CN108226074A - 基于比色荧光双通道的纳米模拟酶及其在分析检测中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于碳点‑血红素模拟过氧化物酶复合纳米材料,通过此纳米材料建立了可见和荧光双通道可视化检测过氧化氢、葡萄糖和黄嘌呤的方法。此方法通过碳点‑血红素过氧化物模拟酶催化过氧化氢氧化苯酚与4‑氨基安替比林,形成稳定的红色显色产物,该显色产物的最大吸收峰为505 nm;同时,该碳点‑血红素纳米材料在激发波长为480 nm处,发射光谱为540 nm处的反应液的荧光发生淬灭。因此,显色产物在505 nm处吸光度以及在发射光谱为540 nm处的荧光猝灭信号分别与过氧化氢、葡萄糖和黄嘌呤在1.7×10‑7‑2×10‑4 M、1.7×10‑7‑1.3×10‑4 M和3.3×10‑6‑3.3×10‑5 M范围内呈线性关系。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术和纳米技术领域,具体涉及一种同时具有可见和荧光的双通道的可视化检测的纳米酶,所述模拟酶为一种碳点和血红素复合材料,催化过氧化氢氧化苯酚与4-氨基安替比林,形成稳定的红色显色产物,并建立一种双通道检测过氧化氢、葡萄糖和黄嘌呤的分析方法。
背景技术
天然酶具有催化效率高、底物选择特异性强、催化反应类别广等优点,然而天然酶在实际应用中也存在明显的缺陷,比如生产成本高、使用条件苛刻、价格昂贵等缺点也成为了制约天然酶在生产实践应用中的关键因素,因此人工模拟酶的开发和应用研究越来越引起人们的关注。
自2007年发现四氧化三铁纳米材料具有过氧化物酶的活性之后(L. Gao, J.Zhuang, et al.,Nat. Nanotechnol. 2 (2007) 577-583.),越来越多的纳米材料被发现具有模拟酶的活性,比如:金属氧化物纳米材料(L. Hong, A.-L. Liu, et al., Biosens.Bioelectron., 43 (2013) 1-5.)、碳纳米材料(L. Lin, X. Song, et al., Anal. Chim.Acta, 869 (2015) 89-95.)、贵金属纳米材料(Y. Jv, B. Li, et al., Chem. Commun.,46 (2010) 8017-8019.)等。与天然酶相比,纳米材料模拟酶具有制备过程简单、容易大规模制备、性质稳定、可重复使用、对外界环境耐受性强等优点,才使得纳米材料模拟酶被广泛应用于重金属检测、有机污染物降解、食品添加剂及农药残留检测、生物医学领域检测以及疾病治疗。但大部分的纳米模拟酶多为单一的利用紫外-可见可视化分析方法,但是单一的信号易受基底的干扰,导致检测结果不可靠;而基于紫外-可见和荧光的双通道可视化分析方法不仅可以通过比较或测量有色物质溶液颜色深度确定目标物浓度,还可以通过荧光信号的变化来识别被检测物质。而且双通道的信号输出可以作为自身对照,一方面大幅度地抵消环境基底的影响,信号更稳定,不容易受到干扰;另一方面其兼具紫外分析肉眼可见、荧光分析灵敏、可用于现场检测等优点。
发明内容
本发明提供了一种新型的具有紫外-可见和荧光的双通道可视化检测的纳米模拟酶复合材料,同时建立了双通道分析的新方法,并成功的应用于双氧水、葡萄糖和黄嘌呤的检测。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是,一种基于比色荧光双通道的纳米模拟酶,所述纳米模拟酶为碳点与血红素纳米复合物,所述碳点与血红素纳米复合物的制备方法如下:取碳点和血红素的乙醇溶液,将血红素的乙醇溶液和碳点混合均匀,然后加入乙醇,混合均匀,搅拌反应5~10h,离心分离出上清液,沉淀用乙醇洗涤,烘干,即得到所述的碳点与血红素纳米复合物。
优选的,所述碳点与血红素纳米复合物的制备方法如下:称取0.3448 g碳点放于50 mL圆底烧瓶中,加入1mL 5mg / mL血红素的乙醇溶液,混合均匀后再加入3 mL乙醇,混合均匀,加入磁子,室温下磁力搅拌7 h,将搅拌反应后得到的混合物离心分离(10000 rpm/ min, 10 min),弃去上清液,沉淀用乙醇洗涤3遍,在60 ℃ 环境中烘干4 h得到所述的碳点与血红素纳米复合物。
优选的,所述碳点的制备方法如下:
(1)称取3.0 g柠檬酸、6.0 g尿素于50 mL烧杯中,用量筒量取20 mL N , N -二甲基甲酰胺加入到放置柠檬酸与尿素的烧杯中,用玻璃棒搅拌,使柠檬酸与尿素完全溶解在N , N- 二甲基甲酰胺中;
