CN113720837B - 一种快速检测水体中汞离子的比色传感器 - Google Patents
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Abstract
一种用于水体中汞离子浓度检测的比色传感器，反应组分包括：自延伸DNA模板、Bst3.0 DNA聚合酶、dNTPs底物及纳米金胶体。本发明利用特定的错配碱基对实现汞离子的高特异性识别，以启动后续的DNA自延伸反应。同时，利用结构极其简单的自延伸DNA模板实现快速的信号放大。由于dNTPs底物与双链的扩增产物在稳定纳米金胶体上存在显著差异，纳米金胶体颜色的显著差异可以直观地指示样品中的汞离子浓度，方便了检测结果的观察。该发明具有检测灵敏度高、检测特异性和抗干扰能力强以及结果可直接观测的优点，是检测水体中重金属汞污染的有效方法。
Description
技术领域
本发明涉及比色检测领域，具体涉及用于检测水体中汞离子的比色传感器的设计和应用。
背景技术
伴随着工业和现代化的迅速发展，重金属污染物已成为破坏环境生态平衡以及威胁人类健康的严重问题。其中，汞是一种严重危害环境生态平衡和人体健康的剧毒的重金属元素；由于具有显著的生物累积效应，汞元素容易通过食物链富集，不但严重危害水生生物，对位于食物链顶端的人类的威胁更为严重。
为防止发生汞中毒事件，《中华人民共和国环境保护法》中规定生活饮用水以及农田灌溉水中汞的含量应小于0.001 mg/L。当前，原子吸收/发射光谱、原子荧光光谱、X射线荧光光谱和电感耦合等离子体质谱等技术均可实现汞的高灵敏度检测。然而，这些分析方法都需要昂贵的设备、复杂且耗时的预处理，增大了水质常规监控的难度。
因此，开发简便、快速且廉价的分析方法对于长期监控水体的重金属污染以及环境保护都意义重大。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明开发了一种操作简便，成本低廉、检测快速且对分析仪器依赖性较低的比色检测方法。本方法中应用的DNA自延伸信号放大技术可在等温条件下进行，由于只涉及极其简单的反应组分，该反应体系具有良好的可靠性。同时，由于具有检测结果可直接通过肉眼分辨的优势，该方法尤其适合用于分析仪器匮乏地区以及样品的实地快速检测。
为了实现上述目的，本发明提供了用于汞离子检测的DNA模板序列，经优化的适合的反应缓冲液组分，用于比色检测的纳米金的制备方法以及相关的检测操作程序。
用于水体中汞离子浓度检测的比色传感器，反应组分包括：自延伸DNA模板、Bst3.0 DNA聚合酶、dNTPs底物及纳米金胶体。本发明利用特定的错配碱基对实现汞离子的高特异性识别，以启动后续的DNA自延伸反应。同时，利用结构极其简单的自延伸DNA模板实现快速的信号放大。由于dNTPs底物与双链的扩增产物在稳定纳米金胶体上存在显著差异，纳米金胶体颜色的显著差异可以直观地指示样品中的汞离子浓度，方便了检测结果的观察。该发明具有检测灵敏度高、检测特异性和抗干扰能力强以及结果可直接观测的优点，是检测水体中重金属汞污染的有效方法。
所述的用于汞离子检测的DNA模板序列为：
5’-TTGTTAACAATTGTTAACAATTGTTACTCCTTTTGGTGTATC-3’，其中3’端两对错配的T-T碱基对用于汞离子的特异性识别。（参见图1~5）
所述的反应缓冲液组分为：
1×缓冲液 (20 mM TrisHNO3, 50 mM KNO3, 2 mM Mg(NO3)2, 1 M甜菜碱, 75 μMdNTPs, pH7.4)。
所述的纳米金制备方法为：
100 mL浓度为1 mM的HAuCl4在搅拌和回流条件下加热至沸腾，随后加入2.4 mL5%的柠檬酸三钠，并继续煮沸30分钟，反应物缓慢降至室温后即可获得直径约13 nm的纳米金胶体，用超纯水稀释四倍后即可用于比色检测。
所述的检测操作程序为：
1）反应体系总体积100 μL，含1×缓冲液, 50 nM DNA模板链，8 U Bst 3.0 DNA聚合及50 μL待测液体样品；反应液在70℃维持孵育20分钟。
2）5 μL反应产物与50 μL纳米金混合，加入12.5 μL浓度为100 mM的TrisHNO3 (pH7.4)，静置5分钟后即可直接肉眼比较颜色变化或使用紫外分光光度计检测。结果该传感器实现了对汞离子的灵敏检测，检测限约为0.93 nM（参见图6A）。
采用所述的检测操作程序对比色传感器的检测特异性进行了验证：
特异性验证中检测了包括Fe3+、Al3+、Ca2+、Cu2+、Ni2+、Mn2+在内的多种金属阳离子，操作程序与上述一致。结果显示这些干扰离子对汞离子检测的影响很小（参见图6B）。
采用所述的检测操作程序对环境水体样品中的汞离子浓度进行了和加标回收：
1）从环境中采集的水体样品首先经2000g离心5分钟和0.45 μM微孔滤膜过滤去除不溶性杂质，添加5‰体积浓度为1 M的HNO3，以避免目标金属离子的水解沉淀；随后按上述检测程序操作。
2）加标回收检测过程中首先向预处理后的样品中加入已知浓度的汞离子；随后按相同程序操作。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明首次将自延伸的DNA模板应用于汞离子的检测，极大地简化了反应体系，检测成本低且操作简便。
本发明所述的比色检测策略减少了对分析仪器的依赖，检测结果裸眼可辨，有利于样品的实地分析以及日常检测。
本发明可通过比色结果的紫外-可见光谱的信号比值（A620/A520）对样品中汞离子浓度进行定性定量分析。
本发明抗干扰能力强且可用于实际水体样品中汞离子的检测分析。
附图说明
图1为汞离子检测的DNA模板序列与汞离子结合原理示意图；
图2为DNA模板链进行单一核酸链的等温扩增反应的示意图；
图3为本发明传感器与汞离子结合前后的原理示意图，其中，左侧不含汞离子试样的试样为红色，右侧含汞离子试样为深蓝色；
图4为本发明传感器检测不同浓度的汞离子时的颜色、紫外-可见光谱的信号变化。小图照片可以观察到随汞离子浓度增加，试样由红色逐渐变为深蓝色，逐渐变得暗淡，当汞离子浓度高于500 nM时，试样完全转变为深蓝色。紫外-可见光谱的信号表现为，在520nm处，峰强度随浓度降低而增加；在620 nm处，峰强度随浓度降低而降低；
图5为本发明传感器在不含/含有汞离子试样中的核酸电泳结果；
图6A为本发明传感器A620/A520比值与汞离子浓度拟合得到的标准曲线，传感器对0-250 nM范围的汞离子符合线性关系；图6B为该方法的检测特异性验证，本发明传感器可实现Fe3+、Al3+、Ca2+、Cu2+、Ni2+、Mn2+及混合金属离子干扰下对汞离子的特异性检测；
图7为 DNA模板序列的优化，通过在特定结构域插入不同数量的错配碱基对最终获得汞离子检测效果最优的核酸序列；
图8 DNA扩增及比色检测条件的优化，确定影响纳米金胶体比色检测灵敏度的最适dNTPs浓度；
图9 扩增反应温度的优化，确定DNA自延伸模板的最适延伸温度。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
一种用于检测水体中汞离子的比色检测方法。使用错配碱基对（T-T）实现汞离子的特异识别；基于单一的DNA模板在聚合酶催化下的自我延伸扩增特性实现快速的信号放大；并最终使用纳米金胶体实现检测结果的可视化。使用的以自身为模板持续延伸的DNA模板链的序列为：TTGTTAACAATTGTTAACAATTGTTACTCCTTTTGGTGTATC。其特征在于：使用所述DNA模板链进行单一核酸链的等温扩增反应，并基于DNA链合成底物（dNTPs）与生成的双链DNA产物在稳定纳米金胶体性质上的显著差异实现比色检测。
基于dNTPs与双链DNA稳定纳米金胶体性质的差异实现的比色检测方法。
（1）其反应体系包含：1×缓冲液 (20 mM TrisHNO3, 50 mM KNO3, 2 mM Mg(NO3)2, 1 M甜菜碱, 75 μM dNTPs, pH7.4), 50 nM DNA模板链，8 U Bst 3.0 DNA聚合及50 μL待测液体样品，反应总体积为100 μL。
（2）纳米金胶体的制备及比色检测：
100 mL浓度为1 mM的HAuCl4在搅拌和回流条件下加热至沸腾，随后加入2.4 mL5%的柠檬酸三钠，并继续煮沸30分钟，反应物缓慢降至室温后即可获得直径约13 nm的纳米金胶体，该纳米金胶体用超纯水稀释四倍后即可用于比色检测。
如（1）所述的反应体系在70℃维持孵育20分钟，随后反应产物即可用于纳米金比色检测。比色检测时，5 μL反应产物与50 μL纳米金混合，随后加入12.5 μL浓度为100 mM的TrisHNO3 (pH 7.4)，静置5分钟后即可直接肉眼比较颜色变化或使用紫外分光光度计检测。
实施例1
本实施例为汞离子检测的模板错配碱基数优化。错配碱基数的优化对于汞离子检测的灵敏度至关重要，过少的碱基错配由于不能良好地抑制无汞离子条件下模板延伸的起始而造成高背景信号，相反地，过多的碱基错配则极大地削弱了有汞离子条件下DNA模板的延伸。最终，根据图7 的电泳结果，含有两个错配碱基的DNA模板Self-T(2)，即本发明中使用的模板被用于汞离子的检测。
实施例2
本实施例为汞离子检测的dNTPs浓度的优化。本发明利用了dNTPs与双链DNA产物稳定纳米金胶体性质的差异实现比色检测。反应体系中dNTPs的浓度对于汞离子比色检测的灵敏度至关重要，过量的dNTPs能使纳米金过于稳定而削弱其颜色变化进而削弱汞离子检测的灵敏度；过少的dNTPs则削弱了DNA模板的扩增能力。最终，根据图8的电泳及比色检测结果，75 μM的dNTPs浓度被用于汞离子的检测。
