CN103543224A - 一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，属于阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法领域。解决了传统液相荧光色谱法未根据不同的SPE柱及阿维菌素和伊维菌素的化学结构特点选择合理的净化条件，造成净化效果不理想、回收率不稳等问题。本发明步骤如下以乙腈为提取剂，将残留在鱼肉中的阿维菌素和伊维菌素提取出来，采用目标物吸附固相萃取模式，以中性氧化铝柱为固相萃取柱，正己烷上样、淋洗，甲醇洗脱，弃去全部正己烷流出液，仅收集甲醇洗脱液，实现鱼肉中残留阿维菌素和伊维菌素的富集和净化，明确了衍生温度和定溶溶剂及标准使用液和衍生物样品存放条件和测定时间，提高检测方法灵敏度、重复性和准确度，适合大批量样品检测。

Description

一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法

技术领域

本发明属于阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法领域，特别是涉及到一种淡水鱼肉中残留的阿维菌素和伊维菌素进行检测的方法。

背景技术

阿维菌素（AVM）和伊维菌素（IVM）属大环内酯类抗生素，其化学结构如图1所示。其中阿维菌素B1a：R1=H，R₂=C₂H₅，X-Y=CH=CH；B1b：R₁=H，R₂=CH₃，X-Y=CH=CH。伊维菌素氢化B1a：R1=H，R₂=C₂H₅，X-Y=CH₂—CH₂；B1b：R₁=H，R₂=CH₃，X-Y=CH₂—CH₂。阿维菌素和伊维菌素的化学结构共同点为：二者都富含氧原子、双键基团；不同点：阿维菌素的22,23位为双键，伊维菌素为22,23位双键的氢化产物。

阿维菌素和伊维菌素在农牧业广泛用作抗寄生虫剂和杀螨剂，水产养殖方面主要用于寄生虫病的防治，常用于治疗青、草、鲢、鳙等淡水养殖鱼类的寄生虫病。该类药物具有神经和发育毒性，世界卫生组织将其归为高毒化合物。由于脂溶性好、代谢慢，长期大量非合理使用该类药物，会在水产动物体内造成高残留，从而对人类健康产生巨大的影响。目前，以畜、禽、饲料及蔬菜水果为研究对象的阿维菌素和伊维菌素残留检测方法并不少见，但以水产品特别是淡水鱼肉为研究对象的相关报道相对较少。综合起来，阿维菌素和伊维菌素残留检测方法主要有液相色谱质谱联用法、酶联免疫吸附法和液相色谱法。

现有技术当中的液相色谱质谱联用法：是利用液相色谱和质谱联用对化合物分离鉴定，检出限最低可达0.5ppb，该法虽是一种较好的定性确证方法，但仪器昂贵，不易普及。

现有技术当中的酶联免疫吸附法：是利用间接竞争ELISA法定性，同时借助显色反应定量，检出限可达2ppb，但该法检出阳性样品还需进一步确证。

现有技术当中的液相色谱法：是利用液相色谱对化合物进行分离，然后利用化合物的紫外或荧光特性进行定性定量鉴定，特别是液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD），具有选择性好、灵敏度高、成本相对较低且易于推广等特点，检出限可达1ppb，与液质联用仪相当。但样品净化程度和荧光衍生物稳定性等问题仍是研究重点和难点。

现有阿维菌素和伊维菌素残留检测净化技术中，多采用中性氧化铝（AL-N）和碱性氧化铝（AL-B）固相萃取柱，萃取模式采用杂质吸附模式，（甲醇溶解-甲醇洗脱-收集甲醇流出液和甲醇洗脱液）即收集所有流出液。该萃取模式对于水产品中残留AVMs的富集净化效果不很理想，收集全部流出液会造成杂质含量高、出峰干扰多、回收率不稳定等问题。而本方法根据阿维菌素和伊维菌素的分子结构、物化特性以及中性氧化铝柱特点，采用目标物吸附模式（正己烷溶解-甲醇洗脱-弃去正己烷流出液并仅收集甲醇洗脱液），正相吸附原理，中性氧化铝固相萃取柱在无水的非极性溶剂正己烷中，通过表面铝原子中心与带高负电荷的杂原子如氧原子形成较强的极性作用力，选择吸附富含氧原子、双键等高负电基团的阿维菌素和伊维菌素，使与溶解在正己烷中的脂肪等杂质分离，通过弃去正己烷流出物，仅收集甲醇洗脱液，从而有效去除杂质干扰，提高鱼肉中残留阿维菌素和伊维菌素的富集和净化效率。

