CN115128179B

CN115128179B - 同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法和应用

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Publication number: CN115128179B
Application number: CN202210595808.3A
Authority: CN
Inventors: 陈永平; 成振华; 王辉; 韩现芹; 时文博; 王愿宁; 吴玉凡; 王娟娟; 李春青; 李彤; 钱坤; 高丽娜; 史燕燕
Original assignee: Tianjin Agricultural Ecological Environment Monitoring And Agricultural Product Quality Inspection Center
Current assignee: Tianjin Agricultural Ecological Environment Monitoring And Agricultural Product Quality Inspection Center
Priority date: 2022-05-30
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2042-05-30
Also published as: CN115128179A

Abstract

本发明公开一种同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法，步骤如下：(1)标准溶液配制；(2)样品前处理；(3)采用固相萃取柱净化；(4)液相色谱条件；(5)质谱条件。本方法采用液质质联用仪测定解决了液相色谱仪测定灵敏度低、容易受基质干扰的造成假阳性的问题，扑草净的检出限为0.2μg/kg，阿维菌素、伊维菌素的检出限均为2.0μg/kg，相对标准偏差3.5％，本方法灵敏度高、定量定性准确(扑草净在0.5‑15ng/ml，阿维菌素、伊维菌素在5.0‑150ng/ml添加浓度范围内回收率在89.2％～105.3％之间)，重现性好(相对标准偏差为1.3％～7.1％)。

Description

同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法和应用

技术领域

本发明属于检测技术领域，尤其是一种同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法和应用。

背景技术

为了满足人们日益增长的水产品的需求，水产品高密度养殖增加产品供应量成为解决满足需求的主要途径之一，在高密度闭环养殖模式下，一旦水质恶化处理不好就会导致疾病频发，相应加剧了养殖者对药物控制的依赖，同时促生长、杀虫、除杂和环境改良剂(水质改良剂、底质改良剂、微生态制剂)应运而生，以上非药品统称为“非规范药品”，因具有抗病、杀虫、除草、促生长等功能，备受养殖者的青睐。由于非规范药品未注明添加成分，养殖者在不知情的情况下大量使用，导致水产养殖环境中扑草净等除草剂，阿维菌素、伊维菌素等杀虫剂过量存在，以致出现水产品中药残超标现象，食用扑草净后会引起人体免疫系统、生殖系统、内分泌系统和神经系统异常，食用少量阿维菌素、伊维菌素会产生运动失调、呼吸缓慢等症状，过量会导致重度昏迷甚至死亡。农业农村部制定了《2020年水产养殖用兽药及其他投入品安全隐患排查计划》，加大对水产养殖用非规范用药中药物监督排查力度，因非规范用药作为新型投入品，学者对其中药物检测技术研究较少，没有现成的标准或方法依据可参考，给非规范药品中药物的监督监测造成较大困难，因此开发非规范用药中药物检测技术十分必要。

阿维菌素类药物，目前主要检测方法是酶联免疫法、液相色谱法(荧光法、紫外法)和液相色谱-串联质谱法，液相色谱法灵敏度低，干扰影响因素多，荧光法涉及衍生化处理，操作复杂，而高效液相色谱-串联质谱法具有高选择性和高灵敏度，应用较为广泛，食品中的扑草净残留测定方法主要有高效液相色谱法、液相色谱仪串联质谱法、气相色谱法、气相质谱法，但水产养殖用非规范药品中以上药物的同时测定方法还未见报道。

通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、一种聚丙烯微塑料吸附扑草净最大量的方法(CN112107884A)，采用高效液相色谱法测定聚丙烯微塑料对扑草净的吸附量，以甲醇+水＝75+25为流动相，使用C₁₈色谱柱，在222nm波长条件下对扑草净进行定量分析，在吸附时间(2h-144h)时，扑草净的吸附量在2h-72h时快速增加，到96h时达到平台期，继续延长吸附时间，吸附量增加不明显。在不同pH吸附条件下(3-12)下聚丙烯微塑料对扑草净的吸附量随着pH的升高而降低，PH3时吸附量最大。根据数据分析聚丙烯微塑料吸附扑草净最大量的最佳条件为：在吸附时间96h、吸附pH3条件下聚丙烯微塑料对扑草净的吸附量最大。

2、高效液相色谱-浊点萃取测定阿维菌素和伊维菌素含量的方法(CN101806780A)，利用Trion X-114为表面活性剂来分离富集痕量的阿维菌素和伊维菌素,并结合高效液相色谱法进行测定。本发明方法能有效富集痕量阿维菌素和伊维菌素,并且该方法安全,简便、快捷和高效。另外,本发明经浊点萃取体系富集后的所得富集因子较大,且与高效液相色谱法结合后能有效提高该仪器的测定灵敏度,可获得理想的检出限。

