JP4068677B2 - 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット - Google Patents
遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP4068677B2 JP4068677B2 JP28415396A JP28415396A JP4068677B2 JP 4068677 B2 JP4068677 B2 JP 4068677B2 JP 28415396 A JP28415396 A JP 28415396A JP 28415396 A JP28415396 A JP 28415396A JP 4068677 B2 JP4068677 B2 JP 4068677B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- sample
- dna
- active substance
- analyzed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子、すなわちデオキシリボ核酸(以下「DNA」という)およびリボ核酸(以下「RNA」という)の分析方法に関し、詳しくは、表面増強ラマン散乱(以下「SERS」という)測定により短時間で簡単に遺伝子の分析を行うことが可能な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
近年の遺伝子工学に関する技術の革新は目覚ましく、特に、ポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)法の開発により、目的とするDNAの大量複製が可能となった。
【0003】
PCR法は、DNAポリメラーゼがプライマーなしでは働かないという原理に基づくものであり、試料中のDNAを熱で変性させて一本鎖とし、ついで温度を下げてプライマーを結合させ、この状態で耐熱性DNAポリメラーゼによりDNA合成するという、一連のサイクルを繰り返すことにより、DNAを大量に増幅させるものである。したがって、特定のプライマーを予め化学合成等により準備して用いれば、目的とするDNAを大量に調製することができる。ここで、目的とするDNAが調製されたか否かの判断は、従来、PCRを行った試料を電気泳動にかけて目的とするDNAのバンドの確認により行われることが一般的であった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、電気泳動による分析は、その操作に時間がかかり、かつ煩雑であるという問題があった。すなわち、電気泳動の担体となるゲルを予め調製する作業があり、PCRを行った試料を、DNAの大きさにより予め選択する必要がある。また、電気泳動法は、通常、約75分の長時間を必要とし、迅速性に欠ける。そして、遺伝子を迅速かつ簡単に検出し測定することは、PCR法のみならず、DNA等の遺伝子を分析する分野に共通する課題となっている。
【0005】
そこで、本発明は、前記従来の問題を解決し、迅速かつ簡単な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キットの提供をその目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前記試料に、前記遺伝子結合性ラマン活性物質および前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給し、遺伝子に結合しなかった前記遺伝子結合性ラマン活性物質を前記表面増強ラマン散乱生起基質により捕捉し、この状態で前記遺伝子結合性ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定するという構成をとる。
【0007】
このように、本発明は、遺伝子結合性ラマン活性物質が発生するSERS光を測定することにより、迅速かつ簡単な遺伝子の分析を可能にするものである。
ラマン活性物質の中には、DNA等の遺伝子に特異的に結合するものがある。この遺伝子結合性ラマン活性物質を、分析対象試料に添加すると、前記試料中に遺伝子が存在すれば、これに前記ラマン活性物質が結合することになる。そして、この試料にSERS生起基質を添加すれば、遺伝子と結合していない前記ラマン活性物質のみが、前記SERS生起基質に捕捉されることとなる。この状態で、前記ラマン活性物質に励起光を照射すれば、前記SERS生起基質に捕捉された前記ラマン活性物質だけがSERS光を発し、遺伝子に結合した前記ラマン活性物質は、SERS光を生じない。したがって、分析対象試料中の遺伝子量に反比例したSERS光が検出でき、これにより前記試料中の遺伝子の検出およびその量を測定することができる。
【0008】
なお、本発明の遺伝子の分析方法において、前記試料に対する前記遺伝子結合性ラマン活性物質および表面増強ラマン散乱生起基質の供給順序は特に限定するものではなく、前記両者を同時に供給してもよく、若しくは前記遺伝子結合性ラマン活性物質を供給した後、前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給してもよい。
【0009】
そして、この分析方法では、前記ラマン活性物質および前記SERS生起基質の添加、励起光の照射およびSERS光の測定という単純な操作により構成されているため、簡単な分析方法となっている。また、遺伝子への前記ラマン活性物質の結合および前記SERS生起基質による前記ラマン活性物質の捕捉は、極めて短時間で起り、またSERS光の測定も、約1〜2秒の極めて短い時間で行うことができるため、本発明の遺伝子の分析方法は、分析操作全体を短時間に行うことができる。
【0010】