现有衍生条件，采用N-甲基咪唑和三氟乙酸酐为衍生化试剂时，未明确具体衍生温度，并且衍生化后以甲醇为定容试剂，这些容易引起衍生物色谱峰面积不稳定，造成定量不准确等问题。而本方法明确了具体衍生化反应温度，确保衍生化完全；优化确定了乙腈为衍生化后的定容试剂，确保得到稳定的衍生物色谱峰，利于准确定量。

以往文献和标准中，很少提及标准使用液和衍生物样品的稳定性问题，特别是上机测定时间的控制，可能会造成样品数量过多导致的样品分解而影响结果分析。为了方便操作和进行质量控制，本方法通过实验测定了标准使用液和衍生物样品在不同存放条件和存放时间的峰面积变化，明确指出了标准使用液应现用现配，衍生化后的样品上机样品测定最好在24h以内完成。更有利于提高测定结果准确度。

鉴于以上原因，本检测方法研究了阿维菌素和伊维菌素残留的液相色谱-荧光检测法，重点讨论了检测方法中样品净化和衍生化等前处理部分。本液相荧光色谱法测定水产品中阿维菌素和伊维菌素残留主要是乙腈提取、中性氧化铝柱净化，正己烷上样、淋洗，甲醇洗脱，衍生后乙腈定容，液相色谱-荧光法测定。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题为：提供一种用于淡水鱼肉中阿维菌素和伊维菌素残留检测的前处理及检测方法，通过对现有前处理技术的优化、合理化和细化，获得了良好的富集净化效果，提高检测方法灵敏度、重复性和准确度，适合大批量样品检测。

一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：

步骤一、提取

称取样品5.0g放置于规格为50ml的离心管中，向该离心管中加入10g在650°温度下烘干4小时的无水Na₂SO₄，再向该离心管中加入15ml乙腈，涡旋振荡两分钟，在4000r/min的条件下于离心机中离心操作三分钟，将该离心管中的上清液转移至规格为50ml的茄形瓶中，向该离心管中的残渣里加入10ml乙腈，按照上述方法继续对该离心管中的残渣进行提取，合并两次的提取液，在50℃～60℃条件下于旋蒸仪中，逐步开大旋蒸仪的真空度并将压力保持在-0.08Mpa以下旋蒸至干，旋蒸至干，向该旋蒸至干的茄型瓶中加入2mL正己烷涡旋溶解，得到正己烷提取液，备用；

步骤二、固相萃取

取中性氧化铝固相萃取柱AgilentBONDELUT-AL-N，规格为500mg/3ml，添加无水硫酸钠Na₂SO₄用于本步骤二的固相萃取操作，向该固相萃取小柱中加入2ml正己烷进行预洗，将步骤一中的正己烷提取液过柱，保持流速在10滴/分钟～15滴/分钟，再用2mL正已烷清洗该茄形瓶并过柱，然后用1ml～2ml正己烷淋洗该固相萃取柱并吹干，弃去全部正己烷流出液，依次取2ml、2ml、1ml甲醇对该固相萃取小柱进行洗脱操作，收集全部甲醇洗脱液于另一干燥的茄形瓶中，在50℃～60℃条件下于旋蒸仪中减压即逐步开大旋蒸仪的真空度并将压力保持在-0.08Mpa以下旋蒸至干，该旋蒸至干的茄形瓶备用；

步骤三、样品溶液的衍生

向步骤二中旋蒸至干的茄形瓶里加入100μL衍生化试剂，该衍生化试剂为乙腈与N-甲基咪唑等比例混合，立即密闭并涡旋混匀，再加入150μL衍生化试剂，该衍生化试剂为乙腈与三氟乙酸酐按2:1比例混合，立即密闭并涡旋混匀，于控温箱中25℃衍生化反应15分钟，取出后加入750μl乙腈，经过0.45μm滤膜过滤后注入HPLC色谱仪分析；