3、一种食用植物油中阿维菌素含量的高效液相色谱检测方法(CN106226444A)，其将样品经甲醇涡旋震荡提取后，用ODSC₁₈固相萃取柱净化，以N-甲基咪唑和三氟乙酸酐衍生化，最后以液相色谱-荧光法进行测定。本方法采用的试剂较少，节约成本；样品前处理方法简单，净化效果好，减少了仪器在使用过程中的维护，解决了使用液相色谱-紫外检测器时灵敏度太低，基质干扰较严重的技术问题；测定的结果准确、重复性好，检测的特异性和灵敏度高，为食用植物油中阿维菌素含量的检测提供了参考。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法，步骤如下：

(1)标准溶液配制

储备液：准确称取扑草净、阿维菌素、伊维菌素、扑草净内标化合物，分别用甲醇定容，分别配制成质量浓度为100μg/mL的外标和内标标准储备液；

工作液：用定容溶液配制成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0ng/mL的扑草净溶液，2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、150ng/mL的阿维菌素溶液、伊维菌素溶液，10ng/mL的扑草净内标溶液；

其中，定容溶液为按体积比为3:7的甲醇和0.1％甲酸-醋酸铵溶液的混合液，0.1％甲酸-醋酸铵溶液的配制方法为：取浓度为2mmol/L的醋酸铵溶液，向其中加入甲酸，甲酸的添加终体积浓度为0.1％；

(2)样品前处理

固态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品固态样品，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液，加入后保证浓度是10ng/mL，然后加入超纯水，匀浆机均质20sec，超声波震荡5min，10000r/min离心5min，上清液使用超纯水定容，待净化；

液态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品液态样品，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液，加入后保证浓度是10ng/mL，然后加入超纯水，涡旋震荡1min，10000r/min离心5min，上清液使用超纯水定容，待净化；

其中，固态样品或液态样品：扑草净内标溶液：超纯水：定容体积的比例g：μL：mL：mL为1：10：20：100；

(3)采用固相萃取柱净化

活化：先用甲醇而后用超纯水活化，充分浸润填料，清洗固相萃取柱上面的干扰杂质以及溶剂残留；

上样：将待净化的样品溶液流过固相萃取柱，流速不能太快，流速为1滴/秒，否则吸附不完全，会导致回收率降低；

淋洗：用超纯水淋洗，清洗掉一些干扰杂质；

洗脱：用洗耳球将固相萃取柱内的淋洗液吹干，然后用甲醇洗脱，再用洗耳球吹干；

洗脱液40℃下氮气吹至近干，加入1.0mL定容溶液，涡旋1min，超声波震荡1min，转入离心管中，20000r/min高速离心5min，过0.2μm微滤膜，待UPLC-MS/MS测定；

(4)液相色谱条件

色谱柱为WatersAcqutyUPLCC₁₈柱100.0mm×2.1mmi.d.,1.7μmparticlesize或等效色谱柱；流动相A为0.1％甲酸-醋酸铵溶液，流动相B为甲醇；流速0.2mL/min；柱温40℃，进样体积5.0μL；采用梯度洗脱分离扑草净、阿维菌素、伊维菌素化合物，洗脱条件如下：

其中，示流动相A体积分数，示流动相B体积分数；

0.1％甲酸-醋酸铵溶液的配制方法为：取浓度为2mmol/L的醋酸铵溶液，向其中加入甲酸，甲酸的添加终体积浓度为0.1％；

(5)质谱条件

离子化模式为电喷雾离子源(ESI)正离子模式；离子源温度550℃；气帘气20psi；碰撞气(CAD)Medium；喷雾电压4500v；辅气1：50psi；辅气2：50psi；扫描模式为多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量如下：

注：^*代表定量离子。

进一步地，具体步骤如下：

步骤如下：

(1)标准溶液配制

储备液：准确称取扑草净、阿维菌素、伊维菌素、扑草净内标化合物各10mg，分别用甲醇定容至100mL，分别配制成质量浓度为100μg/mL的外标和内标标准储备液；

(2)样品前处理

固态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品固态样品1.00g于50mL塑料离心管中，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液10μL，加入后保证浓度是10ng/mL，然后加入20mL超纯水，匀浆机均质20sec，超声波震荡5min，10000r/min离心5min，上清液转入200mL带刻度的塑料瓶中，超纯水定容至100mL，待净化；