なお、本発明において、「ラマン活性」とは、励起光を照射すればラマン散乱若しくはSERSが生じることをいい、「遺伝子結合性ラマン活性物質」とは前記ラマン活性を有する物質のなかで、遺伝子に結合する性質を有するものをいう。また、「表面増強ラマン散乱生起基質」とは、その表面に物質を捕捉してラマン散乱を増強させる性質を有する物質をいう。前記捕捉の手段としては、例えば、吸着現象を利用する方法や、電位をかけて電気的に吸着させる方法、ラマン活性物質と反応結合する官能基を備えたSERS生起基質に反応させる方法がある。
【0011】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子としては、例えば、一本鎖DNA、二本鎖DNA、RNA、RNAとDNAの複合体がある。
そして、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料として、PCR法によりDNAの増幅操作を行った試料(PCR産物)またはDNA試料を用いる場合に有効な分析方法となる。先に述べたように、PCR法は目的とするDNAを増幅する方法であるが、試料中に目的とするDNAがない場合にはPCR産物中のDNA量は微量なものとなる。したがって、PCR産物を分析対象試料として本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、SERS光を測定することにより、短時間で簡単に目的DNAが増幅されたか否かが確認できる。また、予め検量線を作成しておけば、増幅されたDNA量を測定することもできる。
【0012】
この他に、ストランド ディスプレースメント アンプリフィケーション法(Strand displacement amplification、SDA法)によりDNAの増幅操作を行った試料、リガーゼチェーンリアクション(LCR)法によりDNAの増幅操作を行った試料、Qβレプリカーゼを用いたRNAの増幅方法(Qβ法)によりRNAの増幅操作を行った試料にも、本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、PCR法の場合と同様に、好結果を得ることができる。
【0013】
なお、前記SDA法としては、Nucleic Acids Research,Vol.20.No.7 1691−1696に記載の方法があげられる。
【0014】
また、前記LCR法とは、94℃でも熱変性しない耐熱性DNAリガーゼを使用することに特徴を有するDNA増幅法であり、この方法は、ミスマッチをもたない正常人のDNA試料の場合には用いた2種類のオリゴヌクレオチドがDNAリガーゼによって接続され、つぎの反応サイクルの基質となって次々と増幅されるのに対し、ミスマッチをもつ場合は接続されないためそこで反応が止まってしまうという原理に基づく。
【0015】
また、前記Qβ法は、RNAレプリカーゼの一種で基質となるRNAと特異性が高いQβレプリカーゼを用いてRNAを増幅する方法である。具体的には、まず、T7 RNAポリメラーゼのプロモーターの下流にMDV−1・RNA(DNA化したもの)をつないだプラスミドベクターを据え、増幅したいDNA断片をMDV−1の間に挿入する(20〜800bp程度が挿入可能)。つぎに、制限酵素で切断してからT7 RNAポリメラーゼを働かせ、これをRNA化する。挿入断片を含んだMDV−1・RNAは、以後のQβレプリカーゼによる複製サイクルを繰り返すことにより増幅させることができる。
【0016】
さらに、本発明の遺伝子の分析方法の適用範囲はこれらの試料に限定されず、3SR法、NASBA法、CPR法、SIR法等によりDNAあるいはRNAの増幅操作を行った試料についてもPCR法と同様に適用することができる。なお、NASBA法はRNAの増幅方法であり、その他の方法はDNAの増幅方法である。
【0017】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子が二本鎖DNA(前記二本鎖DNA増幅試料を含む)である場合、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例えば、下記の式(化1)で表される4´,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)、エチジウムブロマイド(EtBr)、チアゾールオレンジ、下記の式(化2)で表されるビスベンゾイミド(ヘキスト33258、ヘキスト社製)およびアクリジンオレンジがあげられる。この他に、SYBRGreen I(商品名、モレキュラープローブス社製)があげられる、このなかでも、DAPIが好ましい。これは、DAPIが二本鎖DNAとより選択的に複合体を形成し、他の物質、例えばRNAには結合しにくいという性質を持ち、このため、RNA等の他の物質が混在する試料であっても、二本鎖DNAを選択的に検出できるからである。
【0018】
【化1】
【0019】
【化2】
【0020】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子がRNAの場合(前記RNA増幅試料を含む)、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例えば、EtBr、チアゾールオレンジ、前記式(化2)で表されるビスベンゾイミド(ヘキスト33258、ヘキスト社製)、アクリジンオレンジがあげられる。この他に、SYBR Green II (商品名、モレキュラープローブス社製)もあげられる。このなかで、SYBR Green II が、よりRNAと選択的に複合体を形成する。
【0021】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象の遺伝子が一本鎖DNAの場合、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、前記SYBR Green II があげられる。
【0022】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象の遺伝子がRNAとDNAの複合体の場合、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例えば、先に述べた、DNA結合性ラマン活性物質、RNA結合性ラマン活性物質を使用できる。
