CN105866047A

CN105866047A - 一种检测二价汞离子的生物传感器及其制备方法

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Publication number: CN105866047A
Application number: CN201610189443.9A
Authority: CN
Inventors: 刘素; 冷雪琪; 黄加栋; 王玉; 王虹智; 郭玉娜
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2016-08-17

Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别检测二价汞离子的生物传感器，同时涉及其制备方法。本发明首先合成金纳米粒子；再将Linker修饰到金纳米粒子表面；后将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合反应后检测目标物。本发明利用了核酸适配体的特异型识别，利用“T‑Hg²⁺‑T”的复合结构实现了对目标物汞离子的高特异性检测，利用链置换，实现了Trigger的循环利用，起到了信号放大的作用，解决了现有技术中检测汞离子的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题。

Description

一种检测二价汞离子的生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

重金属汞是一种用途非常广泛的化学化工材料，它可以通过采矿和其它相关的化工生产进入环境到水体中，而造成严重的水污染。汞离子在环境中不能被分解，只能通过食物链进行富集。因此，人体如果大量长期的接触和吸入重金属汞，就会造成神经系统和肝脏、肾脏等器官产生严重的损坏，严重时会对人的生命造成威胁。比如出现神经末梢和脑中枢神经受损的症状，这会导致患者出现脸部呆痴、走路不稳、说话不清楚、手足震颤、视力下降、或者是异常兴奋直到死亡。

目前报道的汞离子的检测方法包括分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法、氢化物发生-原子荧光光谱法等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应汞离子检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测汞离子的残留。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测汞离子的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于链置换的纳米金比色法检测汞离子的生物传感器。同时还涉及其制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：

Linker： 5’-SH-TTTTTTAGGCTACGAG-3’(SEQ ID:NO:1)；

Arch： 5’-GTTCTTTGCTTTTTTGCTTTGTTC-3’(SEQ ID:NO:2)；

Trigger： 5’-GAACAAAGCGCAAAGAAC-3’(SEQ ID:NO:3)；

HAP1： 5’-CTCGTAGCCTGTTCTTTGCGCTTTGTTCAGGTGTAGATGAACAA-3’(SEQ ID:NO:4)；

HAP2： 5’-CTCGTAGCCTTCTACACCTGAACAAAGCGCAAAGAACTTGTTCA-3’(SEQ ID:NO:5)。

其中HAP1和HAP2的斜体部分是Linker黑体部分的互补序列，下划线标记与下划线黑体标记的为互补序列。Linker的5’端修饰-SH，通过Au-S共价键将Linker修饰到纳米金表面，由于HAP1和HAP2的斜体部分与Linker黑体部分通过碱基互补配对将金纳米粒子间的距离拉近，使得金纳米粒子聚沉。通过测量纳米金溶液的吸光度来定量检测汞离子。

本发明中汞离子的检测是在均相溶液中实现的，通过链置换的方式来实现信号的放大，从而实现汞离子的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：Arch与Trigger进行碱基互补配对形成桥型结构。当有汞离子存在时，由于Arch中的碱基T与目标物之间形成“T-Hg²⁺-T”的特异性复合结构，可以将桥型结构打开，由于“T-Hg²⁺-T”的错配使得Arch形成发夹结构，同时释放出Trigger。释放出的Trigger（c*）可以与HAP1的c片段进行碱基互补配对，从而打开HAP1。随后，打开的HAP1中的c片段和d片段可以与HAP2中的c*和d*进行碱基互补配对，从而将HAP2打开， HAP2与HAP1形成双链的同时将Trigger链置换出来，置换出的Trigger链将继续打开别的HAP1，然后重复上述过程，这样Trigger可以进行无限次的循环，从而实现信号放大。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）进行金纳米粒子的制备；

（2）将Linker（含-SH）修饰到金纳米粒子表面；

（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合。

所述的制备方法，优选纳米金粒子的制备操作步骤如下：

①安装好所需仪器，向三口烧瓶中加入200ml超纯水（注意不要让三口烧瓶中落入灰尘）。

②取500uL（0.04g/ml）HAuCl₄于单个包装的离心管中，用移液枪取500ul与200ml超纯水中，搅拌加热，搅拌速度450转左右，至煮沸。

③在搅拌的条件下，取3ml1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，至于4℃保存备用。

④取60ul金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在530nm处的摩尔消光系数3.0×10⁹M^-1cm^-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM.

所述的制备方法，优选将Linker（含-SH）修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：

① 取1 mL纳米金溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3 nM，移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；

② 室温放置30 min后，加入150 μL浓度为30 μM的修饰了-SH的底物探针（Linker），混合均匀后，4 ℃下放置24 h；

③ 分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液；取出磁子，4 ℃放置48 h；

④ 将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）。

该发明的检测方式是纳米金比色检测，利用DNA链将金纳米粒子间距离拉近，使其产生聚沉，从而产生颜色的变化。在检测之前，先通过Au-S键将Linker修饰到金纳米粒子表面。然后将反应后的均相溶液与标有Linker的纳米金粒子混合，然后在37℃孵育完成链置换的循环放大过程。最后，通过检测溶液的紫外吸收光谱进行目标物的检测。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，利用“T-Hg²⁺-T”的错配结构，将Arch与Trigger形成的桥型结构打开，利用链置换等温放大特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补汞离子现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用“T-Hg²⁺-T”的特异性结合实现了对目标物汞离子的高特异性检测；

2、利用链置换循环放大功能，实现了Trigger的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物汞离子的超灵敏性检测；