液态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品液态样品1.00g于50mL塑料离心管中，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液10μL，加入后保证浓度是10ng/mL，然后加入20mL超纯水，涡旋震荡1min，10000r/min离心5min，上清液转入200mL带刻度的塑料瓶中，超纯水定容至100mL，待净化；

(3)采用固相萃取柱净化

活化：先用5mL甲醇而后用5ml超纯水活化，充分浸润填料，清洗固相萃取柱上面的干扰杂质以及溶剂残留；

上样：将100mL待净化的样品溶液流过固相萃取柱，流速不能太快，流速为1滴/秒，否则吸附不完全，会导致回收率降低；

淋洗：用5mL超纯水淋洗，清洗掉一些干扰杂质；

洗脱：用洗耳球将固相萃取柱内的淋洗液吹干，然后用6mL甲醇洗脱于15mL塑料离心管中，再用洗耳球吹干；

洗脱液40℃下氮气吹至近干，加入1.0mL定容溶液，涡旋1min，超声波震荡1min，转入1.5mL离心管中，20000r/min高速离心5min，过0.2μm微滤膜，待UPLC-MS/MS测定；

(4)液相色谱条件

色谱柱为Waters Acquty UPLCC₁₈柱100.0mm×2.1mmi.d.,1.7μm particle size或等效色谱柱；流动相A为0.1％甲酸-醋酸铵溶液，流动相B为甲醇；流速0.2mL/min；柱温40℃，进样体积5.0μL；采用梯度洗脱分离扑草净、阿维菌素、伊维菌素化合物，洗脱条件如下：

其中，示流动相A体积分数，示流动相B体积分数；

(5)质谱条件

离子化模式为电喷雾离子源(ESI)正离子模式；离子源温度550℃；气帘气20psi；碰撞气(CAD)：Medium；喷雾电压4500v；辅气1：50psi；辅气2：50psi；扫描模式为多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量如下：

注：*代表定量离子。

进一步地，所述步骤(3)中固相萃取柱为NPOHLB固相萃取柱。

进一步地，扑草净在质量浓度0.2～15.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r＝0.9989；阿维菌素、伊维菌素在质量浓度2.0～150.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r在0.9969-0.9989之间。

进一步地，所述方法测定时，扑草净的检出限为0.2μg/kg，阿维菌素、伊维菌素的检出限为2.0μg/kg，扑草净的定量限为0.5μg/kg，阿维菌素、伊维菌素的定量限为5.0μg/kg。

进一步地，所述方法中扑草净在0.5-15ng/ml、阿维菌素、伊维菌素在5.0-150ng/ml添加浓度范围内回收率在89.2％～105.3％之间；所述方法的重现性好，相对标准偏差为1.3％～7.1％。

如上所述的方法在水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素的同时测定方面中的应用。

进一步地，所述水产养殖用非规范药品为水质改良剂、底质改良剂、微生态制剂、杀虫剂或促生长剂。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法采用超高效液相色谱-串联质谱法，开发了同时测定渔用非规范用药中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留，该方法操作简便、快速灵敏、准确可靠。

2、本发明方法建立了超高效液相色谱质谱联用法同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法。样品经过0.45μm滤膜过滤、HLB固相萃取柱提取净化后，采用液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。扑草净(prometrazine)在0.2-15ng/mL质量浓度范围内线性良好(r≥0.9989)。阿维菌素(avermectin)、伊维菌素(lvermectin)在0.2-15ng/mL质量浓度范围内线性良好(r≥0.9969)。扑草净的检出限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg；阿维菌素、伊维菌素的检出限均为2.0μg/kg，定量限为5.0μg/kg。扑草净在0.5μg/kg、15μg/kg加标水平时，加标回收率为94％-105.3％，精密度小于7.1％。阿维菌素、伊维菌素在5.0μg/kg、150μg/kg加标水平时，加标回收率为89.2％-101％，精密度小于6.5％。该方法简单、快速、灵敏、准确，单个样品提取净化时间仅90min，适用于水产养殖用非规范药品基质中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的测定。

3、本发明方法有害试剂使用量少，每个样品仅需10mL甲醇，既节约成本，又减少对环境的污染。

4、本发明方法采用液质质联用仪测定解决了液相色谱仪测定灵敏度低、容易受基质干扰的造成假阳性的问题，扑草净的检出限为0.2μg/kg，阿维菌素、伊维菌素的检出限均为2.0μg/kg，相对标准偏差(RSD)3.5％，本方法灵敏度高、定量定性准确(扑草净在0.5-15ng/ml，阿维菌素、伊维菌素在5.0-150ng/ml添加浓度范围内回收率在89.2％～105.3％之间)，重现性好(相对标准偏差为1.3％～7.1％)。