【0023】
本発明の遺伝子の分析方法において、SERS生起基質としては、例えば、銀コロイド、金コロイド、銅コロイド、電極、金属板があげられ、このなかでも、作製が簡単で取扱いが容易であることから、銀コロイド、金コロイド等の金属コロイドが好ましい。
【0024】
そして、本発明の遺伝子分析用キットは、遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬R1と、SERS生起基質を含有する試薬R2とを備える。このキットを用いれば、本発明の遺伝子の分析が、さらに迅速かつ簡単に実施できるようになる。
【0025】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明の遺伝子の分析方法の実施の形態について説明する。
【0026】
図7に、本発明を、PCRを行った試料に適用した例を示す。この図では、右側にターゲットDNAが存在しない試料についてPCRを行った例を、左側にターゲットDNAを含む試料についてPCRを行った例をそれぞれ示す。
【0027】
まず、同図(a)に示すように、DNA試料を準備する。この試料には、DNAの他に、2つのプライマー1、2と、DNAポリメラーゼ(図示せず)およびデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート(dNTP、図示せず)が添加されている。そして、この試料を加熱すると、DNAが熱変性して一本鎖DNAに解離する。そして、試料を冷却すると、ターゲットDNAにはプライマー1、2が相補的に結合するが、ターゲットDNA以外には結合しない。そして、DNAポリメラーゼの作用により、同図(b)に示すように、ターゲットDNAでは伸長反応が起るが、ターゲットDNA以外では、プライマーが結合していないため、伸長反応は起らない。そして、前記の一連の操作を約20〜30回繰り返すと同図(b)に示すように、ターゲットDNAは大量に増幅されるが、ターゲットDNAを含まない系では全く増幅されない。
【0028】
そして、同図(c)に示すように、試料に遺伝子結合性ラマン活性物質(SERS活性物質)を加えると、2本鎖DNA中にインターカレートされて結合する。したがって、図示のように、ターゲットDNAの試料では、二本鎖DNAが多数存在し、これに前記ラマン活性物質がほぼ全部結合する。これに対し、ターゲットDNAを含まない試料では、二本鎖DNAがほとんど存在しないため、前記ラマン活性物質の大部分は、試料中において遊離状態で存在している。そして、同図(d)に示すように、SERS生起基質の一つである銀コロイドを試料に添加する。すると、図示のように、ターゲットDNA試料では、前記ラマン活性物質がDNAに結合しているため、前記銀コロイドに捕捉されるものがなく、あってもわずかであり無視できる。これに対し、ターゲットDNAを含まない試料では、ほとんどの前記ラマン活性物質が遊離状態で存在し、これが前記銀コロイドに捕捉される。
【0029】
そして、この状態で、前記ラマン活性物質に励起光を照射すると、ターゲットDNA試料では、SERS光が微弱あるいは観測されず、一方、ターゲットDNAを含まない試料では、強いSERS光が観測される。
【0030】
換言すると、強いSERS光が観測された試料中には、ターゲットDNAが存在しないと判断でき、SERS光が微弱あるいは観測されない試料中には、ターゲットDNAが存在すると判断できる。
【0031】
このように、本発明によれば、従来の電気泳動法のように、泳動ゲルや緩衝液の調製等の繁雑な操作を必要とせず、短時間で遺伝子の分析を行うことができる。
【0032】
なお、前記励起光の照射およびSERS光の測定は、一般的なラマン散乱測定装置を用いて行うことができる。また、測定条件は、用いるラマン活性物質およびその添加量並びに遺伝子の濃度等により適宜決定されるが、アルゴンイオンレーザーの強度は、通常、5mW〜100mWである。また、SERS生起基質は、ラマン活性物質よりも過剰であることが好ましい。
【0033】
そして、本発明の遺伝子の分析方法では、遺伝子と前記ラマン活性物質との重量比について予め検討をおこない、目的とする遺伝子が存在する場合のSERS光強度と存在しない場合の強度とが明確に区別できるようにすることが好ましい。前記重量比は、分析対象となる遺伝子および前記ラマン活性物質の種類等により適宜決定されるものである。例えば、分析対象の遺伝子が二本鎖DNAであり前記ラマン活性物質がDAPIである場合、その重量比は、通常、DNA/DAPI=0.1〜0.5である。
【0034】
つぎに、本発明の遺伝子分析用キットは、遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬R1およびSERS生起基質を含有する試薬R2を備える。
【0035】
前記試薬R1は、前記ラマン活性物質の他に、他の成分を含有してもよい。また、前記試薬R2も、前記SERS生起基質の他に、例えば、ポリリン酸、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン(PVP)、界面活性剤等の安定化剤を含有してもよい。
【0036】
本発明の遺伝子分析用キットの使用方法は、前述の方法と同様である。このキットを用いれば、予め必要な成分が適量配合されているため、従来のように分析の度に試薬を調製する必要がなくなり、さらに迅速かつ簡単な遺伝子の分析が可能となる。
【0037】
なお、以上の説明において、PCRにより増幅された二本鎖DNAを分析対象遺伝子とした例をとりあげたが、本発明はこれに限定するものではなく、この他、SDA法により増幅された二本鎖DNA、LCR法により増幅された二本鎖DNA、RNA、Qβ法により増幅されたRNA、一本鎖DNA、RNAとDNAの複合体にも適用が可能である。これらの遺伝子を分析する場合も、分析対象の遺伝子に合わせて遺伝子結合性ラマン活性物質を適宜選択して使用する他は、前述と同様の操作を行えばよく、これにより迅速かつ簡単なRNA等の遺伝子の分析ができる。