其中衍生化试剂A液为乙腈与N-甲基咪唑等比例混合，使用前制备，

衍生化试剂B液为乙腈与三氟乙酸酐按2:1比例混合，使用前制备；

步骤四、结果

设定适宜的HPLC色谱仪荧光检测色谱条件，供分析用；

将不同浓度的阿维菌素和伊维菌素标准衍生溶液上机测定，绘制标准曲线；

将步骤三中制备的待测样品衍生溶液进行液相色谱分析，采用外标法定量，根据定量结果计算待测样品中阿维菌素和伊维菌素的含量。

所述的步骤一中称取鱼肉样品5.0g精确至0.01g。

本检测方法在鱼肉组织中的阿维菌素和伊维菌素最低检出限为1μg/kg,定量限为3μg/kg。

本检测方法在淡水养殖鱼类肌肉中阿维菌素在3μg/kg、10μg/kg、20μg/kg添加浓度的回收率为75%～110%；伊维菌素在3μg/kg、10μg/kg、20μg/kg添加浓度的回收率为75%～110%。

本检测方法的批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%。

本检测方法检测信号仅与阿维菌素和伊维菌素有关。

本检测方法的色谱柱为C₁₈反相柱，250mm×4.6mm，粒径5μm；流动相为甲醇；流速为1mL/min；柱温为30℃；激发波长为365nm；发射波长为475nm；进样量为20μL。

本检测方法中的甲醇为色谱纯；乙腈为色谱纯；正己烷为色谱纯；无水硫酸钠为分析纯；阿维菌素标准衍生溶液为CAS71751-41-2，纯度≥97.0%；伊维菌素标准衍生溶液为CAS70288-86-7，纯度≥96.0%；N-甲基咪唑为化学纯，含量≥99.0%；三氟乙酸酐为化学纯，含量≥99.0%。

本检测方法中的色谱仪为高效液相色谱仪，配有Waters1525Binary HPLCPump输液泵系统和Waters2475Multi λFluorescence Detector荧光检测器。

通过上述技术方案本发明方法具有如下有益效果：

本发明用于固相萃取的模式，对比了目标物吸附模式和杂质吸附模式的固相萃取效果，结果发现，对于中性氧化铝固相萃取柱，目标物吸附模式更适合于鱼肉中阿维菌素和伊维菌素的富集和净化，色谱峰响应值高，杂质干扰少，基线噪声低，AL-N固相萃取柱吸附少，且可以获得较好的回收率。

本发明用于中性氧化铝柱的目标物吸附固相萃取模式，对比了甲醇和正己烷作为上样溶剂的固相萃取效果，发现非极性的正己烷基质环境更有利于固相萃取柱和目标化合物阿维菌素和伊维菌素之间的极性吸附作用，以正己烷为上样试剂、甲醇为洗脱试剂的目标物吸附模式更有利于净化效果的提高。

本发明用于衍生化反应温度，对比了10℃、20℃、25℃、30℃、35℃不同温度下的衍生化反应效果，结果发现，阿维菌素和伊维菌素的最佳衍生温度为25℃，与以往仅以“常温”提及相比，明确具体的衍生反应温度，更有利于保持衍生反应条件的一致性，使得结果可以获得更好的重复性。

本发明用于衍生后的定容试剂，对比了甲醇和乙腈定容的衍生反应产物稳定性，结果发现，乙腈定容的衍生化反应产物，在定容后的3h内，峰面积响应值无变化且稳定，与甲醇定容应在定容3h后开始测定且在1h内测定结束，否则直接导致测量结果不准确的结果相比，乙腈定容更加适用于定性定量分析。

本发明用于上机测定的衍生样品稳定性，对比了仪器测定条件下标准衍生样品和加标衍生样品的稳定性，结果发现，标准衍生样品和加标衍生样品均为定容后24h以内稳定性良好，上机测定最好在24h以内完成，更有利于保证测量结果准确性。

本发明所涉及的鱼肉中残留阿维菌素和伊维菌素检测方法是乙腈提取，正己烷溶解，中性氧化铝固相萃取柱富集净化，荧光衍生化反应后，高效液相荧光色谱法检测。本方法提供一种新的正己烷-中性氧化铝柱固相萃取方法，首次应用了目标物吸附固相萃取模式、明确了衍生化反应温度、更适于定量的衍生定容试剂以及定容后的上机测定时间。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：

