisiert. Dowex-Kationenaustauscherharz (16–40 mesh) wurde von der Firma J. T. Baker bezogen. Reiner Ethylalkohol (EtOH) wurde von der Firma Pharmco bezogen.
Kolloidpräparat: Kolloidales 12 nm-Au (nahezu kugelförmig, mit einer Standardabweichung von weniger als 2 nm) wurde aus mit Citrat reduziertem HAuCl₄·3H₂O gemäß den Angaben von Grabar et al., Analytical Chemistry, Bd. 67 (1995), S. 735–743 (durch Verweis vollinhaltlich zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) hergestellt. Kolloid > 12 nm wurde folgendermaßen hergestellt: 3 ml 12 mM HAuCl₄ wurden jeweils zu 97 ml H₂O gegeben. Die Lösung wurde sodann unter heftigem Rühren zum Sieden erhitzt und mit 1 ml 12 nm Au-Kolloid als Impfmaterial und 0,5 ml 1% Natriumcitrat pro 100 ml HAuCl₄-Lösung versetzt und 10 Minuten auf den Siedepunkt erwärmt. Die Größe der erhaltenen Teilchen wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung von Gatan- oder NIH-Bildsoftware bestimmt. Schließlich wurden die das Au-Kolloid umgebenden Ionen durch Dialyse entfernt, wobei 7 Austauschvorgänge von jeweils mindestens vier Stunden durchgeführt wurden.
GANS-Präparat: Sämtliche Reaktionen wurden in Kunststoff-Erlenmeyer-Kolben durchgeführt. Beliebige Mengen an Kolloid konnten bei einer Präparation verwendet werden. Die anschließenden Recktanten wurden in entsprechenden Mengen, bezogen auf die Oberfläche und die Konzentration des Au-Kolloids zugegeben.
Bei einem typischen Experiment wurden 25 ml dialysiertes 0,17 nM 50 nm-Au-Kolloid verwendet. Der pH-Wert des Kolloids wurde durch Zugabe von 50 μl 0,1 M NaOH auf 5 bis 7 eingestellt. Das Kolloid wurde durch Zugabe von 125 μl 0,5 mM MPTMS (oder APTMS oder MPMDMS) vitreophil gemacht. Nach 15-minütigem Rühren mit einem Magnetrührer wurden 167 μl einer 0,5 mM Lösung der Raman-Markierung (BPE, Pyridin oder 2-Mercaptopyridin) zugegeben. Während einer weiteren 15-minütigen Rührzeit wurde eine 0,54 %-ige Lösung von aktivem Siliciumdioxid durch Vermischen von 1 g Natriumsilicat mit 50 ml 3 M NaOH und Absenken des pH-Werts auf 10 mit einem Kationenaustauscherharz hergestellt. 1 ml des aktiven Siliciumdioxids wurde zugegeben. Die erhaltene Lösung wies einen pH-Wert von etwa 9 auf. Die Lösung wurde weitere 15 min gerührt und sodann stehengelassen.
Nach 24 Stunden wurden 100 ml EtOH zu der Lösung gegeben, um das Wachstum des Siliciumdioxids gemäß dem Verfahren von Stöber et al., J. Colloid Interface Sci., Bd. 26 (1968), S. 62 (durch Verweis vollinhaltlich zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) vorzunehmen. Das Wachstum eines zusätzlichen ∼4 nm-Glasmantels wurde von der Zugabe von 15 μl TEOS und 125 μl Ammoniak begleitet. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten gerührt und sodann mindestens 12 Stunden stehen gelassen. Die Zugabe von TEOS und Ammoniak wurde fortgesetzt, bis die angestrebte Manteldicke erreicht war.
Beispiel 2
Transmissionselektronenmikroskopie von GANs
Aufnahmen mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) wurden von GANS-Präparaten aufgenommen. Diese TEM-Aufnahmen zeigen die Gleichmäßigkeit der GANs-Präparate. 1A zeigt GANs, die 35 nm Au-Kerne mit 40 nm Glas umfassen. 1B zeigt 60 nm-Au-Kerne mit 16 nm Glas. 2 zeigt GANs mit 35 nm Au und 8 nm Glas nach Zentrifugation durch eine 50%-ige Glycerinlösung.