3、该传感器的反应条件温和，反应速度快；

4、由于使用纳米金比色法，其检测方法操作简便、检测周期短、易携带；

5、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

6、制备方法简单，性能稳定，纳米金比色的重复性好，适用于食品安全及水体中汞离子的检测和生物传感器产业化的实际应用；

7、制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1传感器检测的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）进行金纳米粒子的制备；

（2）将Linker修饰到金纳米粒子表面；

（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合。

所述的制备方法，优选纳米金粒子的制备操作步骤如下：

①安装好所需仪器，向三口烧瓶中加入200ml超纯水（注意不要让三口烧瓶中落入灰尘）；

②取500uL（0.04g/ml）HAuCl₄于单个包装的离心管中，用移液枪取500ul与200ml超纯水中，搅拌加热，搅拌速度450转左右，至煮沸；

③在搅拌的条件下，取3ml 1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，至于4℃保存备用；

④取60ul金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在530nm处的摩尔消光系数3.0×10⁹M^-1cm^-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM；

① 取1 mL纳米金溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；

③ 分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液。取出磁子，4 ℃放置48 h；

该发明的检测方式是纳米金比色检测，利用DNA链将金纳米粒子间距离拉近，使其产生聚沉，从而产生颜色的变化。在检测之前，先通过Au-S键将Linker修饰到金纳米粒子表面。然后将反应后的均相溶液与标有Linker的纳米金粒子混合，然后在37℃水浴1 h完成链置换的循环放大过程。最后，通过检测溶液的紫外吸收光谱进行目标物的检测。反应原理图如图1所示。

所述的制备方法，优选将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合，37 ℃水浴下反应1 h。

实施例1

一种本发明所述基于链置换的纳米金比色法检测汞离子的生物传感器的制备方法：

将Linker修饰到金纳米粒子表面的步骤如下：

a、取1 mL纳米金溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；

b、室温放置30 min后，加入150 μL浓度为30 μM的修饰了-SH的底物探针（Linker），混合均匀后，4 ℃下放置24 h；

c、分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液。取出磁子，4 ℃放置48 h；

d、将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）。

至此金纳米粒子的修饰完成，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将Trigger（4μL， 10μM），Arch（4μL，10μM）, HAP1（2μL，20μM），HAP2（2μL，20μM）,5*PBS（8μL）和不同浓度的待测物Hg²⁺（终浓度为0 nm，5 nm，10 nm，50 nm，100 nm，500 nm，1 μM，5 μM，10 μM）加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应30 min；

b、将反应好的溶液从水浴锅中取出，再加入标记好的纳米金溶液（20μL）, 放入37℃的水浴锅中反应1 h；

c、 1 h后，从水浴锅中取出混合溶液。观察颜色变化，并且用紫外可见分光光度计测定混合溶液的吸收值，据此检测目标物。

检测结果如图2所示，图中我们可以看到，当Hg²⁺浓度在5 nM到10 μM时吸光值不断减小，反应稳定进行。在汞离子的浓度在5 nM 到 10 μM时，汞离子浓度的对数与紫外吸收峰值的大小成正比关系，拟合曲线：A = 0.430*logC -0.049（A是紫外吸收峰值，C是汞离子的浓度），同时，我们在5 nM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于5 nM时，紫外吸收峰值与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的吸收峰值的最高点因此可得到该方法的检测下限为5 nM。

。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>济南大学

<120>一种检测二价汞离子的生物传感器及其制备方法

<160>2

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(16)

<223>引物

<400>1

TTT TTT AGG CTA CGA G 16

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>2

GTT CTT TGC TTT TTT GCT TTG TTC 24

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>引物

<400> 3

GAA CAA AGC GCA AAG AAC 18

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(44)

<223>引物

<400> 4

CTC GTA GCC TGT TCT TTG CGC TTT GTT CAG 30

GTG TAG ATG AAC AA 44

210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(44)

<223>引物

<400> 5

CTC GTA GCC TTC TAC ACC TGA ACA AAG CGC 30

AAA GAA CTT GTT CA 44

Claims

1.一种检测二价汞离子的生物传感器，其特征在于，由以下步骤制备而成：

（1）金纳米粒子的制备；

（2）将含-SH 的Linker修饰到金纳米粒子表面；

（3）将标记的纳米金溶液与均相溶液混合进行均相反应。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，步骤（1）的操作步骤具体如下：

（1）向三口烧瓶中加入200ml超纯水；

（2）用移液枪取500ul 0.04g/ml HAuCl₄与200ml超纯水中，搅拌加热，搅拌速度450转，至煮沸；

（3）在搅拌的条件下，取3ml 1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，置于4℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，步骤（2）中将含-SH 的Linker修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：

（1）取1 mL金纳米粒子溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用；离心至上清液无色透明，去除上清液，加入灭菌水使纳米金溶液浓缩至3 nM，移取1 mL于玻璃瓶中，用锡箔纸封口；

（2）室温放置30 min后，加入150 μL浓度为30 μM的修饰了-SH的底物探针Linker，混合均匀后，4 ℃下放置24 h；

（3）分次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液；取出磁子，4 ℃放置48 h；

（4）将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液；再加入1 mL灭菌水离心两次。

4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，步骤（3）的具体操作步骤如下：

（1）将2μL，20μM HAP1；4μL， 10μM Trigger；4μL，10μM Arch； 2μL，20μM HAP2；8μL 5*PBS和待测物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应30 min；

(2）将反应好的溶液从水浴锅中取出，再加入步骤（2）制备的标记好的纳米金溶液20μL, 放入37℃的水浴锅中反应1 h，从水浴锅中取出混合溶液，观察颜色变化，并且用紫外可见分光光度计测定混合溶液的吸收值，检测目标物。