图1为现有技术当中的阿维菌素和伊维菌素的化学结构图。

图2是本发明的实施例一中的（鱼肉添加20ng/g混合标准溶液样品）检测目标物吸附固相萃取模式和杂质吸附固相萃取模式的阿维菌素和伊维菌素色谱图。

图3是本发明的实施例二中的（1ml的100ng/ml阿维菌素和伊维菌素混合标准溶液）检测不同衍生温度的阿维菌素和伊维菌素色谱图。

图4是本发明的实施例三中的（1ml的100ng/ml阿维菌素和伊维菌素混合标准溶液）检测甲醇定容衍生液稳定性色谱图。

图5是本发明的实施例三中的（1ml100ng/ml阿维菌素和伊维菌素混合标准溶液）检测乙腈定容衍生液稳定性色谱图。

图6是阿维菌素的标准曲线图。

图7是伊维菌素的标准曲线图。

图8是用本发明的方法检测鱼肉中残留阿维菌素和伊维菌素的色谱图。

图9是本发明的实施例七中的（鱼肉添加20ng/g混合标准溶液样品）检测目标物吸附固相萃取模式下不同上样溶剂的阿维菌素和伊维菌素色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但实施例不限制本发明，且发明中未述及之处适用于现有技术。

1、试剂和材料

除非另有说明，所有的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

甲醇：色谱纯。

乙腈：色谱纯。

正己烷：色谱纯。

无水硫酸钠：分析纯。

阿维菌素标准品：CAS71751-41-2，纯度分别≥97.0%。

伊维菌素标准品：CAS70288-86-7，纯度≥96.0%。

N-甲基咪唑：化学纯，含量≥99.0%。

三氟乙酸酐：化学纯，含量≥99.0%。

衍生液A：乙腈与N-甲基咪唑等比例混合，使用前制备。

衍生液B：乙腈与三氟乙酸酐按2:1比例混合，使用前制备。

2、仪器和设备液相荧光色谱仪：Waters1525高效液相色谱仪（配有waters2487荧光检测器）。

离心机：转速不低于4000r/min。

旋蒸仪：可减压蒸馏。

固相萃取小柱：Agilent BOND ELUT-AL-N（500mg/3ml）。

以下，结合实施例以及附图详细说明本发明的检测方法。

实施例一是中性氧化铝固相萃取柱的不同萃取模式对比试验。

（1）色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm。荧光检测器激发波长365nm，发射波长475nm。流动相：甲醇。流速：1ml/min。进样量20ul。

（2）实验步骤

（a）提取：称取鱼肉添加样品5.0g于50ml离心管中，其中阿维菌素和伊维菌素的添加浓度为20ng/g，加入约10g无水Na₂SO₄（650°烘干4h），再加入15ml乙腈，涡旋振荡2min，于4000r/min离心3min，上清液转移至50ml茄形瓶中.残渣再加10ml乙腈，按上述方法再次提取，合并提取液，于50°-60°减压旋蒸至干。待溶解过柱。

（b）固相萃取：将添加适量无水Na₂SO₄的AL₂O₃-N固相萃取小柱，分别实施目标物吸附模式（正己烷溶解-甲醇洗脱-弃去正己烷流出液并仅收集柱后吹干甲醇洗脱液）和杂质吸附模式（甲醇溶解-甲醇洗脱-收集甲醇流出液和甲醇洗脱液），待蒸干衍生化。

不同固相萃取模式的操作模式、所用试剂和用量见下表。

（c）样品溶液的衍生：将固相萃取后的样品洗脱液减压旋蒸至干，先加入0.1ml的衍生试剂A，立即密闭，混匀，再加入0.15ml衍生试剂B，立即密封，混匀，于25°反应15min，然后加入750μl乙腈定容，上机测定，观察不同溶解-洗脱试剂的固相萃取效果。

（d）结果

色谱分析结果如图2，图2是Waters1252色谱工作站得到的色谱图，其中，色谱峰由上至下分别为目标物吸附模式（正己烷溶解-甲醇洗脱-弃去正己烷流出液并仅收集柱后吹干甲醇洗脱液）、杂质吸附模式（甲醇溶解-甲醇洗脱-收集甲醇流出液和甲醇洗脱液）的加标样品色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，单位是分钟，纵坐标表示荧光强度。由图2可以看出，对于中性氧化铝固相萃取柱，目标物吸附模式更适合于鱼肉中阿维菌素和伊维菌素的富集和净化，杂质干扰少，且可以获得较好的回收率。

