KR20190079301A - 수은의 신속 간편 육안 현장 진단을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트 및 이를 이용한 수은의 신속 간편 육안 현장 검출 방법 - Google Patents

Abstract

수은의 신속 간편 육안 현장 진단을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트가 제공된다. 비색 센서 키트는 롤링 원형 증폭(RCA)을 위한 원형 주형, 상기 주형에 혼성화하는 프라이머로 수은 이온이 결합하면 상기 주형에 혼성화하지 않는 프라이머, DNA 중합효소, 및 상기 롤링 원형 증폭을 위한 원형 주형에서 생성되는 DNA 코일에 라벨링되는 나노파티클 프로브를 포함하는 센싱 물질 키트와 방사형 페이퍼 크로마토그래피를 포함한다.

Description

수은의 신속 간편 육안 현장 진단을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트 및 이를 이용한 수은의 신속 간편 육안 현장 검출 방법 {PAPER-BASED COLORIMTRIC SENSOR FOR ON-SITE HIGH EFFICIENT, RAPID AND VISUAL DETECTION OF MERCURIC IONS AND ON-SITE HIGH EFFICIENT, RAPID AND VISUAL DETECTION OF MERCURIC IONS}

본 개시는 물 속의 수은 이온의 진단을 위한 센서 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 물 속의 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 진단을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트 및 이를 이용한 병원성 박테리아의 신속 간편 육안 현장 검출 방법에 관한 것이다.

수은은 지구 환경과 인간의 건강에 심각한 위협이 되는 독성 중금속 물질 중의 하나이다. 특히 수은 이온(Hg^{2 +})은 물 오염의 가장 중요한 요인 중의 하나이다. 미생물의 생합성 경로를 통해 수은 이온(Hg^{2 +})은 메틸 수은으로 전환되며 이는 박테리아, 플랑크톤, 및 어류에 쉽게 흡수된다. 이는 인간의 뇌, 신경계, 신장 및 내분비 계통에 심각한 손상을 초래한다.

현재 수은 검출에 사용되는 가장 일반적인 방법으로는 ICP-MS(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry), AAS(Atomic Absorption Spectroscopy), GC(Gas Chromatography) 등이 있다. 이 방법은 높은 감도와 선택성으로 넓은 범위의 금속 이온을 검출할 수 있지만 비싸고 정교한 장비와 숙련된 인원을 필요로 한다. 또한 검출에 시간이 많이 소요되고 노동 집약적인 절차를 필요로 한다. 따라서, 신속하면서 간편하게 육안으로 현장에서 진단이 가능한 간단하면서도 편리하고 현장에서 바로 육안으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

수은을 신속하면서도 간단하게 실시간으로 현장에서 육안으로 센싱할 수 있으며 복잡한 고가의 측정 장비를 필요로 하지 않는 수은 검출을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트 및 이를 이용한 수은의 신속 간편 육안 현장 검출 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제 이외에도 구체적으로 언급되지 않은 다른 과제를 달성하는 데 본 발명에 따른 실시예가 사용될 수 있다.

실시예들에 따른 수은 검출을 위한 신속 간편 육안 현장 진단을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트는 롤링 원형 증폭(RCA)을 위한 원형 주형, 상기 주형에 혼성화하는 프라이머로 수은 이온이 결합하면 상기 주형에 혼성화하지 않는 프라이머, DNA 중합효소, 및 상기 롤링 원형 증폭을 위한 원형 주형에서 생성되는 DNA 코일에 라벨링되는 나노파티클 프로브를 포함하는 센싱 물질 키트와 방사형 페이퍼 크로마토그래피를 포함한다

실시예들에 따른 수은 검출을 위한 신속 간편 육안 현장 진단 방법은 롤링 원형 증폭을 위한 원형 주형에 혼성화하는 프라이머로 수은 이온이 결합하면 상기 주형에 혼성화하지 않는 프라이머와 검출 용액을 혼합 반응시키고, 상기 혼합 반응액에 롤링 원형 증폭을 위한 원형 주형, DNA 중합효소 및 상기 롤링 원형 증폭을 위한 원형 주형에서 생성되는 DNA 코일에 라벨링되는 나노파티클 프로브와 dNTP를 혼합하여 RCA 반응을 진행하고, 상기 RCA 반응이 완료된 용액을 방사형 페이퍼 크로마토그래피에 적하한 후 건조시키고, 상기 페이퍼 크로마토그래피에 생성된 동심원을 관찰하는 것을 포함한다.

