CN111157472A - 一种利用酶标仪快速测定烟草中葡萄糖含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用酶标仪快速测定烟草中葡萄糖含量的方法。包括样品前处理、标准工作曲线绘制、样品溶液葡萄糖浓度推算、准确定量计算。本发明首创将酶标仪用于烟草及烟草制品中葡萄糖含量的快速准确定量，烟草样品中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性的4‑氨基安替比林与酚偶联缩合成有紫外吸收的醌类化合物，用酶标仪在505nm处比色测定，依据吸光度与葡萄糖的定量关系推算出样品中的葡萄糖的含量。该方法操作简便、快速、分析效率高、准确度和精密度高、稳定性好，具有良好的应用前景。

Description

一种利用酶标仪快速测定烟草中葡萄糖含量的方法
技术领域
本发明属于烟草成分检测技术领域，具体是涉及一种利用酶标仪对烟草及烟草制品中的葡萄糖含量进行快速准确检测的方法。
背景技术
烟草中的水溶性糖主要为葡萄糖、果糖、蔗糖，是烟草内重要的碳水化合物，在烟草燃吸过程中能调整适度的酸碱平衡，使吃味醇和，增加烟气的和顺性，与烟草品质密切相关。目前烟草行业常用芒森·沃克法(即费林试剂法)和连续流动分析法测定烟草中水溶性的还原糖和总糖，但这些方法只能测总糖量，不能测定单个成分的含量。随着烟草分析已逐渐从宏观深入到微观，对糖的分析也不应仅局限于水溶性总糖和水溶性还原糖的分析，应深入了解各种单糖的含量和对烟草品质的影响，因此对烟草中葡萄糖、果糖和蔗糖的测定显得愈来愈重要。
目前，对烟草中葡萄糖的测定主要采用离子色谱法、近红外光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等，但离子色谱法仪器昂贵，维护费用高，且操作繁琐；近红外光谱法必需先建立模型，不能用于直接检测；气相色谱需衍生化，操作较麻烦；高效液相色谱法前处理也较麻烦，如需用固相萃取柱预分离等；毛细管电泳法也需要对糖衍生化或使糖带电，才能进行分离检测。
新兴的酶标仪检测法，利用酶的专一性实现对样品中待测物质含量的准确定量，该方法能同时测量几十个样品，适用于大批量样品的快速检测，操作简便、易于推广。但目前还未见有利用该方法检测烟草中葡萄糖含量的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种快速、简便、能够准确测定烟草中葡萄糖含量的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。
一种利用酶标仪快速测定烟草中葡萄糖含量的方法，具体采用以下步骤：
(1)样品前处理：
将烟草或烟草制品置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎机研磨，过40目筛后得到烟末样品，取0.1g烟末样品于三角瓶中，加20mL水萃取样品中的葡萄糖，振荡30min后过滤得到滤液，作为待测样品溶液备用；
(2)绘制标准工作曲线：
准确配制浓度为5.55mmol/L的葡萄糖标液，分别移取该葡萄糖标液5、25、50、75、100和150μL置于2mL微量离心管中，在每个离心管中分别加入葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒(以下简称：试剂盒)中的试剂R1和R2各1000μL混匀，于37℃水浴显色15min后分别转移至96孔酶标板的不同位置，得到葡萄糖浓度分别为0.014、0.069、0.135、0.201、0.264、0.387mmol/L的标准工作液，以溶液的葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准工作曲线方程：y＝2.941x+0.059，相关系数r2＝0.996；
(3)分析方法：
取待测样品溶液100μL置于2mL微量离心管中，分别加入试剂盒中的试剂R1和R2各1000μL混匀，于37℃水浴显色15min，转移至96孔酶标板中，以蒸馏水分析液为参比，用酶标仪于波长505nm处测定吸光度，由标准工作曲线推算出待测样品溶液的葡萄糖浓度；
(4)结果计算：
将待测样品溶液的葡萄糖浓度值代入公式(1)，计算待测样品的葡萄糖含量，并以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果；
Figure BDA0002357654720000031
P—待测样品中的葡萄糖含量，单位为百分比(％)；
C待测—待测样品溶液的葡萄糖浓度，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
VR1—试剂盒R1试剂的加入体积，单位为毫升(mL)；
VR2—试剂盒R2试剂的加入体积，单位为毫升(mL)；
V样品—待测样品溶液的加入体积，单位为毫升(mL)；
V萃取—样品萃取剂的体积，单位为毫升(mL)；
0.18016—葡萄糖的物质的量，单位为克每毫摩尔(g/mmol)；
m—待测样品质量，单位为克(g)；
w—待测样品水份含量，单位为百分比(％)。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明首创将酶标仪用于烟草及烟草制品中葡萄糖含量的快速准确定量。烟草样品中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性的4-氨基安替比林与酚偶联缩合成有紫外吸收的醌类化合物，用酶标仪在505nm处比色测定，依据吸光度与葡萄糖的定量关系推算出样品中的葡萄糖含量。该方法的最大线性浓度为0.3436mmol/L，依据10次重复测量最低浓度标准溶液标准偏差的3倍和10倍分别计算出该方法的检出限和定量限分别为0.0016mmol/L、0.0054mmol/L；3个不同葡萄糖含量的样品3次重复测量的变异系数范围为2.19％-3.30％；3批重复测量的变异系数范为2.94％；添加20μg时3个样品的回收率范围为98.14％～107.37％，添加40μg时3个样品的回收率范围为97.75％～102.92％，计算每个回收率的三次平行测量的变异系数范围为3.59％～6.87％。该方法操作简便、快速、分析效率高、准确度和精密度高、稳定性好，具有良好的应用前景。
附图说明
图1标准工作曲线
图2线性范围
图3样品萃取剂的影响(n＝3)
图4显色反应时间的影响(n＝3)
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。
实施例1
1.实验原理、材料及方法
1.1实验原理
烟叶样品中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性的4-氨基安替比林与酚偶联缩合成有紫外吸收的醌类化合物，用酶标仪在505nm处比色测定，依据吸光度与葡萄糖间的定量关系推算出样品中的葡萄糖含量。
1.2材料与仪器
葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)；样品1#、2#、3#为2017年全国烟草连续流动分析仪共同实验样品。
METLER AE200分析天平(感量：0.0001g，瑞士METLER TOLEDO公司)；BRAN LUEBBEAA3连续流动分析仪(德国BRAN LUEBBE公司)；101A-2干燥箱(上海市实验仪器总厂)；多功能酶标仪工作站(美国Molecular Devices公司)；LC1200高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；恒温水浴锅(上海赫田科学仪器有限公司)；Millipore AQUELIX5纯水机(美国MERCK Millipore公司)。
1.3样品的处理及分析
将烟草样品置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎机研磨，过40目筛后得到烟末样品，取0.1g烟末样品于三角瓶中，加20mL水萃取，振荡30min后过滤得到滤液；配制葡萄糖标液，分别加入试剂R1(主要成分为苯酚)和R2(主要成分为磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、4-氨基安替比林、POD、NaN3、GOD)各1000μL混匀，水浴显色后移至96孔酶标板，得到不同浓度的标准工作液，绘制标准工作曲线，如图1；取滤液100μL于2mL微量离心管中，分别加入1000μL试剂R1和R2混匀，于37℃水浴显色15min，转移至96孔酶标板中，以蒸馏水分析液为参比，用酶标仪于波长505nm处测定吸光度，由标准工作曲线推算出滤液的葡萄糖浓度，代入公式(1)得到待测烟草样品的葡萄糖含量，并以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果。
待测样品中葡萄糖的含量按公式(1)计算：
Figure BDA0002357654720000051
P—待测样品中的葡萄糖含量，单位为百分比(％)；
C待测—待测样品溶液的葡萄糖浓度，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
VR1—试剂盒R1试剂的加入体积，单位为毫升(mL)；
VR2—试剂盒R2试剂的加入体积，单位为毫升(mL)；
V样品—待测样品溶液的加入体积，单位为毫升(mL)；
V萃取—样品萃取剂的体积，单位为毫升(mL)；
0.18016—葡萄糖的物质的量，单位为克每毫摩尔(g/mmol)；
m—待测样品质量，单位为克(g)；
w—待测样品水份含量，单位为百分比(％)。
1.4结果计算
以两次平行测定的平均值为最终测定结果，精确至0.01，两次平行测定结果绝对值之差不应超过5％。
2.结果与讨论
2.1条件优化
2.1.1样品萃取剂的影响
为将烟草中的葡萄糖充分萃取，实验考察了样品萃取剂的影响。取样品1#、2#、3#按照1.3部分进行样品前处理，在其它条件不变的情况下，分别用水和5％乙酸进行萃取，考察其对吸光度的影响。从图3可知：3个样品用水萃取的吸光度(3次测定平均值)均大于5％乙酸，表明水能将葡萄糖充分萃取出来，故选择水作为样品萃取剂。
2.1.2显色反应时间的影响