实施例二是衍生温度的优化实验。

（1）色谱条件同实施例一。

（2）实验步骤

取1ml的100ng/ml阿维菌素和伊维菌素混合标准溶液5份减压旋蒸至干，分别于10℃、20℃、25℃、30℃、35℃温度下避光衍生15min，加入750μl乙腈定容后上机测定，观察不同衍生温度的影响。

（3）结果

色谱分析结果如图3所示。图3是Waters1252色谱工作站得到的色谱图，其中，色谱峰为阿维菌素和伊维菌素标准品的色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，单位是分钟，纵坐标表示荧光强度。由图3可以看出，随衍生温度的升高，阿维菌素和伊维菌素衍生物峰面积在衍生温度25℃时达到最大值，继续升高衍生温度后，峰面积开始下降。可见，阿维菌素和伊维菌素的最佳衍生反应温度为25℃。

实施例三是定容试剂的优化实验。

（1）色谱条件同实施例一。

（2）实验步骤

以1ml100ng/ml的阿维菌素、伊维菌素混合标准溶液蒸干后于25℃避光衍生15min，然后分别以甲醇和乙腈为定容溶剂并在测定条件下放置不同时间上机测定，观察衍生反应定容试剂的稳定性。

（3）结果

色谱分析结果如图4和图5所示。

图4是Waters1252色谱工作站得到的色谱图，其中，色谱峰为甲醇定容的阿维菌素和伊维菌素标准品的色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，单位是分钟，纵坐标表示荧光强度。由图4看出，以甲醇为定容试剂的衍生产物在180min～240min时间内峰面积接近，在180min以前峰面积逐渐增加，而从270min开始峰面积逐渐下降。可见，如果以甲醇为定容试剂，定性或定量测定应在定容3h后开始测定，并要在1h内测定结束，否则导致测量结果不准确。

图5是Waters1252色谱工作站得到的色谱图，其中，色谱峰为乙腈定容的阿维菌素和伊维菌素标准品的色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，单位是分钟，纵坐标表示荧光强度。由图5看出，在乙腈定容后的3h内，峰面积响应值无变化且稳定，与甲醇定容结果相比，更加适用于定性定量分析。

可见，本实验选择乙腈作为阿维菌素和伊维菌素衍生化后的定容试剂。

实施例四是阿维菌素和伊维菌素的标准曲线测定实验。

（1）色谱条件同实施例一。

（2）实验步骤

（a）阿维菌素和伊维菌素混合标准溶液的配制

分别精密移取1ml的0.1mg/ml阿维菌素、伊维菌素标准贮备液于100ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，配置成质量浓度为1ug/ml的混合标准工作液。然后用甲醇稀释浓度梯度为0.5ng/ml，1.0ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml混合标准工作液。

（b）标准溶液衍生化

分别吸取各浓度的混合标准工作溶液1ml于茄形瓶中，50°减压旋蒸至干后，先加入0.1ml的衍生试剂A，立即密闭混匀，再加入0.15ml衍生试剂B，立即密闭混匀，于25°反应15min，加入750μl乙腈定容后上机测定。

（2）结果

上述不同浓度的阿维菌素和伊维菌素混合标准衍生溶液上机测定，由色谱工作站绘制标准曲线，见图6和图7，阿维菌素和伊维菌素在0.2ng/ml—200ng/ml范围内，均呈现良好线性关系，相关系数均达到0.999，回归方程阿维菌素为Y=5.11e+002X+9.36e+002，伊维菌素为Y=5.12e+002X+4.96e+002。其中，Y表示色谱峰峰面积，X表示阿维菌素或伊维菌素的质量浓度。