【0038】
【実施例】
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
【0039】
(実施例1)
まず、以下に示す成分を精製水に溶解してPCRバッファーを調製した。
【0040】
(PCRバッファー組成)
Tris−HCl(pH8.3) 100mM
KCl 500mM
MgCl2 15mM
【0041】
そして、このPCRバッファー10μlに下記に示す成分を添加して、PCR反応液を調製した。なお、下記のプライマー1、2は、下記のλDNAに対し相補的配列を持つものである。
【0042】
【0043】
そして、このPCR反応液を用い、以下のサイクルでPCRを行った。
【0044】
(PCRサイクル)
ステップa(94℃10分):1サイクル
ステップb(94℃1分)→ステップc(68℃4分):30サイクル
ステップd(68℃7分):1サイクル
【0045】
つぎに、DNA精製を行った。すなわち、まず、得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動(150mA,2時間)にかけ、目的のDNA画分を分離した。そして、目的とするDNAのバンドがあるゲル部分を切り出した。切り出したゲルを、TBEバッファーとともに透析チューブに入れてチューブの両端をシーラーで閉じた。この透析チューブを、その長軸が電場の方向と直角方向になるように電気泳動槽内に設置し、槽内をTBEバッファーで満たし、通電した(150mA、3時間)。通電終了後、透析チューブ内のTBEバッファーを回収し、これを遠心管に移し、エタノール沈殿を行った。そして得られた沈殿を蒸留水に溶解し、これを精製DNA試料とした。
【0046】
つぎに、得られた精製DNA試料25μlにDAPI水溶液(濃度:10-4mol/l)15μlを加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液(濃度:0.17mg/ml)360μlを加えて、測定試料を調製した。そして、この測定試料について、アルゴンイオンレーザー(レーザー強度:50mW)を用い、励起波長514.5nm、露光時間5秒の条件でSERS光の測定を行った。その結果を、図1のグラフの曲線(a)に示す。
【0047】
なお、図1において、グラフの縦軸のSERS強度は、SERS光の強度を示し、横軸の波数は、SERS光の波数を示す。図2、図3、図4および図6のグラフも同様である。
【0048】
(比較例1)
DNAに代えて、蒸留水1μlを用いた他は、実施例1と同様にしてPCRを行い、実施例1と同様にして、SERS光の測定を行った。その結果を、図1のグラフの曲線(b)に示す。
【0049】
(対照1,2)
前記混合液に代えて、DAPI水溶液(濃度:10-5mol/l)40μlを用いた例を対照1とし、また二本鎖DNA水溶液40μlのみを用いた例を対照2とした。これら対照1、2のその他の条件および操作は、前記実施例と同様である。前記対照1の結果を図3のグラフに、前記対照2の結果を図4のグラフに示す。
【0050】
以上の実施例1、比較例1、対照1、2からつぎのことがいえる。まず、図1のグラフの曲線(a)に示すように、PCRによりDNAが増幅された実施例1では、ほぼ全部のDAPIがDNAにインターカレートされて極微量のDAPIしか銀コロイドに捕捉されないため、SERS光が弱かった。これに対し、同図のグラフの曲線(b)に示すように、PCRによりDNAが増幅されなかった比較例1では、ほぼ全部のDAPIが銀コロイドに捕捉されて、強いSERS光が測定できた。なお、この比較例1のSERS光のピークは、図3のグラフに示す対照1のピークと一致した。また、図4のグラフに示すように、DNAのみの場合(対照2)では、SERS光が測定できなかった。これらの結果から、本発明の遺伝子の分析方法により、PCR法によりDNAが複製されたか否かが、迅速かつ簡単に判別できるといえる。
【0051】
(実施例2)
実施例1と同様にしてPCRを行い、得られたPCR産物についてDNA精製を行った。そして、得られた精製DNA試料35μlにDAPI水溶液(濃度:10-4mol/l)5μlを加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液(濃度:0.17mg/ml)360μlを加えて、測定試料を調製した。そして、この測定試料について、アルゴンイオンレーザー(レーザー強度:50mW)を用い、励起波長514.5nm、露光時間5秒の条件でSERS光の測定を行った。その結果を、図2のグラフの曲線(a)に示す。
【0052】
(比較例2)
DNAに代えて、蒸留水1μlを用いた他は、実施例2と同様にしてPCRおよびDNA精製を行い、ついで実施例2と同様にしてSERS光の測定を行った。その結果を、図2のグラフの曲線(b)に示す。
【0053】
以上の実施例2および比較例2の結果からつぎのことがいえる。まず、図2のグラフの曲線(a)に示すように、PCRによりDNAが増幅された実施例2では、DAPIがDNAにほぼ完全にインターカレートされて銀コロイドに捕捉されないため、SERS光が検出できなかった。これに対し、同図のグラフの曲線(b)に示すように、PCRによりDNAが増幅されなかった比較例2では、ほぼ全部のDAPIが銀コロイドに捕捉されて、強いSERS光が測定できた。
【0054】
(実施例3)
混合液として、種々濃度のDNA水溶液25μlにDAPI水溶液15μlを加えて混合したものを用いた他は、実施例1と同様にしてSERS光の測定を行った。その結果を図5のグラフに示す。なお、この図において、縦軸のSERS強度はSERS光の強度であり、横軸はDNA濃度である。
【0055】
