CN112557330A - 一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的连续流动法 - Google Patents

一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的连续流动法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的连续流动法。包括样品前处理、标准工作曲线绘制、样品分析和结果计算。烟草中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性的4‑氨基安替比林与酚偶联缩合成有紫外吸收的醌类化合物，再用连续流动分析仪在480nm处比色测定，依据吸光度与葡萄糖的定量关系即可推算出样品中的葡萄糖含量。该方法专一性强、操作简便快速、分析效率高、准确度和精密度高、稳定性好，能够满足对烟草和烟草制品中的葡萄糖含量进行大批量、快速、准确检测的需要，具有良好的应用前景。

Description

一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的连续流动法
技术领域
本发明属于烟草成分检测技术领域，具体是涉及一种运用连续流动分析技术并基于酶促反应对烟草及烟草制品中的葡萄糖含量进行快速准确测定的方法。
背景技术
烟草中的水溶性糖主要为葡萄糖、果糖、蔗糖，是烟草内重要的碳水化合物，在烟草燃吸过程中能调整适度的酸碱平衡，使吃味醇和，增加烟气的和顺性，与烟草品质密切相关。目前烟草行业常用芒森·沃克法(即费林试剂法)和连续流动分析法测定烟草中水溶性的还原糖和总糖，但这些方法测定的都是总量，不能测定单个成分的含量。随着烟草分析技术发展，对糖的分析也不应仅局限于糖类总量的分析，应深入了解各种单糖的含量及其对烟草品质的影响，因此对烟草及烟草制品中葡萄糖等单糖的测定显得愈来愈重要。
目前，对烟草中葡萄糖的测定主要采用离子色谱法、近红外光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等，但离子色谱法仪器昂贵，维护费用高，且操作繁琐；近红外光谱法必需先建立模型，不能直接用于检测；气相色谱法、高效液相色谱法需衍生化，操作较麻烦，需用固相萃取柱预分离等；毛细管电泳法也需要对糖衍生化或使糖带电，才能进行分离检测。烟草检测技术人员正努力寻找一种更加简便、快速和准确的葡萄糖含量测定方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种运用连续流动分析技术并结合酶促反应实现的，能够快速、简便、准确测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。
一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
按照“YC/T31-1996烟草及烟草制品试样的制备和水份测定烘箱法”，将烟草或烟草制品置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎机研磨过40目筛后得到烟末样品，并测定其含水率；取0.1g烟末样品置于三角瓶中，加入20mL水振荡萃取30min后过滤，滤液作为待测样品溶液备用；
(2)样品分析
用连续流动分析仪分析样品溶液，得到葡萄糖仪器观测值：
①试剂：葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒中的试剂R1和R2；
②流路设置：试剂R1和R2经5匝混合圈混合后，与样品溶液经20匝混合圈混合，连续通过2个37℃、10.6mL的加热池在线发生显色反应，然后经由10匝混合圈进入连续流动分析仪；其中，样品溶液用橙/绿泵管，流速为0.10mL/min；试剂R1和R2用红/红泵管，流速为0.80mL/min；
③分析仪检测波长：480nm；检测速度：30个样品/h；进样/清洗时间比：1∶1；进样时间60s；基线校正：开通；
(3)绘制标准工作曲线
准确配制浓度为50.00mmol/L的葡萄糖标液，分别移取葡萄糖标液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00mL，用水定容至50mL，得到对应葡萄糖浓度分别为0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00mmol/L的标准工作液；
用步骤(2)相同方法分析标准工作液，绘制标准工作曲线，线性回归方程为：Y＝49.817x+0.2444，相关系数r2＝0.9989；再由标准工作曲线推算出待测样品溶液的葡萄糖浓度值；
(4)结果计算
将待测样品溶液的葡萄糖浓度值代入公式(1)，计算样品中的葡萄糖含量，并以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果；
Figure BDA0002820865660000031
式中：
GLU(％)—样品的葡萄糖含量，单位为质量百分数(％)；
0.18016—考虑萃取剂体积单位和葡萄糖摩尔质量的换算系数，单位为毫克每毫摩尔(mg/mmol)；
C—样品溶液的葡萄糖浓度值，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