实施例五是鱼肉样品中阿维菌素和伊维菌素的残留测定实验。

（1）色谱测定条件同实施例一。

（2）实验步骤

（a）标准曲线的绘制同实施例四。

（b）样品的处理：称取5.0g样品（精确至0.05g）于50ml离心管中，加入约10g无水Na₂SO₄（650°烘干4h），再加入15ml乙腈，涡旋振荡2min，于4000r/min离心3min，上清液转移至50ml茄形瓶中。残渣再加10ml乙腈，按上述方法再次提取，合并提取液，于50℃-60℃减压旋蒸至干，用2ml正己烷溶解过柱。将添加适量无水Na₂SO₄的AL₂O₃-N固相萃取小柱，用2ml正己烷活化，然后将正己烷提取液转移至AL₂O₃-N小柱，再用2ml正己烷洗茄形瓶并转移至固相萃取柱中，然后以1-2ml正己烷淋洗，弃去全部正己烷流出液后，将柱子吹干。分别用2ml、2ml、2ml甲醇依次洗脱固相萃取小柱，收集全部甲醇洗脱液至另一茄形瓶中，减压旋蒸至干。然后先加入0.1ml的衍生试剂A，密闭混匀，再加入0.15ml衍生试剂B，密闭混匀，并于25°衍生15min，加入750μl乙腈定容后上机测定。

（c）进样分析，将处理好的样品衍生液注入液相荧光色谱仪，色谱图见图8。

（d）根据仪器色谱工作站给出的峰面积数据，保留时间定性，外标法定量，计算鱼肉样品中阿维菌素和伊维菌素的含量。

（3）测定结果：该样品未检出阿维菌素和伊维菌素。

实施例六是鱼肉样品中阿维菌素和伊维菌素的残留测定的方法学验证

通过考察方法灵敏度、重复性、回收率指标，对本发明的方法进行方法学验证。

（1）灵敏度实验

按照实施例五（b）项所述方法分别处理空白鱼肉样品和加标鱼肉样品，按照实施例一色谱测定条件分析测定，得到空白鱼肉在阿维菌素和伊维菌素保留时间范围内的基线噪声，按照3倍信噪比计算方法定性检出限，10倍信噪比计算方法定性检出限，并经实际加标验证测得阿维菌素和伊维菌素的方法定性检出限为1μg/kg,定量检出限为3μg/kg。

（2）准确度和精密度实验

按照实施例五所述方法处理测定加标鱼肉样品，以确定不同添加水平下测定结果的准确度和精密度。阿维菌素和伊维菌素的添加浓度分别为3ng/ml、10ng/ml和20ng/ml，每个浓度水平做5个平行试验，30d内重复3次，分别计算批内和批间加标回收率及其变异系数，试验结果表明，在3个不同添加水平下，无论是批内还是批间，各测试样品的平均回收率均在75%—110%之间，变异系数均小于10%，由此可见该方法符合相关标准要求，适用性好，重现性好，准确度高。

实施例七是中性氧化铝固相萃取柱在目标物吸附模式下的上样试剂优化试验。

（1）色谱条件同实施例一。

（2）实验步骤

（a）提取同实施例一。

（b）固相萃取：将添加适量无水Na₂SO₄的AL₂O₃-N固相萃取小柱，采用目标物吸附固相萃取模式，分别实施正己烷溶解上样-甲醇洗脱和甲醇溶解上样-甲醇洗脱，仅收集萃取柱吹干后的甲醇洗脱液，待蒸干衍生化。

（c）样品溶液的衍生同实施例1，观察不同溶解上样试剂-仅收集过柱吹干后甲醇洗脱的固相萃取效果。

（d）结果

色谱分析结果如图9，图9是Waters1252色谱工作站得到的色谱图，其中，色谱峰由上至下分别为正己烷溶解上样-仅收集过柱吹干后甲醇洗脱液、甲醇溶解上样-仅收集过柱吹干后甲醇洗脱液的加标样品色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，单位是分钟，纵坐标表示荧光强度。由图9可以看出，对于中性氧化铝固相萃取柱在目标物吸附模式下，正己烷溶解上样、甲醇洗脱更适合于鱼肉中阿维菌素和伊维菌素的富集和净化，且可以获得较高回收率。

由以上方法学验证结果可知，本发明的方法准确度高，重现性好。可以用作鱼肉中阿维菌素和伊维菌素的残留检测。此法可在食品安全及水产品兽药残留检测具有广阔的应用前景。

Claims (9)