図5のグラフに示すように、DNAの濃度が増加するにしたがいSERS光の強度が直線的に低下した。このグラフは、検量線として使用できるため、これを用いれば、例えば、PCR法において目的DNAの増幅の判別のみならず、PCR産物中のDNA濃度も測定することが可能となる。
【0056】
(実施例4、比較例2)
実施例4では、DNAの精製を行わないPCR産物についてSERS光の測定を行った他は、実施例1と同じ条件で同じ操作を行った。その結果を、図6のグラフの曲線(a)に示す。
【0057】
他方、比較例2では、DNAの精製を行わないPCR産物についてSERS光の測定を行った他は、比較例1と同じ条件で同じ操作を行った。その結果を、図6のグラフの曲線(b)に示す。
【0058】
図6のグラフに示すように、DNAが大量に存在する実施例4のSERS光とDNAがほとんど存在しない比較例2のSERS光とを明確に区別することができる。このことから、本発明の遺伝子の分析方法によれば、DNA精製を行わないPCR産物であっても、遺伝子(DNA)の分析が可能であるといえる。
【0059】
【発明の効果】
以上のように、本発明の遺伝子の分析方法は、電気泳動法等による従来の遺伝子の検出方法と比べて、迅速かつ簡単に遺伝子の分析を行うことができる。このため、本発明の分析方法を、例えば、PCR法に適用すれば、目的とするDNAの増幅を短時間で簡単に確認することができ、つぎの段階の実験への移行を判断することができる。また、本発明の分析方法は、精製を行わないPCR産物のように、他の物質が混在している試料であっても、遺伝子の分析が可能である。そして、本発明の分析方法は、その操作が単純であるため、分析を自動化することが可能であり、これによりさらに迅速かつ簡単に遺伝子の分析ができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施例のSERS光のグラフである。
【図2】本発明のその他の実施例のSERS光のグラフである。
【図3】DAPIのみのSERS光のグラフである。
【図4】DNAのみのSERS光のグラフである。
【図5】本発明のさらにその他の実施例におけるSERS光とDNA濃度の関係を示すグラフである。
【図6】本発明のさらにその他の実施例のSERS光のグラフである。
【図7】図(a)〜(b)は、本発明の遺伝子の分析方法をPCRに適用した場合の実施例の一連の操作を示す説明図である。
Claims (4)
- 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活性物質と、銀コロイド、金コロイド、銅コロイド、電極および金属板からなる群から選択される少なくとも一つの基質である表面増強ラマン散乱生起基質とを準備すること、前記試料に前記遺伝子結合性ラマン活性物質および前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給し、遺伝子に結合しなかった前記遺伝子結合性ラマン活性物質を前記表面増強ラマン散乱生起基質で捕捉すること、およびこの状態で前記遺伝子結合性ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定することにより、前記分析対象試料中の分析対象となる遺伝子を検出または遺伝子の量を測定することを含む遺伝子の分析方法であって、
前記分析対象となる遺伝子が二本鎖デオキシリボ核酸(DNA)である場合は、前記遺伝子結合性ラマン活性物質が、4´,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、エチジウムブロマイド、およびビスベンゾイミドからなる群から選択される少なくとも一つの物質であり、
前記分析対象となる遺伝子がリボ核酸(RNA)である場合は、前記遺伝子結合性ラマン活性物質が、エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジ、およびビスベンゾイミドからなる群から選択される少なくとも一つの物質であり、
前記分析対象となる遺伝子が、RNAとDNAの複合体である場合は、前記遺伝子結合性ラマン活性物質が、エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジ、およびビスベンゾイミドからなる群から選択される少なくとも一つの物質である、遺伝子の分析方法。 - 前記分析対象試料が、ポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)法によりDNAの増幅操作を行った試料、ストランド ディスプレースメントアンプリフィケーション法(SDA法)によりDNAの増幅操作を行った試料およびリガーゼチェーンリアクション(LCR)法によりDNAの増幅操作を行った試料からなる群から選択される少なくとも一つの試料である請求項1記載の遺伝子の分析方法。
- 前記分析対象試料が、Qβレプリカーゼを用いたRNAの増幅方法(Qβ法)によりRNAの増幅操作を行った試料である請求項1記載の遺伝子の分析方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の遺伝子の分析方法に用いるキットであって、前記遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬R1と、前記表面増強ラマン散乱生起基質を含有する試薬R2とを備える遺伝子分析用キット。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28415396A JP4068677B2 (ja) | 1996-10-25 | 1996-10-25 | 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット |
US08/955,251 US6043034A (en) | 1996-10-25 | 1997-10-21 | Method for measuring the concentration of polynucleotides |