5、本发明方法实现了扑草净、阿维菌素、伊维菌素同时提取、同时上机检测，缩短了化合物分开提取、分开上机检测时间，单个样品提取仅需60min。现有GB/T18629-2002食品中扑草净残留量的测定方法检测时常大约120min，GB29695-2013水产品中阿维菌素和伊维菌素多残留的测定检测时长大约170min，检测总时长大于290min，较现有技术，本方法检测效率明显提高。

6、本发明方法适合水产养殖用非规范药品(水质改良剂、底质改良剂、微生态制剂、杀虫剂、促生长剂)固态、液态复杂基质中药物的提取、净化效果好，不会对仪器产生污染，2020年-2021年共检测样品79个，其中微生态制剂样品30个，水质改良剂样品16个，促生长剂样品13个，杀虫剂样品6个，底质改良剂3个，饲料样品11个，其中1个杀虫剂样品中检出阿维菌素残留量为716mg/kg，扑草净及伊维菌素均未检出。

附图说明

图1为本发明中甲醇-水作为流动相色谱图(50ng/mL)；

图2为本发明中乙腈-水作为流动相色谱图(50ng/mL)；

图3为本发明中乙腈-0.1％甲酸乙酸铵溶液作为流动相色谱图(50ng/mL)；

图4为本发明中甲醇-0.1％甲酸乙酸铵溶液作为流动相色谱图(50ng/mL)；

图5为本发明中ThermoC₁₈柱作为色谱柱分离色谱图(50ng/ml)；

图6为本发明中Waters Acquty UPLCC₁₈柱作为色谱柱分离色谱图(50ng/mL)；

图7为本发明中Waters Acquty UPLCC₁₈柱作为色谱柱分离色谱图(50ng/mL)；

图8为本发明中正离子扫描模式色谱图；

图9为本发明中负离子扫描模式下色谱图；

图10为本发明中化合物标准色谱图；

图11为本发明中扑草净的标准曲线；

图12为本发明中阿维菌素的标准曲线；

图13为本发明中阿维菌素的标准曲线；

图14为本发明中的检出限色谱图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

(1)标准溶液配制

(2)样品前处理

(3)采用固相萃取柱净化

淋洗：用超纯水淋洗，清洗掉一些干扰杂质；

(4)液相色谱条件

色谱柱为Waters Acquty UPLCC₁₈柱100.0mm×2.1mmi.d.,1.7μm particlesize或等效色谱柱；流动相A为0.1％甲酸-醋酸铵溶液，流动相B为甲醇；流速0.2mL/min；柱温40℃，进样体积5.0μL；采用梯度洗脱分离扑草净、阿维菌素、伊维菌素化合物，洗脱条件如下：

其中，示流动相A体积分数，示流动相B体积分数；

(5)质谱条件

离子化模式为电喷雾离子源(ESI)正离子模式；离子源温度550℃；气帘气20psi；碰撞气(CAD)Medium；喷雾电压±4500v；辅气1：50psi；辅气2：50psi；扫描模式为多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量如下：

注：^*代表定量离子。

较优地，具体步骤如下：

步骤如下：

(1)标准溶液配制

(2)样品前处理

(3)采用固相萃取柱净化

淋洗：用5mL超纯水淋洗，清洗掉一些干扰杂质；

(4)液相色谱条件

其中，示流动相A体积分数，示流动相B体积分数；

(5)质谱条件

离子化模式为电喷雾离子源(ESI)正离子模式；离子源温度550℃；气帘气20psi；碰撞气(CAD)：Medium；喷雾电压±4500v；辅气1：50psi；辅气2：50psi；扫描模式为多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量如下：

注：^*代表定量离子。

较优地，所述步骤(3)中固相萃取柱为NPOHLB固相萃取柱。

较优地，扑草净在质量浓度0.2～15.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r＝0.9989；阿维菌素、伊维菌素在质量浓度2.0～150.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r在0.9969-0.9989之间。

较优地，所述方法测定时，扑草净的检出限为0.2μg/kg，阿维菌素、伊维菌素的检出限为2.0μg/kg，扑草净的定量限为0.5μg/kg，阿维菌素、伊维菌素的定量限为5.0μg/kg。

较优地，所述方法中扑草净在0.5-15ng/ml、阿维菌素、伊维菌素在5.0-150ng/ml添加浓度范围内回收率在89.2％～105.3％之间；所述方法的重现性好，相对标准偏差为1.3％～7.1％。