1.一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：

步骤一、提取

称取样品5.0g放置于规格为50ml的离心管中，向该离心管中加入10g在650°温度下烘干4小时的无水Na₂SO₄，再向该离心管中加入15ml乙腈，涡旋振荡两分钟，在4000r/min的条件下于离心机中离心操作三分钟，将该离心管中的上清液转移至规格为50ml的茄形瓶中，向该离心管中的残渣里加入10ml乙腈，按照上述方法继续对该离心管中的残渣进行提取，合并两次的提取液，在50℃～60℃条件下于旋蒸仪中，逐步开大旋蒸仪的真空度并将压力保持在-0.08Mpa以下旋蒸至干，向该旋蒸至干的茄型瓶中加入2mL正己烷涡旋溶解，得到正己烷提取液，备用；

步骤二、固相萃取

取中性氧化铝固相萃取柱AgilentBONDELUT-AL-N，规格为500mg/3ml，添加无水硫酸钠Na₂SO₄用于本步骤二的固相萃取操作，向该固相萃取小柱中加入2ml正己烷进行预洗，将步骤一中的正己烷提取液过柱，保持流速在10滴/分钟～15滴/分钟，再用2mL正已烷清洗该茄形瓶并过柱，然后用1ml～2ml正己烷淋洗该固相萃取柱并吹干，弃去全部正己烷流出液，依次取2ml、2ml、1ml甲醇对该固相萃取小柱进行洗脱操作，收集全部甲醇洗脱液于另一干燥的茄形瓶中，在50℃～60℃条件下于旋蒸仪中减压即逐步开大旋蒸仪的真空度并将压力保持在-0.08Mpa以下旋蒸至干，该旋蒸至干的茄形瓶备用；

步骤三、样品溶液的衍生

向步骤二中旋蒸至干的茄形瓶里加入100μL衍生化试剂，该衍生化试剂为乙腈与N-甲基咪唑等比例混合，立即密闭并涡旋混匀，再加入150μL衍生化试剂，该衍生化试剂为乙腈与三氟乙酸酐按2:1比例混合，立即密闭并并涡旋混匀，于控温箱中25℃衍生化反应15分钟，取出后加入750μl乙腈，经过0.45μm滤膜过滤后注入HPLC色谱仪分析；

其中衍生化试剂A液为乙腈与N-甲基咪唑等比例混合，使用前制备，

衍生化试剂B液为乙腈与三氟乙酸酐按2:1比例混合，使用前制备；

步骤四、结果

设定适宜的HPLC色谱仪荧光检测色谱条件，供分析用；

将不同浓度的阿维菌素和伊维菌素标准衍生溶液上机测定，绘制标准曲线；

将步骤三中制备的待测样品衍生溶液进行液相色谱分析，采用外标法定量，根据定量结果计算待测样品中阿维菌素和伊维菌素的含量。

2.根据权利要求1所述的一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：所述的步骤一中称取鱼肉样品5.0g精确至0.01g。

3.根据权利要求1所述的一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：本检测方法在鱼肉组织中的阿维菌素和伊维菌素最低检出限为1μg/kg,定量限为3μg/kg。

4.根据权利要求1所述的一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：本检测方法在淡水养殖鱼类肌肉中阿维菌素在3μg/kg、10μg/kg、20μg/kg添加浓度的回收率为75%～110%；伊维菌素在3μg/kg、10μg/kg、20μg/kg添加浓度的回收率为75%～110%。

5.根据权利要求1所述的一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：本检测方法的批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%。

6.根据权利要求1所述的一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：本检测方法检测信号仅与阿维菌素和伊维菌素有关。

7.根据权利要求1所述的一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：本检测方法的色谱柱为C₁₈反相柱，250mm×4.6mm，粒径5μm；流动相为甲醇；流速为1mL/min；柱温为30℃；激发波长为365nm；发射波长为475nm；进样量为20μL。

8.根据权利要求1所述的一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：本检测方法中的甲醇为色谱纯；乙腈为色谱纯；正己烷为色谱纯；无水硫酸钠为分析纯；阿维菌素标准衍生溶液为CAS71751-41-2，纯度≥97.0%；伊维菌素标准衍生溶液为CAS70288-86-7，纯度≥96.0%；N-甲基咪唑为化学纯，含量≥99.0%；三氟乙酸酐为化学纯，含量≥99.0%。

9.根据权利要求1所述的一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法，其特征是：本检测方法中的色谱仪为高效液相色谱仪，配有Waters1525Binary HPLCPump输液泵系统和Waters2475Multi λFluorescence Detector荧光检测器。

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