EP97308491A EP0838528A1 (en) | 1996-10-25 | 1997-10-24 | Method for measuring the concentration of polynucleotides |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28415396A JP4068677B2 (ja) | 1996-10-25 | 1996-10-25 | 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10117797A JPH10117797A (ja) | 1998-05-12 |
JP4068677B2 true JP4068677B2 (ja) | 2008-03-26 |
Family
ID=17674870
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP28415396A Expired - Fee Related JP4068677B2 (ja) | 1996-10-25 | 1996-10-25 | 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6043034A (ja) |
EP (1) | EP0838528A1 (ja) |
JP (1) | JP4068677B2 (ja) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1068360B1 (de) * | 1998-04-01 | 2003-07-16 | ATTO-TEC GmbH | Verfahren und vorrichtung zur quantifizierung von dna und rna |
GB9810865D0 (en) | 1998-05-20 | 1998-07-22 | Zeneca Ltd | Nucleic acid sequence identification |
ES2296648T3 (es) * | 1999-10-06 | 2008-05-01 | Oxonica Inc. | Nanoparticulas compuestas espectroscopicamente activas superficialmente potenciadas. |
US7192703B2 (en) * | 2003-02-14 | 2007-03-20 | Intel Corporation, Inc. | Biomolecule analysis by rolling circle amplification and SERS detection |
US20040191778A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-09-30 | Seiji Inaoka | Colloidal silver-biomolecule complexes |
US20050147976A1 (en) * | 2003-12-29 | 2005-07-07 | Xing Su | Methods for determining nucleotide sequence information |
US20050221507A1 (en) * | 2004-03-30 | 2005-10-06 | Intel Corporation | Method to detect molecular binding by surface-enhanced Raman spectroscopy |
US7502106B2 (en) * | 2006-09-21 | 2009-03-10 | Honeywell International Inc. | SERS analyzer |
US7727776B2 (en) * | 2006-10-24 | 2010-06-01 | Honeywell International Inc. | Core-shell nanoparticles for detection based on SERS |
CN108444545A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于醛基芯片和银纳米颗粒检测银离子含量的环境网络 |
CN108519128A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-09-11 | 天津大学 | 基于基因芯片和金纳米颗粒检测汞离子含量的环境网络 |
CN108444548A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于金纳米颗粒检测汞离子含量的环境网络 |
CN108507623A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-09-07 | 天津大学 | 基于金纳米颗粒检测银离子含量的环境网络 |
CN108444547A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于基因芯片和银纳米颗粒检测汞离子含量的环境网络 |
CN108444544A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于银纳米颗粒检测汞离子含量的环境网络 |
CN108444541A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于醛基芯片和金纳米颗粒检测银离子含量的环境网络 |
CN108444542A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于金银纳米颗粒检测银离子含量的环境网络 |