V—萃取剂体积，单位为毫升(mL)；
G—样品质量，单位为克(g)；
W—样品的水份含量，单位为为质量百分数(％)。
相比现有技术，本发明具有以下优点：本发明首次结合酶促反应-连续流动分析技术用于烟草及烟草制品中葡萄糖含量的快速准确定量。烟草中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性的4-氨基安替比林与酚偶联缩合成有紫外吸收的醌类化合物，再用连续流动分析仪在480nm处比色测定，依据吸光度与葡萄糖的定量关系即可推算出样品中的葡萄糖含量。该方法的最大线性浓度为2.00mmol/L。依据10次重复测量最低浓度标准工作液标准偏差的3倍和10倍分别计算出该方法的检出限和定量限分别为0.0225、0.075mmol/L。3个不同葡萄糖含量的样品6次重复测量的变异系数范围为0.09-4.46％。3个样品3批重复测量的变异系数围为4.41-5.94％。在原含量为0.498mmol/L的样品溶液中添加量分别为0.40、0.80、1.20mmol/L时的回收率范围为98.50％～104.50％。以葡萄糖溶液的响应值为100.00％，除甘露糖、鼠李糖(一水合)有约2.5％的响应之外，其它6种物质均对检测无干扰。该方法专一性强、操作简便快速、分析效率高、准确度和精密度高、稳定性好，能够满足对烟草和烟草制品中的葡萄糖含量进行大批量、快速、准确检测的需要，具有良好的应用前景。
附图说明
图1标准工作曲线；
图2连续流动分析仪流路设计示意图；
图3葡萄糖及其结构类似物分子结构图；
图4干扰实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。
实施例1
1.实验原理、材料及方法
1.1实验原理
烟草中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性的4-氨基安替比林与酚偶联缩合成有紫外吸收的醌类化合物，用连续流动分析仪在480nm处比色测定，依据吸光度与葡萄糖间的定量关系就能够推算出样品中的葡萄糖含量。
1.2材料与仪器
用于精密性、回收率实验的样品A、B、C，为2017年全国烟草连续流动分析仪共同实验样品。
用于对比实验的1-7#样品：1#样品为3R4F监控样、2#样品为国内某品牌混合型卷烟样品、3#样品为国内某品牌烤烟型卷烟样品、4#样品为国内某品牌加热卷烟样品、5#样品为国内某品牌烤烟型卷烟样品、6#样品为国内某品牌造纸法再造烟叶、7#样品为国内某烟叶原料。
葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)；葡萄糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸(一水合)、葡萄糖醛酸均来自Sigma-Aldrich Co.(美国)。
METLER AE200分析天平(感量：0.0001g，瑞士METLER TOLEDO公司)；BRAN LUEBBEAA3连续流动分析仪(德国BRAN LUEBBE公司)；101A-2干燥箱(上海市实验仪器总厂)；HP4896紫外可见分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Millipore AQUELIX5纯水机(美国MERCK Millipore公司)；EppendorfCentrifuge 5810R离心机(德国Eppendorf公司)。
1.3样品的处理及分析
1.3.1样品前处理
按照“YC/T31-1996烟草及烟草制品试样的制备和水份测定烘箱法”，将前述各样品分别置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎机研磨，过40目筛后得到烟末样品，并测定水份含量。取0.1g烟末样品于三角瓶中，加20mL水振荡萃取样品中的葡萄糖，30min后过滤得到滤液，作为待测样品溶液备用。
1.3.2样品分析
用连续流动分析仪分析样品溶液，得到葡萄糖仪器观测值：
①试剂：葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒中的试剂R1和R2；
②流路设置：如图2所示，试剂R1和R2经5匝混合圈混合后，与样品溶液经20匝混合圈混合，连续通过2个37℃、10.6mL的加热池，在线发生显色反应，最后经由10匝混合圈进入连续流动分析仪；样品溶液用橙/绿泵管，流速为0.10mL/min；R1和R2试剂用红/红泵管，流速为0.80mL/min；
③分析仪检测波长：480nm；检测速度：30个样品/h；进样/清洗时间比：1∶1；进样时间60s；基线校正：开通；
1.3.3绘制标准工作曲线
准确配制浓度为50.00mmol/L的葡萄糖标液，分别移取葡萄糖标液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00mL，用水定容至50mL，得到对应葡萄糖浓度分别为0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00mmol/L的标准工作液；
用步骤(2)相同方法分析标准工作液，绘制标准工作曲线，线性回归方程为：Y＝49.817x+0.2444，相关系数r2＝0.9989，见图1；再由标准工作曲线推算出待测样品溶液的葡萄糖浓度值。
1.3.4结果计算
将待测样品溶液的葡萄糖浓度值代入公式(1)，计算样品的葡萄糖含量；
Figure BDA0002820865660000061
式中：
GLU(％)—样品的葡萄糖含量，单位为质量百分数(％)；
0.18016—考虑萃取剂体积单位和葡萄糖摩尔质量的换算系数，单位为毫克每毫摩尔(mg/mmol)；
C—样品溶液的葡萄糖浓度值，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
V—萃取剂体积，单位为毫升(mL)；
G—样品质量，单位为克(g)；
W—样品的水份含量，单位为为质量百分数(％)。
以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果，精确至0.01，两次平行测定结果绝对值之差不应超过5％。
2.结果与讨论
2.1条件优化
2.1.1样品萃取剂的影响
为将烟草中的葡萄糖充分萃取，实验考察了样品萃取剂的影响。取样品A、B、C分别用水和5％乙酸按照1.3部分的方法进行萃取，取滤液100μL于2mL微量离心管中，分别加入1000μL试剂R1和R2混匀，于37℃水浴显色10min，转移至1cm光程比色皿中，以蒸馏水分析液为参比，用分光光度计于波长480nm处测定吸光度。从表1可知：3个样品用水萃取的吸光度(3次测定平均值)均大于5％乙酸，表明水能将葡萄糖充分萃取出来，故选择水作为样品萃取剂。
表1水提取和酸提取的吸光度
Figure BDA0002820865660000071
2.1.2显色反应时间的影响
通过增减加热池来控制显色反应时间，考察其对系列标准工作溶液的影响来选择最佳配置。比较了管路中不添加、添加一个反应温度为37℃的10.6mL加热池、添加两个反应温度为37℃的10.6mL加热池时对出峰情况和峰形的影响。不添加或添加一个加热池均出现因反应不完全而致的尖峰、小峰，标准工作曲线线性不佳，添加两个加热池时峰形较好，平台明显，标准工作曲线线性良好。因此，在流路中设置两个串联的、反应温度为37℃的10.6mL加热池。
2.2方法学考察
2.2.1线性范围及检出限、定量限
通过逐级稀释50mmol/L的葡萄糖溶液，得到葡萄糖浓度分别为0.00、0.25、0.50、0.75……3.00mmol/L的标准工作液，线性所对应的葡萄糖浓度为2.00mmol/L，高于此浓度则响应曲线出现平台，不再线性增加。
在样品检测时，分别移取50mmol/L的葡萄糖标液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00μL置于50mL容量瓶中，用水定容，得到对应葡萄糖浓度分别为0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00mmol/L的标准工作液。
取0.00mmol/L标准工作液，重复测定10次的标准偏差(SD)为0.0075mmol/L，按照3倍SD、10倍SD计算得出本方法的检出限和定量限分别为0.0225、0.075mmol/L。
2.2.2精密性和稳定性
将A、B、C三个样品分别连续检测6次，在不同时间检测3批，结果见表2。批内变异系数范围为0.09-4.46％，批间变异系数范围为4.41-5.94％，说明该方法的精密度高。
表2精密性和稳定性
Figure BDA0002820865660000081
Figure BDA0002820865660000091
2.2.3加标回收率
在已知含量的样品溶液中加入一定量的葡萄糖，比较实测添加量和理论添加量得到回收率。在原含量为0.498mmol/L的样品溶液中添加量分别为0.4、0.8、1.2mmol/L时的回收率范围为98.50％～104.50％(见表3)，都在95～105％的范围内，说明该检测方法结果准确、可靠。
表3加标回收率(n＝3)
Figure BDA0002820865660000092
*为三次测量的平均值
2.2.4干扰实验
为了考察本方法的专一性，配制2.0mmol/L的葡萄糖和与葡萄糖结构类似的甘露糖、木糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸(一水合)和葡萄糖醛酸溶液，按照1.3部分的方法进行测定。结构式见图3，检测结果见表4和图4。由表4、图4可知，以葡萄糖溶液的响应值为100.00％，除甘露糖、鼠李糖(一水合)有约2.5％的响应之外，其它6种物质均对检测无干扰，本方法的专一性良好。
表4方法专一性考察
Figure BDA0002820865660000093
2.3与其它方法的比对——比对实验用高效液相色谱(HPLC)法
2.3.1样品前处理
称取0.020g相同样品于2mL离心管中，加入2mL纯水，盖上盖子，放入振荡摇床中，室温下在150rpm转速下提取30min，5000rpm离心取上清液作为样品溶液备用。
2.3.2 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化
将样品溶液用氮吹仪吹干(约3h)，吹干过程中加热至60℃。室温放置备用。向干燥后得到的样品中加入0.3mol/L的NaOH溶液和溶于无水甲醇的0.5mol/L的PMP各0.5mL，充分混匀后，水浴70℃反应30min。