Beispiel 3
Nachweis der Sequestrierung des Metallkerns aus dem Lösungsmittel
Damit GANs in verschiedenen chemischen Umgebungen ihre Funktion erfüllen, ist es nötig, dass der Raman-aktive Analyt aus dem umgebenden Lösungsmittel sequestriert wird. Um diese Sequestrierung nachzuweisen, kann man die Diffusionsgeschwindigkeiten durch das Glasnetzwerk betrachten. Dies wird durchgeführt, indem man die Geschwindigkeit überwacht, mit der Königswasser (3 HCl:1 HNO₃) den Au-Kern eines GAN herausätzen kann. 3 zeigt ein derartiges Experiment für einen Ansatz von GANs-Teilchen mit einem 35 nm-Au-Kern und einem 8 nm-Mantel aus Glas. Zu 500 μl von ≈0,17 nM GANS wurden 200 μl einer Ätzlösung (50 μl HNO₃ und 150 μl HCl) gegeben. Die Absorption der Lösung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe der Ätzlösung gemessen (λ_max 546 nm). Das Ätzen des Goldkerns führt zu einer Verringerung der Absorption. Dies ist in 3A aufgetragen (der Zeitpunkt nach Zugabe der Ätzlösung ist angegeben). Die Geschwindigkeit der Au-Ätzung ist in 3B als ein Diagramm der Absorption gegen die Zeit in der Ätzlösung (rechte Seite) angegeben. Weitere Studien, die von den Erfindern durchgeführt wurden, zeigten, dass das Ätzen eines Au-Kerns durch Königswasser bei einem Glasmantel von 20 nm innerhalb einer Zeitspanne von 4 Stunden nicht stattfindet.
Beispiel 4
SERS-Spektren von GANs-Teilchen
GANs mit einem 40 nm-Au-Kern, der mit trans-4,4'-Bis-(pyridyl)-ethylen (BPE) beschichtet ist und in 4 nm Glas eingekapselt ist, wurden hergestellt und durch Raman-Spektroskopie geprüft. Das Raman-Spektrum, das bei einer 20 mW-Anregung bei 632,8 nm mit einer 3 mm-Linse und einer Integration von 30 Sekunden erhalten wurde, ist in 4 dargestellt. Die Bahn A des Diagramms zeigt das charakteristische BPE-Raman-Signal. Die Bahn B zeigt das Raman-Signal der gleichen Teilchen ohne den BPE- Analyten. Es ist ersichtlich, dass die GANS ohne den BPE-Analyten im wesentlichen kein Raman-Signal ergeben.
Beispiel 5
Einschluss des Raman-aktiven Analyten am Metallkern von GANs durch Verkapselung mit Glas
5 zeigt das Raman-Spektrum einer Suspension von GANs mit einem Gehalt an 40 nm Au, das mit trans-4,4'-Bis-(pyridyl)-ethylen (BPE)/4 nm Glas beschichtet ist (Bahn A); das Spektrum des Überstands einer ersten Zentrifugation der GANs (Bahn B); und das Spektrum eines Überstands einer zweiten Zentrifugation der GANs (Bahn C). Es ist ersichtlich, dass das BPE-Signal das GAN während der einzelnen Zentrifugationsstufen nicht verlässt, was einen Hinweis dafür darstellt, dass das BPE am Au-Kern haftet und durch die Verkapselung mit Glas fest eingefangen wird.
Beispiel 6
Vergleich der SERS-Spektren von Raman-aktiven Analyten an GANs mit anderen SERS-Substraten
GANs (80 nm AU-Kern/20 nm Glas) mit einem Gehalt an 2-Mercaptopyridin als Raman-aktiver Analyt wurden durch Raman-Spektroskopie unter Anwendung einer 25 mW 632,8 nm-Anregung mit einer 3 mm-Linse bei einer Integration von 60 Sekunden analysiert. Das Raman-Spektrum des GAN-Präparats wurde sodann mit dem Raman-Spektrum verglichen, das erhalten wurde, wenn eine 50 mM Lösung von 2-Mercaptopyridin an einem herkömmlichen 3-lagigen SERS-Substrat absorbiert wurde (25 mW 632,8 nm-Anregung, 3 mm-Linse, Integration 30 Sekunden). 6 zeigt die beiden Raman-Spektren. Es ist ersichtlich, dass die beiden Spektren identische Merkmale und Intensitäten aufweisen, was zeigt, dass die GANs wirksame SERS-Substrate darstellen.
Beispiel 7
SERS-Spektren von GANs mit Gemischen von Raman-aktiven Analyten
SERS-Spektren der folgenden vier Arten von GANs-Teilchen wurden unter Verwendung einer 26 mW 632,8 nm-Anregung, einer 3 mm-Linse und einer Integration von 30 Sekunden erhalten: (A) GANs, markiert mit Furonitril; (B) GANs markiert mit Furonitril (66%) und Cyanoessigsäure (33%); (B) GANs, markiert mit Furonitril (33%) und Cyanoessigsäure (66%) und (D) GANs, markiert mit Cyanoessigsäure. Die angegebenen prozentualen Anteile stellen die relativen Konzentrationen der einzelnen Verbindungen in der zugegebenen Markierungslösung dar. 7 zeigt, dass das Furonitril und die Cyanoessigsäure relativ die gleiche Signalintensität und ähnliche spektrale Profile aufweisen. Die Tatsache, dass die Spektren von B und C sehr ähnlich mit dem Spektrum D sind, zeigt, dass Cyanoessigsäure eine bessere Affinität für das Au-Nanoteilchen als Furonitril aufweist.
Beispiel 8
SERS-Spektren von mit Imidazol (IM) und trans-4,4'-Bis-(pyridyl)-ethylen (BPE) markierten GANS
GANs (40 nm Au-Kern/4 nm Glas) wurden entweder mit (a) trans-4,4'-Bis-(pyridyl)-ethylen (BPE-GANs) oder mit (b) Imidazol (IM-GANs) markiert. Die SERS-Spektren dieser Raman-aktiven Analyten sind in 8 zusammen mit dem SERS-Spektrum von unmarkierten GANs (c) der gleichen Abmessungen dargestellt. BPE-GANs und IM-GANs zeigen beide die charakteristischen Raman-Banden ihrer jeweiligen Raman-aktiven Analyten. Unmarkierte GANs zeigen diese Banden nicht.

Claims

Teilchen, umfassend ein Metallnanoteilchen in Verbindung mit einem bei der oberflächenverstärkten Spektroskopie (surface enhanced spectroscopy, SES) aktiven Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass das Metallnanoteilchen aus einem Metall besteht, das aus der Gruppe Au, Ag und Cu ausgewählt ist, und dass das Metallnanoteilchen und das damit assoziierte SES-aktive Molekül von einem Verkapselungsmittel umgeben sind, bei dem es sich um Glas handelt.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Metallnanoteilchen aus Au besteht.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Metallnanoteilchen aus Ag besteht.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Metallnanoteilchen einen Durchmesser von weniger als 200 nm aufweist.
Teilchen nach Anspruch 4, wobei das Metallnanoteilchen einen Durchmesser zwischen 20 nm und 200 nm aufweist.
Teilchen nach Anspruch 4, wobei das Metallnanoteilchen einen Durchmesser von 40–100 nm aufweist.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Metallnanoteilchen eine Kugel ist.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Metallnanoteilchen ein abgeflachtes späroid ist.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Metallnanoteilchen ein gestrecktes sphäroid ist.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Verkapselungsmittel eine Dicke von weniger als 1 μm aufweist.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Verkapselungsmittel eine Dicke von 1 bis 40 nm aufweist.
Teilchen nach Anspruch 6, wobei das Verkapselungsmittel eine Dicke von 3–10 nm aufweist.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das SES-aktive Molekül eine unvollständige Monolager-Beschichtung auf dem Metallnanoteilchen bildet.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das SES-aktive Molekül eine Monolager-Beschichtung auf dem Metallnanoteilchen bildet.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das SES-aktive Molekül eine Multilager-Beschichtung auf dem Metallnanoteilchen bildet.
Teilchen nach Anspruch 1, wobei das oder die Verfahren zum Nachweisen, Identifizieren oder zur quantitativen Bestimmung für das (SES)-aktive Molekül aus der Gruppe SERS, SERRS, SEHRS, SEHRRS oder SEIRA ausgewählt sind.
Verfahren zur optischen Markierung eines Moleküls, einer Zelle, eines Kügelchens oder eines festen Trägers, umfassend das Anheften eines Teilchens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 an das Molekül, die Zelle, das Kügelchen oder den festen Träger.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich beim Molekül um ein Biomolekül handelt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich beim Biomolekül um eine Nucleinsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich beim Biomolekül um ein Protein handelt.
Verwendung eines Teilchens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur optischen Markierung eines Moleküls einer Zelle, eines Kügelchens oder eines festen Trägers.
Verwendung eines Teilchens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 als optische Markierung in einem Sandwich-Immunoassay.
Verwendung eines Teilchens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 als optische Markierung für einen chemischen Multiplextest.
Verwendung eines Teilchens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 als optische Markierung für die Mikrovolumen-Laser-Scanning-Zytometrie.
Verwendung eines Teilchens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 als optische Markierung bei der auf einer festen Phase basierenden chemischen Kombinationssynthese von Bibliotheken neuer Verbindungen.