CN108507624A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-09-07 | 天津大学 | 基于基因芯片和金纳米颗粒检测银离子含量的环境网络 |
CN108444538A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于醛基芯片和金纳米颗粒检测汞离子含量的环境网络 |
CN108444539A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于银纳米颗粒检测银离子含量的环境网络 |
CN108444546A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于基因芯片和银纳米颗粒检测银离子含量的环境网络 |
CN108444540A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于醛基芯片和银纳米颗粒检测汞离子含量的环境网络 |
CN108444543A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-08-24 | 天津大学 | 基于金银纳米颗粒检测汞离子含量的环境网络 |
US11774366B2 (en) | 2019-11-20 | 2023-10-03 | Seagate Technology Llc | Sequencing nucleic acids via surface enhanced Raman spectroscopy |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8331514D0 (en) * | 1983-11-25 | 1984-01-04 | Janssen Pharmaceutica Nv | Visualization method |
US4781458A (en) * | 1987-11-30 | 1988-11-01 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Fiber optic apparatus for detecting molecular species by surface enhanced Raman spectroscopy |
WO1990002205A1 (en) * | 1988-08-25 | 1990-03-08 | Angenics, Inc. | Detection of nucleic acid sequences using particle agglutination |
US5376556A (en) * | 1989-10-27 | 1994-12-27 | Abbott Laboratories | Surface-enhanced Raman spectroscopy immunoassay |
US5266498A (en) * | 1989-10-27 | 1993-11-30 | Abbott Laboratories | Ligand binding assay for an analyte using surface-enhanced scattering (SERS) signal |
DE69110032T2 (de) * | 1991-06-08 | 1995-12-21 | Hewlett Packard Gmbh | Verfahren und Gerät zur Feststellung und/oder Konzentrationsbestimmung von Biomolekülen. |
JP3099853B2 (ja) * | 1993-02-19 | 2000-10-16 | 株式会社日立製作所 | 核酸の測定試薬及び測定方法 |
US5869255A (en) * | 1994-02-01 | 1999-02-09 | The Regents Of The University Of California | Probes labeled with energy transfer couples dyes exemplified with DNA fragment analysis |
GB9517955D0 (en) * | 1995-07-25 | 1995-11-08 | Univ Strathclyde | Nucleotide sequence detection and analysis |
US5814516A (en) * | 1995-10-13 | 1998-09-29 | Lockheed Martin Energy Systems, Inc. | Surface enhanced Raman gene probe and methods thereof |
US5866430A (en) * | 1996-06-13 | 1999-02-02 | Grow; Ann E. | Raman optrode processes and devices for detection of chemicals and microorganisms |
US5864397A (en) * | 1997-09-15 | 1999-01-26 | Lockheed Martin Energy Research Corporation | Surface-enhanced raman medical probes and system for disease diagnosis and drug testing |
-
1996
- 1996-10-25 JP JP28415396A patent/JP4068677B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-10-21 US US08/955,251 patent/US6043034A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-24 EP EP97308491A patent/EP0838528A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH10117797A (ja) | 1998-05-12 |
