KR101185973B1

KR101185973B1 - 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 금속이온의 검출방법 및 이를 이용한 논리게이트

Info

Publication number: KR101185973B1
Application number: KR1020100081466A
Authority: KR
Inventors: 박현규; 박기수; 정철희
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2010-08-23
Filing date: 2010-08-23
Publication date: 2012-09-25
Also published as: WO2012026723A9; KR20120018549A; WO2012026723A2; WO2012026723A3

Abstract

본 발명은 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 금속이온의 검출방법 및 논리게이트에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 티민-티민 염기쌍과 수은 이온의 특이적인 결합 또는 시토신-시토신 염기쌍과 은 이온의 특이적인 결합을 통해 형성되는 비상보적인 티민-수은-티민 또는 시토신-은-시토신 염기쌍에 의해 유도되는 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 수은 또는 은의 검출방법 및 이를 이용한 논리게이트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 금속이온의 검출방법은 비용이 저렴하고 손쉽게 금속이온을 검출할 수 있으며, 값비싼 RNA 또는 키메릭 DNA가 필요하여 비용이 많이 들고, 시스템 디자인 및 작동의 어려움을 가져 실질적인 적용이 힘들었던 종래 핵산 기반의 논리게이트와 비교하여 비용이 저렴하고, 논리적인 출력 신호 조절이 가능한 분자 수준의 논리게이트로의 실질적인 적용이 용이하다.

Description

비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 금속이온의 검출방법 및 이를 이용한 논리게이트{Method for Detecting Metal Ions Using Unnatural Polymerase Activity and Logic Gate Using the Same}

본 발명은 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 금속이온의 검출방법 및 논리게이트에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 티민-티민 염기쌍과 수은 이온의 특이적인 결합 또는 시토신-시토신 염기쌍과 은 이온의 특이적인 결합을 통해 형성되는 비상보적인 티민-수은-티민 또는 시토신-은-시토신 염기쌍에 의해 유도되는 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 수은 또는 은의 검출방법 및 이를 이용한 논리게이트에 관한 것이다.

금속이온을 검출하기 위한 방법으로 최근, 금속이온과 핵산과의 특이적인 상호작용과 관련된 많은 연구가 수행되어 오고 있으며, 이와 같은 특이적 상호작용의 예로는 특정 금속이온과 결합하는 압타머(aptamer) 및 효소 촉매 활성을 위한 조효소로서 특정 금속이온과의 결합을 필요로 하는 디엔에이자임(DNAzyme) 등이 보고되어져 있다 (Liu et. al., Chem. Rev., 109;1948, 2009). 이 외에도 핵산의 뉴클레오베이스(nucleobase) 혹은 합성된 뉴클레오베이스와 금속이온이 특이적인 배위 결합을 통해 안정화 된 염기쌍을 형성 할 수 있다는 것이 보고되어 있다 (Clever et. al., Angew. Chem. Int. Ed., 46;6226, 2007).

이러한 핵산과 금속이온의 특이적인 상호작용은 값싸고 손쉽게 금속이온을 검출하기 위한 방법의 기본 이론을 제공하였으며, 검출 신호 방법(형광, 전기화학 및 발색 신호)과의 결합을 통해 다양한 금속이온을 검출하는 방법들이 개발되어지고 있다. 예를 들면, 칼륨 이온에 특이적으로 결합하는 압타머를 이용하여 칼륨 이온을 검출하는 방법(Ueyama et. al., J. Am. Chem. Soc., 124;14286, 2002), 효소촉매 활성을 위한 조효소로 구리 이온, 납 이온 및 우라늄 이온을 필요로 하는 디엔에이자임을 이용한 금속이온 검출 방법(Santoro et. al., J. Am. Chem. Soc., 122;2433, 2000), 그리고 잘못 짝지어진 염기쌍(티민-티민 혹은 시토신-시토신)의 특이적인 금속이온과의 친화성을 기반으로 수은 및 은 이온의 검출 방법들이 개발되어오고 있다 (Miyake et. al., J. Am. Chem. Soc., 128;2172, 2006; Xue et. al., J. Am. Chem. Soc., 130;3244. 2008; Ono et. al., Chem. Commun., 4825, 2008).

상기 언급한 금속이온과 핵산의 특이적인 상호작용은 한 걸음 더 나아가 분자 수준의 논리게이트 구현으로 응용되어지고 있다 (Freeman et. al., Angew. Chem. Int. Ed., 48;7818, 2009). 이 분자 논리게이트는 기본적인 논리 AND, NOT 및 OR 혹은 그들의 조합을 수행할 수 있는 장치를 의미하며, 컴퓨터 마이크로프로세서(microprocessor)의 전자 논리게이트와 유사한 역할을 수행한다 (de silva et. al., Nat. Nanotechnol., 2;399, 2007). 특히, 분자 수준의 논리게이트 구현을 위한 구성 요소로 핵산은 구조적 단순함 및 상보적인 가닥과의 혼성화 그리고 특정 목적 물질을 특이적으로 잡을 수 있는 특성으로 인하여 주목을 받고 있다. 하지만 기존의 핵산 기반의 논리게이트는 각각의 입력 분자에 상응하여 게이트를 작동시키기 위한 복잡한 디자인을 요구하며, 값비싼 RNA 혹은 키메릭(chimeric) DNA(적어도 하나의 리보뉴클레오타이드 염기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드)를 필요로 한다 (Moshe et al., Nano Lett., 9;1196, 2009). 이러한 문제점들은 논리게이트 구현을 위한 비용 상승, 시스템 디자인 및 작동의 어려움을 유발시키며, 이로 인하여 실제적인 적용이 힘들다는 단점을 가지고 있다.

이에. 본 발명자들은 값비싼 RNA 및 복잡한 시스템 설계를 요구하지 않는 분자수준의 컴퓨터 제작에 사용되는 논리게이트를 개발하고자 예의 노력한 결과, 티민-티민 또는 시토신-시토신 염기쌍에 의해 활성이 억제된 핵산 중합 효소에 수은 이온 또는 은 이온을 처리할 경우, 비 상보적인 티민-수은-티민 (thymine-Hg²⁺-thymine base pair) 또는 시토신-은-시토신(cytosine-Ag⁺-cytosine base pair) 염기쌍을 형성시켜 비정상적인 핵산 중합 (polymerase) 효소의 활성을 유도시키고, 상기 핵산 중합 효소의 비정상적인 활성을 측정함으로써, 수은 이온 또는 은 이온의 존재 유무 판별이 가능하고, 논리적인 출력 신호 조절이 가능한 논리게이트의 구현이 가능하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은, 값비싼 장비 및 복잡한 시스템이 필요 없는 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 금속 이온의 검출방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 논리적인 출력 신호 조절이 가능한 분자 수준의 논리게이트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, (a) 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭산물의 유무로 수은 이온의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 수은 이온의 검출방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, (a) 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭산물의 유무로 은 이온의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 은 이온의 검출방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, (a) 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머 및 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머의 쌍을 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭산물의 유무로 수은 이온 및 은 이온의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 수은 이온 및 은 이온의 검출방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, (a) 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 한 쌍의 프라이머 및 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 한 쌍의 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭산물의 유무로 수은 이온 또는 은 이온의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 수은 이온 또는 은 이온의 검출방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, Yes 논리게이트에 있어서, 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭시키고, 입력신호로 수은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로는 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 Yes 논리게이트를 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, Yes 논리게이트에 있어서, 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭시키고, 입력신호로 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로는 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 Yes 논리게이트를 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, AND 논리게이트에 있어서, 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 순방향 프라이머 및 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 역방향 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭시키고, 입력신호로 수은 이온 및 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로는 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 AND 논리게이트를 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, OR 논리게이트에 있어서, 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 한 쌍의 프라이머 및 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 한 쌍의 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭시키고, 입력신호로 수은 이온 또는 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로는 증폭 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 OR 논리게이트를 제공하는데 있다.

본 발명에 따른 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 금속이온의 검출방법은 비용이 저렴하고 손쉽게 금속이온을 검출할 수 있으며, 값비싼 RNA 또는 키메릭 DNA가 필요하여 비용이 많이 들고, 시스템 디자인 및 작동의 어려움을 가져 실질적인 적용이 힘들었던 종래 핵산 기반의 논리게이트와 비교하여 비용이 저렴하고, 논리적인 출력 신호 조절이 가능한 분자 수준의 논리게이트로의 실질적인 적용이 용이하다.

도 1은 수은 또는 은 이온에 의한 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성 유도방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 수은 이온 또는 은 이온의 존재 유무 결과에 따른 PCR 결과물을 전기영동 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 3은 수은 이온 또는 은 이온 이외의 다른 금속이온들을 처리한 PCR 결과물을 전기영동 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는 실시예 1의 방법을 이용하여 구현된 예스(Yes) 논리게이트의 모식도(a), YES 논리게이트의 출력 신호인 젤 밴드 사진(b), 정량적인 YES 논리게이트의 출력 신호인 형광 신호(c) 및 YES 논리게이트의 진리표(d)를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1의 방법을 이용하여 구현된 앤드(AND) 논리게이트의 모식도(a), AND 논리게이트의 출력 신호인 젤 밴드 사진(b), 정량적인 AND 논리게이트의 출력 신호인 형광 신호(c) 및 AND 논리게이트의 진리표(d)를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1의 방법을 이용하여 구현된 오알(OR) 논리게이트의 모식도( a), OR 논리게이트의 출력 신호인 젤 밴드 사진(b), 정량적인 OR 논리게이트의 출력 신호인 형광 신호(c) 및 OR 논리게이트의 진리표(d)를 나타낸 것이다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭산물의 유무로 수은 이온의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 수은 이온의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 증폭산물이 생성된 경우, 수은 이온이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 증폭은 PCR에 의하여 수행될 수 있고, 상기 증폭산물은 전기영동 분석 또는 형광 다이를 이용한 형광신호를 통해 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 수은 이온의 유무 검출은 논리게이트를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 논리게이트는 입력신호로 수은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 Yes 논리게이트인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭산물의 유무로 은 이온의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 은 이온의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 증폭산물이 생성된 경우, 은 이온이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 증폭은 PCR에 의하여 수행될 수 있고, 상기 증폭산물은 전기영동 분석 또는 형광 다이를 이용한 형광신호를 통해 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 은 이온의 유무 검출은 논리게이트를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 논리게이트는 입력신호로 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 Yes 논리게이트인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 순방향 프라이머 및 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 역방향 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭산물의 유무로 수은 이온 및 은 이온의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 수은 이온 및 은 이온의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 증폭산물이 생성된 경우, 수은 이온 및 은 이온이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 증폭은 PCR에 의하여 수행될 수 있고, 상기 증폭산물은 전기영동 분석 또는 형광 다이를 이용한 형광신호를 통해 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 수은 이온 및 은 이온의 유무 검출은 논리게이트를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 논리게이트는 입력신호로 수은 이온 및 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 AND 논리게이트인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 한 쌍의 프라이머 및 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 한 쌍의 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭산물의 유무로 수은 이온 또는 은 이온의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 수은 이온 또는 은 이온의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 증폭산물이 생성된 경우, 수은 이온 또는 은 이온이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 증폭은 PCR에 의하여 수행될 수 있고, 상기 증폭산물은 전기영동 분석 또는 형광 다이를 이용한 형광신호를 통해 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 수은 이온 또는 은 이온의 유무 검출은 논리게이트를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 논리게이트는 입력신호로 수은 이온 또는 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 OR 논리게이트인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, Yes 논리게이트에 있어서, 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭시키고, 입력신호로 수은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로는 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 Yes 논리게이트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 논리게이트는 컴퓨터 마이크로프로세서의 전자 논리게이트와 유사한 역할을 수행할 수 있으며, 값비싼 RNA 또는 키메릭 DNA를 필요로 하지 않아 비용이 저렴하고, 금속 이온의 조합에 의해 손쉽고 간편하게 논리적인 출력 신호의 조절이 가능하다는 장점이 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, Yes 논리게이트에 있어서, 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭시키고, 입력신호로 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로는 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 Yes 논리게이트에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, AND 논리게이트에 있어서, 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 순방향 프라이머 및 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 역방향 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭시키고, 입력신호로 수은 이온 및 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로는 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 AND 논리게이트에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, OR 논리게이트에 있어서, 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 한 쌍의 프라이머 및 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 한 쌍의 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭시키고, 입력신호로 수은 이온 또는 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로는 증폭 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 OR 논리게이트에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서는, 잘못 짝지어진 염기쌍을 이용하여 비활성화시킨 핵산 중합 효소에 금속이온을 처리하여 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 유도하였다 (도 1). 수은 이온의 경우 3’말단에 티민 염기를 포함시켜 주형 DNA와 잘못 짝지어진 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍, 은 이온의 경우 3’말단에 시토신 염기를 포함시켜 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍을 이용하여 600bp, 10⁷ 복제 수의 주형 DNA를 PCR을 수행하여 증폭시키고, PCR 증폭산물을 확인하여 핵산 중합 효소(polymerase)의 활성 유도 여부를 확인하였다. 그 결과, 수은 이온이 존재할 경우에만 잘못 짝지어진 티민-티민 염기쌍이 수은 이온과의 배위결합을 통해 안정한 염기쌍을 형성하게 되어 비정상적인 핵산 중합 효소 활성을 유도하고, 이로 인해 PCR 증폭산물이 얻어지는 것을 확인하였다. 또한, 은 이온이 존재할 경우에만 잘못 짝지어진 시토신-시토신 염기쌍이 은 이온과의 배위결합을 통해 안정함 염기쌍을 형성하게 되어 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 유도하고, 이로 인해 PCR 증폭산물이 얻어지는 것을 확인하였다. 반면, 다른 금속이온들이 존재할 경우에는 PCR 증폭산물이 형성되지 않는 것을 확인하였다. 이는, 수은 이온 또는 은 이온이 특이적으로 잘못 짝지어진 염기쌍에 작용하고, 비정상적인 중합 효소 활성을 유도한다는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에서는, 금속이온에 의한 비정상적인 핵산 중합 활성 유도방법을 기반으로 하여 YES 논리게이트의 진리표에 따라 수은 이온의 존재 유무를 입력 신호로 설정하고 수은 이온이 존재할 경우 '1', 없을 경우 '0'으로 지정하였으며, 이에 따른 PCR 증폭산물의 형성은 출력신호로써, 젤 밴드 형성 및 형광 신호의 증가는 '1', PCR 증폭산물이 형성되지 않은 경우는 '0'으로 지정하여 YES 논리게이트를 구현하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, AND 논리게이트의 진리표에 따라 수은 이온과 은 이온의 존재 유무를 각각 입력 신호로 설정하고 각 입력신호에서 수은 이온 또는 은 이온이 존재할 경우 '1', 없을 경우 '0'으로 지정하였으며, 이에 따른 PCR 증폭산물의 형성은 출력신호로써, 젤 밴드 형성 및 형광 신호의 증가는 '1', PCR 증폭산물이 형성되지 않은 경우는 '0'으로 지정하여 AND 논리게이트를 구현하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, OR 논리게이트의 진리표에 따라 수은 이온과 은 이온의 존재 유무를 각각 입력 신호로 설정하고 각 입력신호에서 수은 이온 또는 은 이온이 존재할 경우 '1', 없을 경우 '0'으로 지정하였으며, 이에 따른 PCR 증폭산물의 형성은 출력신호로써, 젤 밴드 형성 및 형광 신호의 증가는 '1', PCR 증폭산물이 형성되지 않은 경우는 '0'으로 지정하여 OR 논리게이트를 구현하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

금속이온에 의한 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성 유도

(1) 수은 이온 또는 은 이온 존재 여부에 따른 PCR 증폭산물의 확인

수은 이온의 경우 3’말단에 티민 염기를 포함시켜 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍, 은 이온의 경우 3’말단에 시토신 염기를 포함시켜 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍 및 600bp, 10⁷ 복제 수의 주형 DNA를 사용하여 핵산 중합 효소(polymerase) 활성 유도 여부를 실험하였다. 600bp, 10⁷복제 수의 주형 DNA, 0.5μM의 프라이머 한 쌍, 1XPCR reaction buffer(30mM Tris-HCl, 30mM KCl and 30mM (NH₄)₂SO₄ and 2mM MgCl₂), 0.2mM dNTPs, and 1.5U i-Taq DNA polymerase(Intronbio, Korea), 10μM 금속이온(수은 이온 또는 은 이온)으로 이루어진 반응 혼합물을 Perkin-Elmer 9200 thermo-cycler(Perkin-Elmer, Norwalk, CT)를 사용하여 증폭시켰다. 94℃에서 3분간 heating하여 이중가닥 DNA를 denaturation 시킨 뒤, 94℃에서 20초, 53℃에서 42초, 72℃에서 40초간의 사이클을 30번 반복한 뒤, 72℃에서 5분간의 마지막 extension 과정을 거쳐 핵산 증폭 과정을 마쳤다. PCR 산물의 생성 여부는 아가로오스 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 이용하여 젤 밴드 형성을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 수은 이온 또는 은 이온이 존재하는 경우에만 비정상적으로 핵산 중합 효소의 활성이 유도되어 PCR 증폭산물이 생성된 것을 확인하였다. 반면, 수은 이온 또는 은 이온이 존재하지 않은 경우에는 프라이머와 주형 DNA 사이의 잘못 짝지어진 염기쌍의 존재로 인해 핵산 중합 효소의 진행 경로를 방해하게 되어 PCR 증폭산물이 형성되지 않는 것을 확인하였다.

또한, 완벽하게 짝지어지는 프라이머(PM)를 사용하여 수은 이온 또는 은 이온의 존재 여부에 따른 PCR 증폭 과정을 수행한 결과, 수은 이온 또는 은 이온의 존재 여부에 상관없이 PCR 증폭산물이 형성된 것을 전기영동을 이용한 젤 밴드를 통해 확인하였고, 젤 밴드의 세기(Intensity) 또한, 차이가 없다는 것을 확인하였다. 이는 수은 이온 또는 은 이온이 사용되는 농도 범위에서 수은 이온 또는 은 이온이 핵산 중합 효소의 활성을 저해하지 않음을 의미한다.

(2) 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 유도하는 금속이온의 특이성 판별

3’말단에 티민 염기를 포함시켜 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍, 금속이온이 은 이온인 경우 3’말단에 시토신 염기를 포함시켜 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍 및 600bp, 10⁷ 복제 수의 주형 DNA를 이용하여 핵산 중합 효소(polymerase) 활성 유도의 특이성을 실험하였다. 600bp, 10⁷복제 수의 주형 DNA, 0.5μM의 프라이머 한 쌍, 1X PCR reaction buffer(30mM Tris-HCl, 30mM KCl and 30mM (NH₄)₂SO₄ and 2mM MgCl₂), 0.2mM dNTPs, and 1.5U i-Taq DNA polymerase(Intronbio, Korea), 10μM 금속이온으로 이루어진 반응 혼합물을 Perkin-Elmer 9200 thermo-cycler(Perkin-Elmer, Norwalk, CT)를 사용하여 증폭시켰다. 94℃에서 3분간 heating하여 이중가닥 DNA를 denaturation 시킨 뒤, 94℃에서 20초, 53℃에서 42초, 72℃에서 40초간의 사이클을 30번 반복한 뒤, 72℃에서 5분간의 마지막 extension 과정을 거쳐 핵산 증폭 과정을 마쳤다. 특이성 여부 판별을 위해 상기 금속이온은 수은 이온 또는 은 이온 외에 10μM의 Zn²⁺, Ca²⁺, Pb²⁺, Mn²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, K⁺, Ni²⁺, Co²⁺, Mg²⁺및 Cd²⁺ 이온을 각각 첨가하여 PCR 산물의 생성 여부를 아가로오스 전기영동 (agarose gel electrophoresis) 을 통하여 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 수은 이온이 존재할 경우에만 잘못 짝지어진 티민-티민 염기쌍이 수은 이온과의 배위결합을 통해 안정한 염기쌍을 형성하게 되어 비정상적인 핵산 중합 효소 활성을 유도하고, 이로 인해 PCR 증폭산물이 얻어지는 것을 확인하였다 (도 3a). 또한, 은 이온이 존재할 경우에만 잘못 짝지어진 시토신-시토신 염기쌍이 은 이온과의 배위결합을 통해 안정함 염기쌍을 형성하게 되어 비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 유도하고, 이로 인해 PCR 증폭산물이 얻어지는 것을 확인하였다 (도 3b). 반면, 다른 금속이온들이 존재할 경우에는 PCR 증폭산물이 형성되지 않는 것을 확인하였다. 이는, 수은 이온 또는 은 이온이 특이적으로 잘못 짝지어진 염기쌍에 작용하고, 비정상적인 중합 효소 활성을 유도한다는 것을 의미한다.

비정상적인 핵산 중합 효소의 활성을 이용한 분자 수준의 논리게이트

(1) YES 논리게이트

실시예 1의 금속이온에 의한 비정상적인 핵산 중합 활성 유도방법을 기반으로 하여 YES 논리게이트(logic gate)를 구현하였다. YES 논리게이트의 진리표에 따라 수은 이온의 존재 유무를 입력 신호로 설정하고 수은 이온이 존재할 경우 '1', 없을 경우 '0'으로 지정하였으며, 이에 따른 PCR 증폭산물의 형성은 출력신호로써, 젤 밴드 형성 및 형광 신호의 증가는 '1', PCR 증폭산물이 형성되지 않은 경우는 '0'으로 지정하였다. 논리게이트의 구현을 위해 3’말단에 티민 염기를 포함시켜 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍 및 Taq 중합효소를 이용하여 증폭산물을 생성하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 수은 이온의 첨가 시에만 PCR 증폭산물이 형성됨을 확인할 수 있었으며, YES 논리게이트를 구현할 수 있었다. 상기 YES 논리게이트의 출력신호인 PCR 증폭산물은 전기영동 분석에 의한 젤 밴드 사진(도 4b) 및 정량적인 논리게이트 출력 신호의 획득을 위해 이중가닥 DNA 에 특이적인 Evagreen 형광 염료를 사용하여 real-time PCR 기계에서 형광 신호를 측정하였다 (도 4c).

(2) AND 논리게이트

실시예 1의 금속이온에 의한 비정상적인 핵산 중합 활성 유도방법을 기반으로 하여 AND 논리게이트를 구현하였다. AND 논리게이트의 진리표에 따라 수은 이온과 은 이온의 존재 유무를 각각 입력 신호로 설정하고 각 입력신호에서 수은 이온 또는 은 이온이 존재할 경우 '1', 없을 경우 '0'으로 지정하였으며, 이에 따른 PCR 증폭산물의 형성은 출력신호로써, 젤 밴드 형성 및 형광 신호의 증가는 '1', PCR 증폭산물이 형성되지 않은 경우는 '0'으로 지정하였다.

AND 게이트의 구현을 위해 Taq 중합효소를 이용하였으며, 수은 이온과 특이적인 반응을 위해 3’말단에 티민 염기를 포함하여 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머 및 은 이온과의 특이적인 반응을 위해 3’말단에 시토신 염기를 포함하여 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 설계된 역방향 프라이머를 동시에 사용하여 수은과 은 이온이 모두 존재 시에만 PCR 증폭이 이루어져 증폭산물이 형성되도록 디자인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, AND 논리게이트 진리표 정의에 따라 수은 이온과 은 이온이 모두 존재할 경우에만 PCR 증폭산물이 생성되는 것을 확인하였고, AND 논리게이트를 구현할 수 있었다. 상기 AND 논리게이트의 출력신호인 PCR 증폭산물은 전기영동 분석에 의한 젤 밴드 사진(도 5b) 및 정량적인 논리게이트 출력 신호의 획득을 위해 이중가닥 DNA 에 특이적인 Evagreen 형광 염료를 사용하여 real-time PCR 기계에서 형광 신호를 측정하였다 (도 5c).

(3) OR 논리게이트

실시예 1의 금속이온에 의한 비정상적인 핵산 중합 활성 유도방법을 기반으로 하여 OR 논리게이트를 구현하였다. OR 논리게이트의 진리표에 따라 수은 이온과 은 이온의 존재 유무를 각각 입력 신호로 설정하고 각 입력신호에서 수은 이온 또는 은 이온이 존재할 경우 '1', 없을 경우 '0'으로 지정하였으며, 이에 따른 PCR 증폭산물의 형성은 출력신호로써, 젤 밴드 형성 및 형광 신호의 증가는 '1', PCR 증폭산물이 형성되지 않은 경우는 '0'으로 지정하였다.

OR 논리게이트의 구현을 위해 Taq 핵산 중합효소를 이용하였으며, 3’말단에 티민 염기를 포함하여 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍 및 은 이온과의 특이적인 반응을 위해 3’말단에 시토신 염기를 포함하여 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 설계된 순방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍을 동시에 사용하여 수은과 은 이온이 모두 존재하거나 둘 중에 하나의 이온만이 존재할 경우에 PCR 증폭이 이루어져 증폭산물이 형성하도록 디자인하였다. 진리표의 정의에 따라 수은 이온과 은 이온이 모두 존재하지 않을 경우를 제외하고는 PCR 증폭산물이 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, OR 논리게이트를 구현할 수 있었다. 상기 OR 논리게이트의 출력신호인 PCR 증폭산물은 전기영동 분석에 의한 젤 밴드 사진(도 6b) 및 정량적인 논리게이트 출력 신호의 획득을 위해 이중가닥 DNA 에 특이적인 Evagreen 형광 염료를 사용하여 real-time PCR 기계에서 형광 신호를 측정하였다 (도 6c).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims

다음 단계를 포함하는 수은 이온의 검출방법:
(a) 3' 말단에 티민 염기가 포함되어 주형 DNA와 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및
(b) 상기 증폭산물의 유무로 수은 이온의 유무를 검출하는 단계.
제1항에 있어서, 증폭산물이 생성된 경우, 수은 이온이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 하는 수은 이온의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 증폭은 PCR로 수행하는 것을 특징으로 하는 수은 이온의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 증폭산물은 전기영동 분석 또는 형광다이를 이용한 형광신호를 통해 확인하는 것을 특징으로 하는 수은 이온의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 수은 이온의 유무 검출은 논리게이트를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 수은 이온의 검출방법.
제5항에 있어서, 논리게이트는 입력신호로 수은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 Yes 논리게이트인 것을 특징으로 하는 검출방법.
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다음 단계를 포함하는 수은 이온 및 은 이온의 검출방법:
(a) 3' 말단에 티민 염기가 포함되어 주형 DNA와 티민-티민 염기쌍을 형성하도록 디자인된 순방향 프라이머 및 3' 말단에 시토신 염기가 포함되어 주형 DNA와 시토신-시토신 염기쌍을 형성하도록 디자인된 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 DNA 중합효소로 주형 DNA를 증폭하는 단계; 및
(b) 상기 증폭산물의 유무로 수은 이온 및 은 이온의 유무를 검출하는 단계.
제13항에 있어서, 증폭산물이 생성된 경우, 수은 이온 및 은 이온이 존재하는 것으로 판독하는 것을 특징으로 하는 수은 이온 및 은 이온의 검출방법.
제13항에 있어서, 상기 증폭은 PCR로 수행하는 것을 특징으로 하는 수은 이온 및 은 이온의 검출방법.
제13항에 있어서, 상기 증폭산물은 전기영동 분석 또는 형광다이를 이용한 형광신호를 통해 확인하는 것을 특징으로 하는 수은 이온 및 은 이온의 검출방법.
제13항에 있어서, 상기 수은 이온 및 은 이온의 유무 검출은 논리게이트를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 수은 이온 및 은 이온의 검출방법.
제17항에 있어서, 논리게이트는 입력신호로 수은 이온 및 은 이온이 존재할 경우 "1" 및 수은 이온 및 은 이온이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하고, 출력신호로 증폭산물이 존재할 경우 "1" 및 증폭산물이 존재하지 않을 경우 "0"으로 지정하는 AND 논리게이트인 것을 특징으로 하는 검출방법.
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