본 개시에 따른 페이퍼 기반 비색 센서 키트는 휴대형 분광 광도계를 사용하여 매우 간단하고 견고한 측정을 통해 날씨, 햇빛 강도 및 판독 지점에서의 각도와 같은 조명 조건에 영향을 받지 않고 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도를 용이하게 측정할 수 있다. 즉, 본 발명의 실시예에 따른 페이퍼 기반 비색 센싱 방법을 사용하면 판독을 위한 부피가 크고 값 비싼 도구를 요구하지 않고 수은 이온(Hg^{2 +}) 농도를 결정할 수 있고, 간단하고 휴대 가능하며 비용 효율적인 접근법을 제공하기 때문에 신속하고 간편한 육안 현장 진단이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 페이퍼 기반 비색 센서 키트를 이용한 수은의 간편 육안 현장 검출 방법을 설명하기 위한 개념도이다.
도 2는 원형 주형의 생성 여부를 확인하기 위한 PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 Au NP 프로브만 존재할 경우의 투과 전자 현미경(TEM)사진이다.
도 4는 Au NP 프로브가 ss DNA에 응집된 것을 나타내는 TEM 사진이다.
도 5는 Au NP 프로브의 특성을 동적 광산란으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 Au NP 프로브의 특성을 제타 전위로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 원형 주형-(T)12 프라이머 복합체의 양에 따른 ssDNA 코일의 수율을 나타낸다.
도 8은 서로 다른 금속 이온과 프라이머를 반응시킨 후, 페이퍼 상에 형성된 동심원 링의 디지털 이미지를 나타낸다
도 9는 휴대용 분광 광도계에 의해 정량화 된 컬러 강도(ΔE)의 막대 그래프를 나타낸다.
도 10은 서로 다른 금속 이온과 프라이머의 선택도를 측정한 결과를 나타내는 형광 강도 그래프이다.
도 11은 서로 다른 수은 이온 농도에 대한 페이퍼 상의 비색 반응을 나타내는 디지털 이미지이다.
도 12는 8개의 서로 다른 수은 이온 농도에 따른 비색 반응을 분광광도계를 사용하여 정량화한 그래프를 나타낸다.
도 13은 5개의 서로 다른 수은 이온 농도에 따른 비색 반응을 분광광도계를 사용하여 정량화한 그래프를 나타낸다.
도 14는 수돗물에 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도를 0, 50, 250, 500 및 1000nM로 달리하여 첨가한후 페이퍼 상의 비색 반응을 측정한 디지털 이미지이다.
도 15는 수돗물에 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도를 0, 50, 250, 500 및 1000nM로 달리하여 첨가한후 페이퍼 상의 비색 반응을 분광광도계를 사용하여 정량화한 그래프를 나타낸다.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 도면에 나타난 각 구성의 크기 및 두께 등은 설명의 편의를 위해 임의로 나타낸 것이므로, 본 발명은 도시한 바로 한정되지 않는다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 페이퍼 기반 비색 센서 키트를 이용한 수은의 간편 육안 현장 검출 방법을 설명하기 위한 개념도이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 페이퍼 기반 비색 센서 키트는 수은 이온(Hg^{2 +}) 검출을 위한 센싱 물질 키트와 비색 반응용 페이퍼를 포함한다.

센싱 물질 키트(10)는 롤링 원형 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA)을 위한 원형 주형(12), 프라이머(14), DNA 중합효소(16) 및 나노파티클 프로브(18)를 포함한다.

먼저 수은 이온이 존재하는지 여부를 테스트하기 위하여 테스트 대상물을 프라이머(14)와 반응시킨다(S1).