US6043034A (en) | 2000-03-28 |
EP0838528A1 (en) | 1998-04-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4068677B2 (ja) | 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット | |
CA2616259C (en) | Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection | |
Christopoulos | Nucleic acid analysis | |
JPH11503919A (ja) | 核酸の同時配列決定 | |
JPH05237000A (ja) | 核酸の検出及び測定方法 | |
Huang et al. | An electrochemical biosensor for the highly sensitive detection of Staphylococcus aureus based on SRCA-CRISPR/Cas12a | |
US20200123594A1 (en) | Methods and devices for sequencing | |
KR101185973B1 (ko) | 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 금속이온의 검출방법 및 이를 이용한 논리게이트 | |
JP2005502874A (ja) | インターカレート性酸化還元活性部分を用いる電気化学センサー | |
KR101820440B1 (ko) | 표적핵산의 검출방법 | |
Iwe et al. | A dual-cycling fluorescence scheme for ultrasensitive DNA detection through signal amplification and target regeneration | |
EP1384789B1 (en) | Fluorescent hybridization probes with reduced background | |
US20210121879A1 (en) | Systems and methods for sample preparation | |
Kara et al. | Electrochemical probe DNA design in PCR amplicon sequence for the optimum detection of microbiological diseases | |
US6423490B1 (en) | Method for measuring the concentration of polynucleotides | |
AU2020374893A1 (en) | Methods and devices using cartridges for sequencing | |
Peng et al. | Engineering of an adaptive tandem CRISPR/Cas12a molecular amplifier permits robust analysis of Vibrio parahaemolyticus | |
KR100482718B1 (ko) | 핵산 프로브 고정화 기체 및 그것을 이용한 표적 핵산의존재를 검출하는 방법 | |
JP2003144152A (ja) | ターゲット核酸断片の検出方法及びターゲット核酸断片の検出キット | |
Liang et al. | Red fluorescence-emitting copper nanoparticles-assisted label-free bioprobe coupled with CRISPR/Cas12a for sensitive detection of T4 polynucleotide kinase | |
JP4320188B2 (ja) | 一塩基置換検出方法及び一塩基置換検出用キット | |
US9255290B2 (en) | Methods and devices for non-therman polymerase chain reaction | |
KR20180136078A (ko) | 병원균 검출용 표면증강 라만 산란 나노복합체의 제조방법 | |
JP3587284B2 (ja) | 遺伝子工学用色素含有剤 | |
Bokkasam | Reductionist approach to avoid information overflow and noise in the assessment of complex DNA mixtures |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071002 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071129 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080108 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080111 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120118 Year of fee payment: 4 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |