CN109061009B - 一种发酵液中衣康酸含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵液中衣康酸含量的测定方法，该方法包括：试样中的衣康酸经甲醇‑水溶液提取或直接稀释，经强阴离子交换固相萃取柱净化，磷酸‑甲醇溶液洗脱，再利用反相色谱柱分离，液相色谱紫外检测器测定，外标法定量。本发明可排除衣康酸发酵液中可能存在的木糖、蔗糖、葡萄糖、果糖等糖和柠檬酸的干扰，该方法的回收率高，精密度好，准确可靠，能对衣康酸的含量测定起到质量控制的目的。

Description

一种发酵液中衣康酸含量的测定方法

技术领域

本发明涉及发酵液及成品中衣康酸的含量检测技术领域，具体为一种发酵液中衣康酸含量的测定方法。

背景技术

衣康酸(Itaconic acid)又称甲叉丁二酸、亚甲基丁二酸、亚甲基琥珀酸，是世界上5大有机酸之一。由于其含不饱和双键，具有活泼的化学性质，能进行各种加成反应、聚合反应和酯化反应，是化学合成和化工生产的重要工业原料，在化纤、塑料、橡胶、医药、食品、合成树脂及表面活性剂领域具有广泛的应用，随着衣康酸具有的独特性能被认识及应用范围的迅速扩大，迫切需要建立一种快速、准确地测定发酵液中衣康酸含量的分析方法。

目前，传统发酵液中的有机酸多采用酶法或高效液相色谱法测定，还原糖采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸比色法)测定。酶法和还原糖法分析过程繁琐费时，现在的研究人员多采用色谱仪分析发酵液的成分。马瑞等使用离子排斥液相色谱法同时分析了生物质发酵液中6种有机酸和3种糖类物质。刘兰等利用高效液相色谱法同时测定土曲霉发酵液中衣康酸及葡萄糖。朱进拴等利用电导检测器的有机酸分析系统测定衣康酸的含量。

当前检测技术主要集中在衣康酸发酵液中的衣康酸和常见代谢产物的分析，多采用示差检测器。而以淀粉(或糖质)为原料，经微生物深层发酵的发酵液是一种悬浮物、固形物较多、粘度较大、色度很深，一般富含残糖、有机酸、色素、蛋白等杂质，此类杂质难免会对衣康酸的分离产生干扰，从残糖在紫外光区几乎无吸收的角度从发，建立一种快速、准确地测定发酵液中衣康酸含量的分析方法对于该技术的发展具有重要的意义。

发明内容

本发明为填补现有检测技术的不足，提供了一种发酵液中衣康酸含量的高效液相色谱检测方法，该方法选用固相萃取柱净化，紫外检测器检测，操作简便，准确可靠，为日常检验工作提供可靠技术支持。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种发酵液中衣康酸含量的测定方法，该测定方法具体步骤如下：

S1、试样处理：

提取：取适量发酵液，离心处理后，称取定量的上清液于容量瓶中，用甲醇-水溶液溶解，并定容；

净化：取定量上述定容后的溶解液至固相萃取柱中，控制流速，弃去流出液，用甲醇-水溶液淋洗，再用磷酸-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，置于氮吹管中，氮吹至干后，用磷酸溶液-甲醇溶液震荡溶解残渣，经有机微孔滤膜过滤，得到供高效液相色谱仪分析用的试样溶液；

优选地，所述步骤S1的具体操作步骤如下：

提取：取适量发酵液，离心处理后，称取上清液1.00g于100mL容量瓶中，用甲醇-水溶液溶解，并定容；

净化：取1.00mL上述定容后的溶解液至固相萃取柱中，控制流速为0.5mL/min，弃去流出液，用1mL甲醇-水溶液淋洗，再用4mL的2％磷酸-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，置于氮吹管中，50℃氮吹至干后，用1.00mL的0.1％磷酸溶液-甲醇溶液震荡溶解残渣，经0.45μm的有机微孔滤膜过滤，得到供高效液相色谱仪分析用的试样溶液。

优选地，所述的固相萃取柱采用强阴离子固相萃取柱，规格为：1000mg、6mL；使用前，依次用4mL甲醇、4mL水以及4mL甲醇-水溶液对强阴离子固相萃取柱进行活化处理。

其中，所述的甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为1:1；所述的2％磷酸-甲醇溶液是由体积比为1:50的磷酸和甲醇混合而成。

S2、标准溶液配制：

准确称取衣康酸标准品，制成衣康酸标准储备液，再精密量取衣康酸标准储备液适量，配制成系列标准曲线工作溶液；

可优选地，所述步骤S2的具体操作步骤如下：

精密称取100mg的衣康酸标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，配制成含量为10.0mg/mL标准储备液，于4℃下保存；再分别吸取适量衣康酸标准储备液，用0.1％磷酸溶液-甲醇溶液配制成5、10、20、50、100、200mg/L的标准曲线工作溶液，于4℃保存，现用现配。