테스트 대상물이 수돗물과 같은 용액 상태일 경우에는 센싱 물질 키트(10)가 담겨있는 반응기에 테스트 대상물을 혼합한다. 테스트 대상물이 용액이 아닐 경우에는 증류수에 샘플링한 테스트 대상물을 용해시킨 후에 센싱 물질 키트(10)에 담겨있는 반응기에 혼합한다.

프라이머(14)와 테스트 대상물과의 반응은 실온에서 10분 내지 30분간 진행할 수 있다.

이어서, RCA 반응을 진행한다(S2). RCA 반응을 위해서 원형 주형(12), DNA 중합효소(160), 나노파티클 프로브(18) 및 dNTP를 테스트 대상물과 프라이머가 혼합된 용액이 들어있는 반응기(20)에 혼합하고, 30℃ 에서 30분 내지 60분간 배양하여 RCA 반응을 진행할 수 있다.

RCA는 하나의 DNA 프라이머를 사용하여 짧은 원형 ssDNA 주형에서 긴 ssDNA 분자가 합성되는 특정 DNA 중합 효소에 의해 매개되는 등온의 효소 과정이다. RCA는 공간적으로 응축되어 단일 증폭된 분자로 검출 가능한 마이크론 크기의 DNA 연쇄체(concatemeric)로 이루어진 단일 가닥 DNA 코일을 생성하기 때문에 강력한 감지 시스템이다. 몇 가지 일반적인 RCA 검출 센서에서 RCA 반응은 검출 대상의 존재에 의존하는 자물쇠 탐침의 연결에 의해 유도된다.

반면, 본 발명의 일 실시예에서는 수은 이온(Hg^{2 +})과 프라이머(14)의 선택적인 반응을 이용한다. 프라이머(14)는 정상 상태에서는 RCA를 위한 원형 주형(12)에 혼성화한다. 그러나 수은 이온(Hg^{2 +})이 존재할 경우에는 수은 이온(Hg^{2 +})이 프라이머(14)에 결합해서 프라이머(14)가 원형 주형(12)에 결합하는 것을 저해한다.

RCA를 위한 원형 주형(12)은 50 내지 80 bp 정도의 단일 가닥 DNA(ss DNA)가 원형 형태로 형성된 주형이다.

수은 이온(Hg^{2 +})이 없을 경우 정상 상태의 프라이머(14)가 원형 주형(12)에 혼성화되면 DNA 중합효소(예., Phi29 DNA Polmerase)(18)에 의해서 RCA 반응이 유도된다. RCA 반응 동안 등온 조건 하에서 마이크론 크기의 DNA 연쇄체(concatemeric)로 이루어진 단일 가닥 DNA 코일(19)이 생성된다. 이렇게 생성된 단일 가닥 DNA 코일(19)에 이 생성되면 프로브(18)가 DNA 코일(19)에 라벨링된다.

반면 수은 이온(Hg^{2 +})이 존재할 경우에는 프라이머(14)에 수은 이온(Hg^{2 +})이 결합하여 프라이머(14)가 원형 주형(12)에 혼성화되는 것을 저해한다. 예를 들면 프라이머(14)가 티민(Thymine) 올리고뉴클레오타이드인 경우 수은 이온(Hg^{2 +})이 결합하여 티민-Hg²⁺-티민의 배위 결합을 형성하고 이로 인해 이중 가닥 복합체로 변화되기 때문에 원형 주형(12)에 혼성화될 수가 없게 된다.

프로브(18)는 단일 가닥 DNA 코일(19)과 혼성화가 가능한 올리고뉴클레오타이드와 소정 색상을 나타내는 나노 파티클(Nanoparticle, NP)로 이루어질 수 있다. 예를 들면, NP 는 Au NP 일 수 있으며 올리고뉴클레오타이드는 스트렙트아비딘-비오틴을 이용하여 Au NP에 기능화될 수 있다.

RCA가 완료된 용액을 방사형 페이퍼 크로마토그래피(30)상에 적하하고 건조시키면 페이퍼 상의 색상 변화를 수 초 이내에 휴대용 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 빠르고 간단하게 측정할 수 있다(S3).

방사형 페이퍼 크로마토그래피(30)는 측방형이 아닌 방사형으로 측정하고자 하는 용액을 중앙에 떨어뜨리고 분자 크기와 무게에 따라 유동성이 다른 원리를 이용하여 수은 이온(Hg^{2 +})의 유무 및 정도를 용이하게 확인할 수 있다.

방사형 페이퍼 크로마토그래피(30)의 소재, 구멍 크기, 친수성 또는 소수성 특징 등에 따라 분해능이 달라질 수 있다. 방사형 페이퍼 크로마토그래피(30)는 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드) NC(니트로셀루로오스) 등으로 이루어진 페이퍼 크로마토그래피일 수 있다.

RCA 반응이 완료된 용액을 방사형 페이퍼 크로마토그래피(30)에 적하하면 모세관 작용에 기초하여 반응 용액은 페이퍼의 중심으로부터 주변을 향해 이동한다. 용액의 성분은 이동상(mobile phase)에서 방사상으로 분리되고, 상이한 화합물의 스팟(spots)은 정지상(stationary phase)에서 동심원 고리로 형성된다. 검출 시스템에서 DNA 코일과 Au NP 프로브 복합체의 양은 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도에 따라 달라지게 된다. 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도가 크면 동심원의 중앙 스팟(40)의 색상이 강하게 나타난다. 반면, 수은 이온(Hg^{2 +})이 없거나 농도가 작을 경우에는 자유로운 Au NP가 반경 방향으로 멀리 확산되어 결과적으로 동심원의 바깥쪽 고리(50)의 색상이 강하게 나타난다. 따라서, 휴대용 분광 광도계를 사용하여 각 지점의 색상 강도를 정량화할 수 있다.

이하의 실험예들과 도면들은 본 발명의 실시예들의 개념적인 측면과 방법들을 보다 더 잘 이해하고 작용 및 효과를 상술하기 위해서 제공된다. 다만, 이러한 실험예들은 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

실험예

원형 주형의 제조

원형 템플릿 ssDNA의 합성을 위해 54bp의 길이를 갖는 100μM의 선형 ssDNA(5'-인산염 GTCCTCAGTCCCAATAGAAGCGGAGCTTCAAAAAAAAAAAAACGTCTGAAGAGG) 5 ㎕를 포함하는 100 μL의 반응 혼합물 용액 (100UμL DNA 연결효소(ligase) 4μL, 반응 완충액 10μL, 증류수 (DDW) 71 μL, 1 mM ATP 5 μL, 및 50 mM MnCl₂ 5μL)을 60 에서 8 시간 동안 연결시키고, 80 에서 10 분 동안 불활성화시켰다. 그런 다음 잔류 하는 선형 ssDNA를 제거하기 위해 20 U/μL 엑소뉴클레아제 I 6μL와 10U/μL 엑소뉴클레아제 III 3μL를 첨가하고 37 에서 4 시간 동안, 그리고 80 에서 20 분 동안 배양 하였다. 생성된 생성물을 올리고 클린업 및 농축 키트(Oligo Clean-Up and Concentration Kit)를 사용하여 정제하고 1xTBE 완충액으로 100V에서 75분 동안 15 % 변성 우레아-폴리 아크릴 아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 확인한 후 1xSYBR Green II로 15 분 동안 젤 염색 하였다. 그 결과가 도 2에 예시되어 있다.

Au NP 프로브의 제조

Au NP 프로브를 제조하기 위해, 스트렙트아비딘이 컨쥬게이트된 Au NP (SA-Au NP)의 표면을 바이오티닐화 올리고뉴클레오타이드로 기능화시켰다. Au NP 프로브의 형태는 80 kV의 가속 전압에서 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 관찰하였다.

구체적으로, SA-Au NP 용액 (300μL, 10OD)을 100μM 비오티닐화된 ssDNA 프로브(5'-TTTTTTTTTTTT-C6SP-biotin)와 혼합 하였다. 그 다음, 혼합물을 실온 (18-23 ℃)에서 3 시간 동안 진탕 배양하고 4 ℃에서 밤새 배양 하였다. Au NP로 변형된 정제 DNA 프로브를 얻기 위해, 용액을 6000 x g에서 30 분 동안 원심 분리를 통해 3 번 세척하고, pH 7.5의 1x PB 완충액에 재현탁시켰다. 증류수를 사용하여 두 번의 세척 단계를 수행 하였다. Au NP 프로브의 형태는 TEM에 의해 검사되었다.

도 3에서 볼 수 있듯이, Au NP 프로브는 용액에 잘 분산되어 있고 구형이다. 대조적으로, 도 4에서 볼 수 있듯이 Au NP 프로브와 ssDNA의 혼성화 반응시 Au NP 프로브의 응집 현상이 관찰된다. 이는 Au NP 프로브의 올리고뉴클레오타이드가 ssDNA와 상보적으로 결합하기 때문인 것으로 해석된다.

도 5와 도 6에 Au NP 프로브의 특성을 동적 광산란 (DLS) 및 제타 전위로 측정한 결과가 도시되어 있다. 음으로 대전된 바이오티닐화된 올리고 뉴클레오타이드를 SA-Au NP의 표면 상에 도입 한 후, Au 프로브의 크기 및 표면 전하가 변경되었음을 알 수 있다. 도 5에 도시되어 있는 바와 같이, 입자의 평균 직경은 33.21 nm에서 35.29 nm로 증가했으며 도 6에 도시되어 있는 바와 같이 음전하가 -24.8mV에서 -33.8mV로 증가했음을 알 수 있다. 이러한 결과는 올리고뉴클레오타이드가 SA-Au NP의 표면에 성공적으로 부착되었고, 증가된 음성 표면 전하로 인해 비특이적 응집에 의해 보다 안정화됨을 나타낸다.

원형 주형과 (T)12 프라이머 복합체를 이용한 RCA 반응 테스트

원형 주형-(T)12 프라이머 복합체의 형성을 통해 DNA 증폭을 확인하기 위한 실험을 수행 하였다. 다양한 농도의 원형 주형과 (T)12 프라이머 복합체를 RCA 반응의 실험 조건 하에서 시험하였고, SYBR Green II를 증폭된 ssDNA 코일의 양을 결정하기 위한 염색 시약으로 사용 하였다.

구체적으로, 원형 주형-(T)12 복합체의 양에 따라 ssDNA 코일의 양을 확인하기 위해 RCA 반응 후 SYBR Green II의 형광 강도를 측정 하였다. 먼저 원형 주형-(T)12 복합체의 다양한 농도(6, 3, 1.5, 0.75, 0.375 및 0 μM)를 포함하는 총 반응 혼합물 80μL (10 × 버퍼 8 μL, 10 MM dNTP 7.5 μL, 25 U/μL phi29 DNA 중합효소 3μL 및 DDW 41.5μL) 를 30 ℃에서 90 분 동안 반응시키고 65 ℃에서 10 분 동안 불활성화시켰다. 다음에, 100 × SYBR Green II 1 μL를 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 배양한 후, 멀티 모드 마이크로 플레이트 판독기 (SpectraMax i3x, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 형광 강도를 측정 하였다.

도 7은 원형 주형-(T)12 프라이머 복합체의 양에 따른 ssDNA 코일의 수율을 나타낸다. 원형 주형-(T)12 프라이머 복합체의 양이 0 에서 6μM로 증가함에 따라, SYBR Green II의 형광 강도 또한 증가했다. 이 결과는 원형 올리고뉴클레오타이드가 RCA에 대한 주형으로서 성공적으로 작용하고 RCA에 의해 생성된 ssDNA 코일의 양은 원형 주형-(T)12 프라이머 복합체의 양에 비례한다는 것을 나타낸다.

페이퍼 기반 비색 센싱 방법의 수은에 대한 선택성

수은 이온(Hg^{2 +})에 대해 제안된 분석 방법의 선택성을 확인하기 위해 수은 이온(Hg²⁺) 뿐만 아니라 다양한 금속 이온을 3 개씩 시험했으며 NC 막에 용액을 떨어뜨리고 건조한 후 동심 링의 비색 강도를 비교했다. 그 결과가 도 8에 도시되어 있다. 각 금속 이온의 최종 농도는 1μM이었다.

구체적으로, 수은 이온에 대한 선택성을 평가하기 위해 16 가지 금속 이온 (Li⁺, Mn^{2 +}, Ag⁺, Pb^{2 +}, Co^{2 +}, Ba^{2 +}, Ca^{2 +}, K⁺, Ni^{2 +}, Cd^{2 +}, Zn^{2 +}, Fe^{2 +}, Mg^{2 +}, Na⁺, Cu²⁺ 및 Hg^{2 +})를 테스트 하였다. 먼저, 200 nM (T)12 프라이머 용액 5μL를 각 금속 이온 16μM 5μL 또는 금속 이온 혼합물 5μL와 혼합한 후 실온에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음, RCA 반응 혼합물 [150 nM 원형 주형 10μL, 10 x 반응 완충액 8 μL, 10 mM dNTP 7μL, 10 U/μL phi29 DNA 중합효소 2.5μL, DDW 12.5μL 및 Au NP 프로브 (3.3 OD)]를 첨가하고 30 ℃에서 30 분간 및 65 ℃에서 10 분간 배양하였다. 이어서, 각 반응액 10 μL를 NC 막 상에 적하 건조시켰다. 결과는 휴대용 분광 광도계 (RM200QC, X-Rite Co., Neu-Isenburg, Germany)를 사용하여 분석하였다. 분광 광도계는 CIE L * a * b * (CIELAB)을 사용하는데, 이는 CIE (Commission Internationale del'Eclairage)가 지정한 색 공간을 나타낸다. CIELAB은 사람의 눈에 보이는 모든 색상을 기술하고 참조 용으로 사용할 장치 독립적 모델로 제공된다. CIELAB에서 색상을 표현할 때 L *은 밝기를 정의하고 a *는 적색 / 녹색 값을 나타내며 b *는 노란색 / 파란색 값을 나타낸다. ΔE의 값은 다음 식에 의해 계산 된 총 색상 차이를 나타낸다.

ΔE = [(ΔL *) 2 + (Δa *) 2 + (Δb *) 2] 1/2

도 8은 페이퍼 상에 형성된 동심원 링의 디지털 이미지를 나타낸다. 도 9는 휴대용 분광 광도계에 의해 정량화 된 컬러 강도(ΔE)의 막대 그래프를 도시한다. 페이퍼 상의 동심원 고리의 색 농도는 육안으로 쉽게 구별되었고 휴대용 분광 광도계를 사용하여 수치적으로 측정할 수 있었다. 또한 페이퍼 위의 동심원 고리의 색 농도를 측정 할 때 휴대용 분광 광도계가 페이퍼와 완전히 닿으므로 외부 조명 조건에 관계없이 일정한 측정이 가능함을 알 수 있다. 이 기능은 수은 이온(Hg^{2 +})의 현장 검출용 센서로의 이점을 나타낸다.

도 8을 살펴보면, 내부 동심원 고리의 색 농도는 수은 이온(Hg^{2 +})만 포함된 시료와 수은 이온(Hg^{2 +})을 포함하는 혼합물 두 개의 시료에서만 낮게 나타났다. 이는 수은 이온(Hg²⁺) 으로 인해 RCA 저해가 일어났음을 나타낸다. 한편, 수은 이온(Hg²⁺) 함유 샘플의 경우, Au NP가 DNA 코일에 결합되지 않기 때문에 동심원의 가장자리에서 더 높은 색 강도를 나타냈다. 이 결과는 제안 된 분석 방법이 수은 이온(Hg²⁺) 에 대해 선택적임을 입증한다.