实施例3
本实施例为汞离子检测的反应温度优化。在本发明中，DNA模板的持续延伸是温度依赖的。过低的反应温度由于不能使特定结构域发生正确的重折叠而使DNA模板不能持续延伸；过高的反应温度则易造成DNA聚合酶的快速失活。最终，根据图9的电泳结果，70℃被用于汞离子的检测。
实施例4
本实施例为绘制该方法检测汞离子的标准曲线，旨在确定该检测方法的有效线性范围及确定该方法的检测灵敏度。操作程序如前所述，检测了不同浓度的汞离子，结果如图6A所示。
实施例5
本实施例为该方法检测汞离子的特异性，旨在通过检测其它干扰离子对汞离子检测的影响验证该方法的检测特异性。操作程序如前所述，检测了多种干扰离子的信号响应，结果如图6B所示。
实施例6
本实施例为实际水体样品中汞离子浓度的检测及加标回收，旨在验证该检测方法的实际应用性。
操作程序如前所述，检测了实际水体中汞离子的初始浓度及加标回收浓度并计算了加标回收率，结果如表1所示。
序列表
<110> 西北大学
<120> 一种快速检测水体中汞离子的比色传感器
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttgttaacaa ttgttaacaa ttgttactcc ttttggtgta tc 42
Claims (10)
1.一种快速检测水体中汞离子的比色传感器，其特征在于，包括：
DNA模板链、DNA聚合酶、dNTPs底物以及纳米金胶体；所述DNA模板链含有用于汞离子检测的DNA模板序列，所述DNA模板序列为5’-TTGTTAACAATTGTTAACAATTGTTACTCCTTTTGGTGTATC-3’。
2.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述DNA模板序列中含有两对错配的T-T碱基对用于汞离子的特异性识别。
3.权利要求1或2所述的传感器快速检测水体中汞离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将所述DNA模板链、dNTPs底物及待测样品混合，加入DNA聚合酶后在67.5~75℃进行孵育；
2）将步骤1）反应产物与纳米金胶体混合，静置后进行检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1）是将dNTPs底物溶解在缓冲液中，然后令50 nM DNA模板链与50 μL待测样品在1份缓冲液中进行孵育，所述1份缓冲液包括20mM TrisHNO3、50 mM KNO3、2 mM Mg(NO3)2、1 M甜菜碱、75 μM dNTPs，pH=7.4；所述步骤2）是将5 μL步骤1）反应产物与50 μL纳米金胶体在12.5 μL浓度为100 mM、pH=7.4的TrisHNO3中混合。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）反应产物与纳米金胶体混合后，通过肉眼观察颜色变化和/或使用紫外分光光度计检测520 nm和/或620 nm处光谱变化以实现对汞离子的快速检测。
6.如权利要求3所述的方法，所述步骤1）的孵育温度为70℃。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，以紫外-可见光谱在620 nm与520 nm处的信号比值确定汞离子浓度。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）取50 nM所述DNA模板链、50 μL待测液体样品、8 U的Bst 3.0 DNA聚合酶及1份缓冲液混合得到反应体系，在70℃维持孵育20分钟；所述缓冲液包括20 mM TrisHNO3、50 mMKNO3、2 mM Mg(NO3)2、1 M甜菜碱、75 μM dNTPs，pH=7.4；
2）取5 μL的步骤1）的反应产物与50 μL纳米金胶体混合，加入12.5 μL浓度为100 mM、pH=7.4的TrisHNO3，静置5分钟后进行检测。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，汞离子浓度与紫外-可见光谱在620 nm与520nm处的信号比值在汞离子浓度为0~250 nM范围表现为线性关系。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在汞离子浓度为0~1000 nM范围表现为随着汞离子浓度的升高，试样颜色由红色逐渐转变为深蓝色，且试样颜色逐渐暗淡。
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