冷却至室温，加入0.3mol/L HCl 0.5mL，充分混匀。平均分成两份到EP管中(900μL+600μL)，其中一份备用，在备用样品中滴入0.1mL氯仿置于4℃冰箱。另外一份中加入0.5mL氯仿，充分振荡萃取，5000rpm离心5min去除氯仿层，重复萃取三次。水层(不低于0.4mL)用0.22μm滤膜过滤至2mL小样品瓶中，盖上盖，待HPLC检测。上样过柱分析。
2.3.3葡萄糖-PMP衍生物的HPLC分析
采用Waters HPLC系统，Thermo ODS-2C18柱(4.6mm*150mm)，流动相为0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(PB，磷酸缓冲液1L：Na2HPO4·12H2021.8g；Na2HPO4·2H20 6.08g)：乙腈为82:18(v/v)，流速为1.0mL/min，进样量为10μl，检测波长为245nm。
2.3.4标准工作曲线
分别取配好的10mg/mL葡萄糖标液50、100、150μL于2mL EP管中，用氮吹仪吹干，按照2.3.2、2.3.3的步骤进行PMP衍生化和HPLC分析过程，最后上机测试。以葡萄糖含量为横坐标，检测峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
2.3.5葡萄糖含量的计算
按照公式(1)计算样品中的葡萄糖含量。
Figure BDA0002820865660000111
式中：
GLU(％)—样品的葡萄糖含量，单位为毫克每克(mg/g)；
C—样品溶液的葡萄糖浓度值，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
V—萃取剂体积，单位为毫升(mL)；
m—样品质量，单位为克(g)；
W—样品的水分含量(％)。
0.18016—考虑萃取剂体积单位和葡萄糖摩尔质量的换算系数，单位为克每毫摩尔(g/mmol)。
为进一步验证本法的测定结果，与液相色谱法进行了比对，结果见表5。分别用两种方法测定了前述1-7#样品，置信度95％时，F检验两样本的P值为0.43，大于0.05，总体方差齐同；T检验两样本的P值为0.92，大于0.05，说明在95％置信度下，两种方法测定结果无显著性差异。可见，本方法与高效液相色谱法的一致性较好。
表5两方法比较实验结果(n＝3)
Figure BDA0002820865660000112
3.结论
该方法专一性强、操作简便快速、分析效率高、准确度和精密度高、稳定性好，能够满足对烟草及烟草制品中的葡萄糖含量进行大批量、快速、准确检测的需要。

Claims (1)

1.一种快速测定烟草及烟草制品中葡萄糖含量的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
按照“YC/T31-1996烟草及烟草制品试样的制备和水份测定烘箱法”，将烟草或烟草制品置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎机研磨过40目筛后得到烟末样品，并测定其含水率；取0.1g烟末样品置于三角瓶中，加入20mL水振荡萃取30min后过滤，滤液作为待测样品溶液备用；
(2)样品分析
用连续流动分析仪分析样品溶液，得到葡萄糖仪器观测值：
①试剂：葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂盒中的试剂R1和R2；
②流路设置：试剂R1和R2经5匝混合圈混合后，与样品溶液经20匝混合圈混合，连续通过2个37℃、10.6mL的加热池在线发生显色反应，然后经由10匝混合圈进入连续流动分析仪；其中，样品溶液用橙/绿泵管，流速为0.10mL/min；试剂R1和R2用红/红泵管，流速为0.80mL/min；
③分析仪检测波长：480nm；检测速度：30个样品/h；进样/清洗时间比：1∶1；进样时间60s；基线校正：开通；
(3)绘制标准工作曲线
准确配制浓度为50.00mmol/L的葡萄糖标液，分别移取葡萄糖标液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00mL，用水定容至50mL，得到对应葡萄糖浓度分别为0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00mmol/L的标准工作液；
用步骤(2)相同方法分析标准工作液，绘制标准工作曲线，线性回归方程为：Y＝49.817x+0.2444，相关系数r2＝0.9989；再由标准工作曲线推算出待测样品溶液的葡萄糖浓度值；
(4)结果计算
将待测样品溶液的葡萄糖浓度值代入公式(1)，计算样品中的葡萄糖含量，并以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果；
Figure FDA0002820865650000021
式中：
GLU(％)—样品的葡萄糖含量，单位为质量百分数(％)；
0.18016—考虑萃取剂体积单位和葡萄糖摩尔质量的换算系数，单位为毫克每毫摩尔(mg/mmol)；
C—样品溶液的葡萄糖浓度值，单位为毫摩尔每升(mmol/L)；
V—萃取剂体积，单位为毫升(mL)；
G—样品质量，单位为克(g)；
W—样品的水份含量，单位为为质量百分数(％)。
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