精密吸取2μL葡萄糖标液(5.55mmol/L)，按1.3部分进行显色，分别在0、5、10、15、20min不同时间点进行吸光度值测定。由图4可知，吸光度值最初随反应时间的延长而增大，在15min时到达峰值，而当反应时间超过15min时，吸收值又会略微有所衰减，因此，选择显色时间为15min。
2.2方法学考察
2.2.1线性范围及检出限、定量限
从5μL开始，以5μL为间隔(当加入量大于110μL后，以10μL为间隔)，分别移取浓度为5.55mmol/L的葡萄糖标液，于2mL微量离心管中，加入试剂R1、R2各1000μL混匀，于37℃水浴显色15min后分别移取至96孔酶标板的不同位置，测量溶液的葡萄糖浓度，绘制图2，考察本方法的线性范围。当溶液中葡萄糖浓度达0.3436mmol/L时，r2仍然可达0.999。
在样品检测时，分别移取5.55mmol/L的葡萄糖标液5、25、50、75、100和150μL配制葡萄糖浓度分别为0.014、0.069、0.135、0.201、0.264、0.387mmol/L的标准工作液。
取最低浓度标准工作液，重复测定10次的标准偏差(SD)为0.00054mmol/L，按照3倍SD、10倍SD计算得出本方法的检出限和定量限分别为0.0016、0.0054mmol/L。
2.2.2重复性
将3个样品分别连续检测3次，结果见表1。变异系数范围为2.19～3.30％，变异系数均低于5％，说明该方法的精密度高。
表1重复性
Figure BDA0002357654720000071
2.2.3稳定性
将葡萄糖标液体积为40μL的标准工作液分别在不同时间检测3批，结果见表2。变异系数为2.94％，小于3％，说明该法稳定性好。
表2稳定性
Figure BDA0002357654720000072
*每个数据为3次平行测量的平均值
2.2.4加标回收率
在已知含量的样品中加入一定量的葡萄糖，比较实测添加量和理论添加量得到回收率。添加20μg时3个样品的回收率范围为98.14％～107.37％，添加40μg时3个样品的回收率范围为97.75％～102.92％，计算每个回收率的三次平行测量的变异系数范围为3.59％～6.87％(见表3)，3个样品在2个添加量水平的回收率都在90～110％的范围内，说明该检测方法结果准确、可靠。
表3样品测定及加标回收率(n＝3)
Figure BDA0002357654720000081
*为三次测量的平均值
3.结论
该方法操作简便、快速，分析效率高，准确度和精密度高、稳定性好，能够满足对烟草及烟草制品中的葡萄糖含量进行大批量、快速检测的需要。

Claims (1)

1.一种利用酶标仪快速测定烟草中葡萄糖含量的方法，具体采用以下步骤：
(1)样品前处理：
将烟草或烟草制品置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎机研磨，过40目筛后得到烟末样品，取0.1g烟末样品于三角瓶中，加20mL水萃取样品中的葡萄糖，振荡30min后过滤得到滤液，作为待测样品溶液备用；
(2)绘制标准工作曲线：
准确配制浓度为5.55mmol/L的葡萄糖标液，分别移取该葡萄糖标液5、25、50、75、100和150μL置于2mL微量离心管中，在每个离心管中分别加入葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒(以下简称：试剂盒)中的试剂R1和R2各1000μL混匀，于37℃水浴显色15min后分别转移至96孔酶标板的不同位置，得到葡萄糖浓度分别为0.014、0.069、0.135、0.201、0.264、0.387mmol/L的标准工作液，以溶液的葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准工作曲线方程：y＝2.941x+0.059，相关系数r2＝0.996；
(3)分析方法：
取待测样品溶液100μL置于2mL微量离心管中，分别加入试剂盒中的试剂R1和R2各1000μL混匀，于37℃水浴显色15min，转移至96孔酶标板中，以蒸馏水分析液为参比，用酶标仪于波长505nm处测定吸光度，由标准工作曲线推算出待测样品溶液的葡萄糖浓度；
(4)结果计算：
将待测样品溶液的葡萄糖浓度值代入公式(1)，计算待测样品的葡萄糖含量，并以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果；
Figure FDA0002357654710000011
P—待测样品中的葡萄糖含量，单位为百分比(％)；
C待测—待测样品溶液的葡萄糖浓度，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
VR1—试剂盒R1试剂的加入体积，单位为毫升(mL)；
VR2—试剂盒R2试剂的加入体积，单位为毫升(mL)；
V样品—待测样品溶液的加入体积，单位为毫升(mL)；
V萃取—样品萃取剂的体积，单位为毫升(mL)；
0.18016—葡萄糖的物质的量，单位为克每毫摩尔(g/mmol)；
m—待测样品质量，单位为克(g)；
w—待测样品水份含量，单位为百分比(％)。
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