또한 수은 이온(Hg^{2 +})에 대한 (T)12 프라이머의 선택도는 도 10에 도시되어 있다. SYBR Green I의 높은 형광 값은 같은 농도의 다른 금속 이온 샘플 값과 비교했을 때 수은 이온(Hg^{2 +})만 포함된 시료와 수은 이온(Hg^{2 +})을 포함하는 혼합물 에서만 나타났다. 이는 단일 가닥 프라이머가 티민-Hg^{2 +}-티민의 배위 결합으로 인해 이중 가닥 복합체로 변화되었기 때문임을 나타낸다. 그 결과 수은 이온(Hg^{2 +})과 결합한 (T)12 프라이머는 원형 주형에 결합할 수 없어서, RCA 반응이 억제되는 것을 확인할 수 있다.

페이퍼 기반 비색 센싱 방법을 사용한 수은 이온( Hg ^{2 +} )의 정량화

도 11은 NC 페이퍼 상에 떨어뜨리고 건조한 후의 디지털 이미지이다. 도 11을 참조하면, 수은 이온(Hg^{2 +})이 없는 경우 강렬한 붉은 색 스팟(spot)이 동심원 중앙에 나타나고, 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도가 증가할수록 스팟의 강도가 감소하는 것을 알 수 있다. 대조적으로, 동심원 링의 가장자리 링의 색상 강도는 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도가 증가함에 따라 증가하는 것을 알 수 있다.

동심원 중심의 붉은 반점을 휴대용 분광 광도계를 사용하여 정량화한 결과가 도 12 및 도 13에 도시되어 있다. 도 12는 다양한 수은 이온(Hg^{2 +})농도 (0, 50, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 및 3000nM)의 9 개 샘플의 측정 결과를 나타낸다. 페이퍼 상의 동심원 중심의 스팟의 색 농도 (ΔE)는 각각 19.2, 18.6, 16.8, 13.8, 10.2, 7.3, 6.1, 5.3 및 4.4 로 측정되었고, ΔE 값은 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향이 있었다.

도 13은 0 내지 1000 nM 범위의 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도에서 수행한 결과를 나타낸다. 상이한 수은 이온(Hg^{2 +}) 농도를 갖는 6 개의 샘플 (0, 50, 250, 500, 1000 및 1500 nM)에 대해서 3 회 시험한 후 그 평균값을 도시한 것이다. 도 13을 참조하면, ΔE 값의 평균은 18.1±0.05, 17.5±0, 16.1±0.25, 14.4±0.77, 11.2±0.86 및 8.2±0.57 이었다. 0 에서 1500nM 수은 이온(Hg^{2 +}) 농도 범위와 ΔE 값에 대한 선형 곡선이 얻어졌으며 신호 대 잡음비 3에서의 수은 이온(Hg^{2 +}) 검출 한계는 21.8 nM (n = 3)으로 계산되었다. 휴대용 분광 광도계를 사용한 측정 시간은 수초면 충분하였다. 따라서 RCA 반응 및 측정을 포함한 총 분석 시간은 90 분 내외로 매우 신속 간편한 측정이 이루어짐을 알 수 있다.

수돗물에서의 수은 이온( Hg ^{2 +} )의 검출

실제 샘플에서 본 검출 방법의 적용 가능성을 입증하기 위해 수돗물에 수은 이온(Hg²⁺)의 농도를 0, 50, 250, 500, 1000 및 1500 nM 로 달리하여 첨가하고 페이퍼 기반 비색 센싱 방법을 사용하여 각 농도별로 3개의 샘플을 테스트하였다. 수은 혼합 전 수돗물은 0.22μm의 기공 크기를 가진 NC 시린지 필터 멤브레인을 통해 여과해서 준비하였다.

비색 테스트 결과는 도 14와 도 15에 도시되어 있다. 0, 50, 250, 500, 1000 및 1500 nM 의 수은 이온(Hg^{2 +}) 농도 별로 측정된 ΔE 값의 평균은 각각 18.27±0.05, 17.33±0.83, 16.57±0.48, 14.5±0.22, 11.07±0.52 및 8.77±0.68였다.ΔE 값의 선형 곡선은 0 내지 1500 nM Hg^{2 +}의 범위에서 얻어졌으며, 신호 대 잡음비 3에서의 검출 한계는 22.4 nM (n = 3)으로 계산되었다.