S3、仪器分析：

采用高效液相色谱仪，紫外检测器测定，外标法定量；

其中，所述步骤S3中仪器分析的参考条件如下：色谱柱：WatersBridge C₁₈，250×4.6mm，5μm；流动相：0.1％磷酸溶液-甲醇溶液；流速：0.8mL/min；柱温：45℃；进样体积：5μL；检测波长：210nm。

优选地，所述的0.1％磷酸溶液-甲醇溶液是由体积比为87:13的0.1％磷酸溶液和甲醇混合而成，其中，0.1％磷酸溶液是由体积比为1:1000的磷酸和水混合而成。

S4、结果计算：

将配制的标准曲线工作溶液，按浓度由低到高的顺序进行检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，绘制标准曲线；工作曲线的线性相关系数r²≥0.999，将净化过滤后的试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到相应的峰高或峰面积，依据标准曲线得到待测液中衣康酸的浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)本发明样品前处理采用的是强阴离子固相萃取柱(SAX)，适用于从水或非水溶液中萃取带负电荷的物质，实验结果表明，净化后峰强度明显提高，且重现性好，回收率高，能够胜任高通量分析要求；

2)本发明采用紫外检测器，由于木糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖等糖在紫外光区无吸收，配以C₁₈色谱柱，故可成功避开衣康酸发酵液中可能存在的木糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖和柠檬酸的干扰，测定的准确率更高；

3)本发明方法的回收率高，精密度好，准确可靠，能为日常检验工作提供可靠技术支持。

附图说明

图1为衣康酸的标准色谱图(浓度为20mg/L)；

图2为衣康酸的标准曲线图；

图3为衣康酸的紫外光谱图；

图4为衣康酸和5种糖及柠檬酸的分离效果图。

附表说明

表1为衣康酸的线性范围、线性方程、相关系数、定量限；

表2为衣康酸的加标回收率及相对标准偏差(n＝6)；

表3为发酵液中衣康酸的检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种发酵液中衣康酸含量的测定方法，该测定方法具体步骤如下：

1.试剂与标准物质

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯级；水为GB/T 6682规定的一级水；甲醇，色谱纯；磷酸，优级纯；衣康酸(Itaconic Acid，CAS：97-65-4)，纯度≥99％。

2.溶液的配制

甲醇-水溶液(1:1，V/V)：量取250mL甲醇，加入250mL水，混匀。

2％磷酸-甲醇溶液：量取2mL磷酸，加甲醇至100mL，混匀。

0.1％磷酸溶液：量取1.0mL磷酸，加水至1000mL，混匀。

0.1％磷酸溶液-甲醇溶液：量取870mL的0.1％磷酸溶液，加入130mL甲醇混匀。

3.标准溶液配制

衣康酸标准储备液：精密称取100mg的衣康酸标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，此溶液衣康酸含量为10.0mg/mL，于4℃下保存。

衣康酸标准曲线工作溶液：分别吸取适量衣康酸标准储备溶液，用0.1％磷酸溶液-甲醇溶液配制成5、10、20、50、100、200mg/L的标准曲线工作溶液，于4℃保存，现用现配。

4.仪器和设备

高效液相色谱仪，配紫外检测器(日本岛津公司)；涡旋混合器(德国IKA公司)；Milli-Q超纯水发生器(美国Millipore公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)；离心机(转速不低于6000r/min，日本HITACHI公司)；电子天平(感量0.1mg、0.01g各一台，瑞士梅特勒公司)；移液器(美国Thermo公司)；固相萃取装置(美国Agilent公司)。

强阴离子固相萃取柱(SAX)，规格为：1000mg、6mL；使用前依次用4mL甲醇、4mL水、4mL甲醇-水溶液(1:1，V/V)活化；0.45μm有机微孔滤膜。

5.试样处理

提取：取适量发酵液，离心处理后，称取上清液1.00g于100mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(1:1，V/V)溶解并定容。

净化：取1.00mL上述定容后的溶解液至经过预活化的强阴离子固相萃取柱(SAX)中，控制流速为0.5mL/min，弃去流出液，用1mL甲醇-水溶液(1:1，V/V)淋洗，再用4mL的2％磷酸-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于氮吹管中，50℃氮吹至干后，用1.00mL的0.1％磷酸溶液-甲醇溶液震荡溶解残渣，经0.45μm的有机微孔滤膜过滤，得到供高效液相色谱仪分析用的试样溶液。

空白试验为除不加试样外，采用完全相同的步骤进行平行操作。

6.仪器分析

采用高效液相色谱仪，紫外检测器测定，外标法定量；其中，仪器分析的参考条件如下：色谱柱：Waters Bridge C18，250×4.6mm，5μm；流动相：0.1％磷酸溶液-甲醇溶液；流速：0.8mL/min；柱温：45℃；进样体积：5μL；检测波长：210nm。