(2)将步骤(1)所得溶液转移到50 mL的反应釜中,拧紧釜盖后放入鼓风干燥箱中,将反应温度设为160 ℃,反应6 h,反应结束后自然冷却至室温;
(3)将冷却至室温的反应液离心分离,弃去上清液,得到的固体用1M的氢氧化钠乙醇溶液离心洗涤5次(10000 rpm / min, 5 min), 离心得到的固体在60 ℃ 环境中烘干4 h得到所述的碳点。
本发明产生的有益效果是,本发明所述的碳点与血红素纳米复合材料具有过氧化物模拟酶的性质,可催化过氧化氢氧化苯酚与4-氨基安替比林,形成稳定的红色显色产物,实现可见检测,同时,碳点与血红素纳米复合材料的荧光信号猝灭,实现荧光检测。此新型的具有双通道检测特性的过氧化物模拟酶,可用于过氧化氢、葡萄糖以及黄嘌呤的可见荧光检测的新方法。该方法测定过氧化氢的线性范围1.7×10-7-2×10-4 M;测定葡萄糖的线性范围为1.7×10-7-1.3×10-4 M;测定黄嘌呤的线性范围为3.3×10-6-3.3×10-5 M。
附图说明
图1 为本发明的碳点与血红素纳米复合材料的透射电镜图;
图2 为本发明的碳点与血红素纳米复合材料的红外图;
图3 为本发明的碳点与血红素纳米复合材料的紫外可见图;
图4 为本发明的碳点与血红素纳米复合材料在37 ℃时对过氧化氢氧化苯酚与4-氨基安替比林反应的紫外-可见吸收光谱图,图中a为含有过氧化氢、苯酚、4-氨基安替比林和碳点与血红素纳米复合材料的反应液,b为单独碳点与血红素纳米复合材料;
图5 为本发明的碳点与血红素纳米复合材料在37 ℃时对过氧化氢氧化苯酚与4-氨基安替比林反应的荧光光谱图,图中a为单独碳点与血红素纳米复合材料荧光发射光谱图,图中b为含有过氧化氢、苯酚、4-氨基安替比林和碳点与血红素纳米复合材料的反应液,c为不含碳点与血红素纳米复合材料;
图6为本发明的碳点与血红素纳米复合材料模拟酶以苯酚和4-氨基安替比林为底物测定过氧化氢的浓度与紫外-可见吸光度的关系图;
图7为本发明的碳点与血红素纳米复合材料模拟酶以苯酚和4-氨基安替比林为底物测定过氧化氢的浓度与荧光光谱的关系图;
图8为本发明的碳点与血红素纳米复合材料模拟酶以苯酚和4-氨基安替比林为底物测定葡萄糖的浓度与紫外-可见吸光度的关系图;
图9为本发明的碳点与血红素纳米复合材料模拟酶以苯酚和4-氨基安替比林为底物测定葡萄糖的浓度与荧光光谱的关系图;
图10为本发明的碳点与血红素纳米复合材料模拟酶以苯酚和4-氨基安替比林为底物测定黄嘌呤的浓度与紫外-可见吸光度的关系图;
图11为本发明的碳点与血红素纳米复合材料模拟酶以苯酚和4-氨基安替比林为底物测定黄嘌呤的浓度与荧光光谱的关系图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
碳点的制备:
(1)称取3.0 g柠檬酸、6.0 g尿素于50 mL烧杯中,用量筒量取20 mL N , N -二甲基甲酰胺加入到放置柠檬酸与尿素的烧杯中,用玻璃棒搅拌,使柠檬酸与尿素完全溶解在N , N- 二甲基甲酰胺中;
(2)将步骤(1)所得溶液转移到50 mL的反应釜中,拧紧釜盖后放入鼓风干燥箱中,将反应温度设为160 ℃,反应6 h,反应结束后自然冷却至室温;
(3)将冷却至室温的反应液离心分离,弃去上清液,得到的固体用1M的氢氧化钠乙醇溶液离心洗涤5次(10000 rpm / min,5 min), 离心得到的固体在60 ℃ 环境中烘干4 h得到所述的碳点。
称取0.3448 g碳点放于50 mL圆底烧瓶中,加入1mL 5mg / mL血红素的乙醇溶液,混合均匀后再加入3 mL乙醇,混合均匀,加入磁子,室温下磁力搅拌7 h,将搅拌反应后得到的混合物离心分离(10000 rpm / min,10 min),弃去上清液,沉淀用乙醇洗涤3遍,在60 ℃ 环境中烘干4 h得到所述的碳点与血红素纳米复合物。
此碳点与血红素纳米复合材料的粒径为10 nm。图1a为本发明制备碳点的透射电镜图, 图1b为本发明制备的碳点与血红素复合物的透射电镜图。碳点与血红素复合物的红外表征结果如图2所示;图3为所制备碳点与血红素复合物的紫外可见吸收光谱。
碳点与血红素纳米复合材料的紫外-可见和荧光特性
(1)0.1 M过氧化氢储备液的配制:用移液枪取0.1 mL 10 M的过氧化氢于10 mL的棕色试剂瓶中,加入9.9 mL 二次水,盖盖摇匀备用;
(2)50 mM过氧化氢的配制:用移液枪取5 mL 0.1 M的上述过氧化氢溶液于10 mL的棕色试剂瓶中,加入5 mL二次水,盖盖摇匀备用;
(3)10 mM过氧化氢的配制:用移液枪取1 mL 50 mM的上述过氧化氢溶液于10 mL的棕色试剂瓶中,加入9 mL二次水,盖盖摇匀备用;