이로써 본 발명의 실시예에 따른 페이퍼 기반 비색 센싱 방법을 사용하면 휴대형 분광 광도계를 사용하여 매우 간단하고 견고한 측정을 통해 날씨, 햇빛 강도 및 판독 지점에서의 각도와 같은 조명 조건에 영향을 받지 않고 수은 이온(Hg^{2 +})의 농도를 용이하게 측정할 수 있다. 즉, 본 발명의 실시예에 따른 페이퍼 기반 비색 센싱 방법을 사용하면 판독을 위한 부피가 크고 값 비싼 도구를 요구하지 않고 수은 이온(Hg^{2 +}) 농도를 결정할 수 있고, 간단하고 휴대 가능하며 비용 효율적인 접근법을 제공하기 때문에 신속하고 간편한 육안 현장 진단이 가능하다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 특허청구범위와 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.

10: 센싱 물질 키트 12: 원형 주형
14: 프라이머 16: DNA 중합효소
18: 나노파티클 프로브 19: 단일 가닥 DNA 코일
30: 방사형 페이퍼 크로마토그래피

Claims (9)

1. 롤링 원형 증폭(RCA)을 위한 원형 주형;
   상기 주형에 혼성화하는 프라이머로 수은 이온이 결합하면 상기 주형에 혼성화하지 않는 프라이머;
   DNA 중합효소; 및
   상기 롤링 원형 증폭을 위한 원형 주형에서 생성되는 DNA 코일에 라벨링되는 나노파티클 프로브를 포함하는 센싱 물질 키트; 및
   방사형 페이퍼 크로마토그래피를 포함하는 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 진단을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트.
2. 제1항에 있어서,
   상기 프라이머는 티민 올리고뉴클레오타이드인 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 진단을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트.
3. 제1항에 있어서,
   상기 나노파티클 프로브는 Au 나노파티클인 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 진단을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트.
4. 제1항에 있어서,
   상기 Au 나노파티클은 스트렙트아비딘 표면에 Au 나노파티클이 고정화된 SA-Au NP를 바이오티닐화된 올리고뉴클레오타이드로 기능화한 것인 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 진단을 위한 페이퍼 기반 비색 센서 키트.
5. 롤링 원형 증폭을 위한 원형 주형에 혼성화하는 프라이머로 수은 이온이 결합하면 상기 주형에 혼성화하지 않는 프라이머와 검출 용액을 혼합 반응시키고,
   상기 혼합 반응액에 롤링 원형 증폭을 위한 원형 주형, DNA 중합효소 및 상기 롤링 원형 증폭을 위한 원형 주형에서 생성되는 DNA 코일에 라벨링되는 나노파티클 프로브와 dNTP를 혼합하여 RCA 반응을 진행하고,
   상기 RCA 반응이 완료된 용액을 방사형 페이퍼 크로마토그래피에 적하한 후 건조시키고,
   상기 페이퍼 크로마토그래피에 생성된 동심원을 관찰하는 것을 포함하는 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 검출 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 프라이머는 티민 올리고뉴클레오타이드인 수은 이온의 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 검출 방법.
7. 제5항에 있어서,
   나노파티클 프로브는 Au 나노파티클인 수은 이온의 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 검출 방법.
8. 제5항에 있어서,
   상기 Au 나노파티클은 스트렙트아비딘 표면에 Au 나노파티클이 고정화된 SA-Au NP를 바이오티닐화된 올리고뉴클레오타이드로 기능화한 것인 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 검출 방법.
9. 제5항에 있어서,
   상기 페이퍼 크로마토그래피에 생성된 동심원을 관찰하는 것은 휴대용 분광 광도계를 사용하여 상기 동심원의 색상과 모양에 따라 수은 이온의 농도를 계산하는 것을 포함하는 수은 이온의 신속 간편 육안 현장 검출 방법.

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