7.分析结果的表述

将配制的标准曲线工作溶液，按浓度由低到高的顺序进行检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，绘制标准曲线；工作曲线的线性相关系数r2≥0.999，将净化过滤后的试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到相应的峰高或峰面积，依据标准曲线得到待测液中衣康酸的浓度，待测液中衣康酸的响应值均应在仪器线性范围内，若超过线性应适当稀释或浓缩待测液。

其中，衣康酸标准溶液色谱图见图1，衣康酸标准曲线见图2，衣康酸的紫外光谱图见图3，衣康酸与五种糖及柠檬酸的分离效果图见图4。

试样中衣康酸的含量按式(1)计算：

式中：

X—试样中衣康酸的含量，单位为克每千克(g/kg)；

c—由标准曲线求得试样溶液中衣康酸的浓度，单位为毫克每升(mg/L)；

V—试样最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m—最终样液代表的试样质量，单位为克(g)；

1000—换算系数。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。

本发明方法中衣康酸的线性范围、线性方程、相关系数、定量限见表1。

灵敏度：实验中，以不含有目标物的样品为基质，按仪器检出限的浓度加标，并测定其信噪比。以3倍信噪比(S/N)确定方法的定性检出限为0.2g/kg；以10倍信噪比(S/N)确定方法的定量下限为0.5g/kg。

精密度：本方法衣康酸发酵液中添加浓度水平上的回收率为92.6％～100.1％，数据参见表2。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

用上述检测方法，取自生产工艺不同阶段发酵液中衣康酸的含量，测得样品中衣康酸的含量见表3。总体上看，衣康酸的含量普遍较高，应根据实际情况适当加大稀释倍数。

表1衣康酸的线性范围、线性方程、相关系数、定量限

表2衣康酸的加标回收率及相对标准偏差(n＝6)

表3发酵液中衣康酸的检测结果

样品编号	1	2	3	4	5	6	7
								衣康酸含量/(g/kg)	47.1	48.1	40.5	49.2	51	48	44.4

Claims (1)

1.一种发酵液中衣康酸含量的测定方法，其特征在于，该测定方法具体步骤如下：

S1、试样处理：

提取：取适量发酵液，离心处理后，称取定量的上清液于容量瓶中，用甲醇-水溶液溶解，并定容；

净化：取定量上述定容后的溶解液至固相萃取柱中，控制流速，弃去流出液，用甲醇-水溶液淋洗，再用磷酸-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，置于氮吹管中，氮吹至干后，用磷酸溶液-甲醇溶液震荡溶解残渣，经有机微孔滤膜过滤，得到供高效液相色谱仪分析用的试样溶液；

S2、标准溶液配制：

准确称取衣康酸标准品，制成衣康酸标准储备液，再精密量取衣康酸标准储备液适量，配制成系列标准曲线工作溶液；

S3、仪器分析：

采用高效液相色谱仪，紫外检测器测定，外标法定量；仪器分析的参考条件如下：色谱柱：Waters Bridge C18，250×4.6mm，5μm；流动相：0.1％磷酸溶液-甲醇溶液；流速：0.8mL/min；柱温：45℃；进样体积：5μL；检测波长：210nm；

S4、结果计算：

将配制的标准曲线工作溶液，按浓度由低到高的顺序进行检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，绘制标准曲线；工作曲线的线性相关系数r²≥0.999，将净化过滤后的试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到相应的峰高或峰面积，依据标准曲线得到待测液中衣康酸的浓度；

其中，所述步骤S1的具体操作步骤如下：

提取：取适量发酵液，离心处理后，称取上清液1.00g于100mL容量瓶中，用甲醇-水溶液溶解，并定容；

净化：取1.00mL上述定容后的溶解液至固相萃取柱中，控制流速为0.5mL/min，弃去流出液，用1mL甲醇-水溶液淋洗，再用4mL的2％磷酸-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，置于氮吹管中，50℃氮吹至干后，用1.00mL的0.1％磷酸溶液-甲醇溶液震荡溶解残渣，经0.45μm的有机微孔滤膜过滤，得到供高效液相色谱仪分析用的试样溶液；

所述的固相萃取柱采用强阴离子固相萃取柱SAX，规格为：1000mg、6mL；使用前，依次用4mL甲醇、4mL水以及4mL甲醇-水溶液对强阴离子固相萃取柱进行活化处理；

所述的甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为1:1；

所述的2％磷酸-甲醇溶液是由体积比为1:50的磷酸和甲醇混合而成；

所述步骤S2的具体操作步骤如下：

精密称取100mg的衣康酸标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，配制成含量为10.0mg/mL标准储备液，于4℃下保存；再分别吸取适量衣康酸标准储备液，用0.1％磷酸溶液-甲醇溶液配制成5、10、20、50、100、200mg/L的标准曲线工作溶液，于4℃保存，现用现配；

所述的0.1％磷酸溶液-甲醇溶液是由体积比为87:13的0.1％磷酸溶液和甲醇混合而成，其中，0.1％磷酸溶液是由体积比为1:1000的磷酸和水混合而成。

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