(4) 将实施例1中的碳点-血红素纳米复合材料取一定量固体粉末溶于二次水配成1mg / mL 的溶液;
(5) 6 mM苯酚的配制:用分析天平称取0.00112 g 苯酚于20 mL棕色瓶中,用移液枪加入20 mL二次水,超声摇匀备用;
(6) 6 mM 4 - 氨基安替比林的配制:用分析天平称取0.0244g 4 - 氨基安替比林于20 mL棕色瓶中,用移液枪加入20 mL二次水,超声摇匀备用;
(7) 依次分别加入10 mM过氧化氢0.1mL,6 mM苯酚溶液0.2 mL,6 mM 4 - 氨基安替比林0.1 mL,1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料0.2 mL,二次蒸馏水2.4 mL,摇匀,在37℃恒温水浴下反应10分钟后拿出;
(8) 以1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,加上二次蒸馏水2.8 mL为空白对照,在200 nm - 700 nm波长范围内测定吸收光谱(如图4);
(9) 以1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,加上二次蒸馏水2.8 mL为空白对照,以480nm为激发波长,在490 nm - 700 nm发射波长范围内测定荧光光谱(如图5)。
从图4和图5的数据显示中可以看出碳点与血红素纳米复合材料具有过氧化物模拟酶的性质,可催化过氧化氢氧化苯酚与4-氨基安替比林,形成稳定的红色显色产物,实现可见检测,同时,碳点与血红素纳米复合材料的荧光信号猝灭,实现荧光检测。
纳米模拟酶及其在分析检测中应用
应用1:过氧化氢的检测
(1)配置不同浓度的过氧化氢(包括0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10 mmol /L)、6mM苯酚、6 mM 4 - 氨基安替比林和1 mg / mL 的碳点-血红素纳米复合材料溶液(参照实施例1);
(2)在离心管中分别加入上述不同浓度的过氧化氢0.1 mL,6 mM苯酚溶液0.2 mL,6 mM4 - 氨基安替比林0.1 mL,1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,二次蒸馏水2.4 mL,摇匀,在37℃恒温水浴下反应10分钟后拿出;
(3)以1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,加上二次蒸馏水2.8 mL为空白对照,用紫外分光光度计在200 nm - 700 nm波长范围内测定不同浓度过氧化氢体系下的吸收光谱,随着过氧化氢浓度的增加,吸光度值越大(如图6),其最大吸收波长在490 nm左右;
(4)以1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,加上二次蒸馏水2.8 mL为空白对照,以480nm为激发波长,在490 nm - 700 nm发射波长范围内测定不同浓度过氧化氢体系下的荧光强度,随着过氧化氢浓度增加,荧光强度逐渐降低(如图7),其最大发射波长在540 nm左右。
反应结果不但能从反应液颜色的变化显现出来,也能用荧光的方法表示,从而实现了双通道测试过氧化氢。
应用2:葡萄糖的检测
(1)配置不同浓度的葡萄糖溶液(浓度包括0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10 mmol /L)和葡萄糖氧化酶10 mg / mL;
(2)在离心管中分别加入不同浓度的葡萄糖溶液0.1 mL,再加入10 mg / mL葡萄糖氧化酶5μl ,在37℃恒温水浴下反应30分钟后拿出;
(3)分别向上述反应液中加入6 mM苯酚溶液0.2 mL,6 mM 4 - 氨基安替比林0.1 mL,1mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,二次蒸馏水2.4 mL,摇匀,在37℃恒温水浴下反应10分钟后拿出;
(4)以1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,加上二次蒸馏水2.8 mL为空白对照,用紫外分光光度计在200 nm - 700 nm波长范围内测定不同浓度葡萄糖溶液体系下的吸收光谱,随着过葡萄糖溶液浓度的增加,反应液的红色越深(如图8),其最大吸收波长在490 nm左右;
(5)以1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,加上二次蒸馏水2.8 mL为空白对照,以480nm为激发波长,在490 nm - 700 nm发射波长范围内测定不同浓度葡萄糖溶液体系下的荧光强度,随着葡萄糖浓度增加,荧光强度逐渐降低(如图9),其最大发射波长在536 nm左右。反应结果实现了双通道检测葡萄糖。
应用3:黄嘌呤的检测
(1)6 mM黄嘌呤储备液的制备:用分析天平称取黄嘌呤0.0091 g,将其初步溶于2 mL的0.1 mol / l的氢氧化钠溶液,待其全部溶解以后,向其加入8 mL的pH = 7.4,0.1 mol /L的PBS,调节pH接近中性;
(2)5 mM黄嘌呤储备液的制备:用移液枪取2 mL 6 mM的上述黄嘌呤溶液于5 mL的棕色试剂瓶中,加入0.4 mL的pH = 7.4,0.1 mol / l的PBS,盖盖摇匀备用;
(3)按照上述步骤(2)依次稀释黄嘌呤储备液,得到不同浓度的黄嘌呤储备液(浓度有:0.005、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、4、5、6 mmol /L);
(4)2 U / mL黄嘌呤氧化酶的制备:原黄嘌呤氧化酶浓度为14 U /mL,用移液枪取原黄嘌呤氧化酶17.1μl ,向其加入102.9μl 的二次蒸馏水,混合均匀后备用;
(5)在离心管中分别加入不同浓度的黄嘌呤溶液0.1 mL,再加入2 U / mL黄嘌呤氧化酶10μl ,在37℃恒温水浴下反应30分钟后拿出;
(6)分别向上述反应液中加入6 mM苯酚溶液0.2 mL,6 mM 4 - 氨基安替比林0.1 mL,1mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,二次蒸馏水2.4 mL,摇匀,在37℃恒温水浴下反应10分钟后拿出;
(7)以1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,加上二次蒸馏水2.8 mL为空白对照,用紫外分光光度计在200 nm - 700 nm波长范围内测定不同浓度黄嘌呤溶液体系下的吸收光谱,随着过黄嘌呤溶液浓度的增加,反应液的红色越深(如图10),其最大吸收波长在490 nm左右;
(8)以1 mg / mL 碳点-血红素纳米复合材料溶液0.2 mL,加上二次蒸馏水2.8 mL为空白对照,以480nm为激发波长,在490 nm - 700 nm发射波长范围内测定不同浓度黄嘌呤溶液体系下的荧光强度,随着黄嘌呤浓度增加,荧光强度逐渐降低(如图11),其最大发射波长在540 nm左右。反应结果实现了双通道检测黄嘌呤。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种基于比色荧光双通道的纳米模拟酶,所述纳米模拟酶为碳点与血红素纳米复合物,其特征在于所述碳点与血红素纳米复合物的制备方法如下:取碳点和血红素的乙醇溶液,将血红素的乙醇溶液和碳点混合均匀,然后加入乙醇,混合均匀,搅拌反应5~10h,离心分离出上清液,沉淀用乙醇洗涤,烘干,即得到所述的碳点与血红素纳米复合物。
2.如权利要求1所述的 基于比色荧光双通道的纳米模拟酶,其特征在于所述碳点与血红素纳米复合物的制备方法如下:称取0.3448 g碳点放于50 mL圆底烧瓶中,加入1mL 5mg/ mL血红素的乙醇溶液,混合均匀后再加入3 mL乙醇,混合均匀,加入磁子,室温下磁力搅拌7 h,将搅拌反应后得到的混合物10000 rpm / min下离心分离10 min,弃去上清液,沉淀用乙醇洗涤3遍,在60℃烘干4 h得到所述的碳点与血红素纳米复合物。
3.如权利要求1或2所述的基于比色荧光双通道的纳米模拟酶,其特征在于,所述碳点的制备方法如下:
(1)称取3.0 g柠檬酸、6.0 g尿素于50 mL烧杯中,用量筒量取20 mL N , N -二甲基甲酰胺加入到放置柠檬酸与尿素的烧杯中,用玻璃棒搅拌,使柠檬酸与尿素完全溶解在N , N- 二甲基甲酰胺中;
(2)将步骤(1)所得溶液转移到50 mL的反应釜中,拧紧釜盖后放入鼓风干燥箱中,将反应温度设为160 ℃,反应6 h,反应结束后自然冷却至室温;
(3)将冷却至室温的反应液离心分离,弃去上清液,得到的固体用1M的氢氧化钠乙醇溶液离心洗涤5次, 离心得到的固体在60℃烘干4 h得到所述的碳点。
4.如权利要求1所述的基于比色荧光双通道的纳米模拟酶在过氧化氢检测中的应用。
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