较优地，所述水产养殖用非规范药品为水质改良剂、底质改良剂、微生态制剂、杀虫剂或促生长剂。

具体地，相关制备及检测实施例如下：

1、材料和方法

1)材料与试剂

主要包括：HLB固相萃取柱(6mL/500mg，宁波鸿谱仪器科技有限公司)；扑草净、阿维菌素、伊维菌素、氘代扑草净(纯度≥98％,德国Dr.Ehrensorfer公司)；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵(色谱纯，美国Fisher公司)；实验用水为超纯水。

2)仪器和设备

主要包括：AB5500Qtrap三重四极杆质谱(ABSciex公司)；电子天平(Sartoriusgz公司)；高速冷冻离心机(Sigma公司)；转速10000r/min高速组织匀浆机(飞利浦公司)；MS1Mini-shaker涡轮振荡器(IKA公司)；MiLLi-Q纯水器(Millipore公司)；氮吹仪(Organomation Associates公司)；超声波震荡仪(BUCHI公司)；移液器(Eppendorf公司)。

3)方法与步骤

①标准溶液配制

准确称取扑草净、阿维菌素、伊维菌素、扑草净内标化合物各10mg，分别用甲醇定容至100mL，配制成质量浓度为100μg/mL的单外标与内标标准储备液，在-18℃下避光保存。吸取外标储备液扑草净0.1mL，阿维菌素、伊维菌素各1.0mL，0.1％甲酸-醋酸铵溶液(2mmol/L)定容至100mL，配制成扑草净0.1μg/mL，阿维菌素、伊维菌素1.0μg/mL的混合外标中间液。吸取内标储备液1.0mL，0.1％甲酸-醋酸铵溶液(2mmol/L)定容至100mL，配制成1.0μg/mL混合内标中间液。取上述中间液，用0.1％甲酸-醋酸铵溶液(2mmol/L)稀释成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0ng/mL(扑草净)，2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、150ng/mL(阿维菌素、伊维菌素)。

②样品前处理

固态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品(天津水产养殖合作社)固态样品1.00g于50mL塑料离心管中，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液10μL，然后加入20mL超纯水，匀浆机均质20sec，超声波震荡5min，10000r/min离心5min，上清液转入200mL带刻度的塑料瓶中，超纯水定容至100mL，待净化。

液态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品(天津水产养殖合作社)液态样品1.00g于50mL塑料离心管中，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液10μL，然后加入20mL超纯水，涡旋震荡1min，10000r/min离心5min，上清液转入200mL带刻度的塑料瓶中，超纯水定容至100mL，待净化。

③净化

活化：先用5mL甲醇而后用5ml超纯水活化，充分浸润填料，清洗固相萃取柱上面的干扰杂质以及溶剂残留。

上样：将100mL待净化的样品溶液流过固相萃取柱，一般流速不能太快(通常1滴/秒)，否则吸附不完全，会导致回收率降低。

淋洗：用5mL超纯水淋洗，清洗掉一些干扰杂质。

洗脱：用洗耳球将固相萃取柱内的淋洗液吹干，然后用6mL甲醇洗脱于15mL饲料离心管中，再用洗耳球吹干。

洗脱液40℃下氮气吹至近干，加入1.0mL0.1％甲酸-醋酸铵溶液(2mmol/L)定容溶液，涡旋1min，超声波震荡1min，转入1.5mL离心管中，20000r/min高速离心5min，过0.22μm微滤膜，待UPLC-MS/MS测定。

④液相色谱条件

色谱柱为Waters Acquty UPLC(100.0mm×2.1mmi.d.,1.7μm particle size)；流动相A为0.1％甲酸-醋酸铵溶液(2mmol/L)，流动相B为甲醇；流速0.2mL/min；柱温40℃，进样体积5.0μL。采用梯度洗脱分离扑草净、阿维菌素、伊维菌素化合物，洗脱条件见表1。

表1流动相梯度洗脱程序

注：示流动相A体积分数，示流动相B体积分数。

⑤质谱条件

离子化模式为电喷雾离子源(ESI)正离子模式；离子源温度550℃；气帘气20psi；碰撞气(CAD)Medium；喷雾电压±4500v；辅气1：50psi；辅气2：50psi；扫描模式为多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2目标化合物质谱条件度

注：“*”代表定量离子。

2、结果与讨论

1)色谱条件的优化

①流动相的选择

为同时使扑草净、阿维菌素、伊维菌素获得理想的峰形、灵敏度与分离效果，选取了a)乙腈-0.1％甲酸乙酸铵溶液(2mmol/L)、b)甲醇-0.1％甲酸乙酸铵溶液(2mmol/L)、c)甲醇-水、d)乙腈-水4种不同的流动相体系进行对比。实验结果表明用甲醇-水与乙腈-水做流动相时仅阿维菌素出现色谱响应，扑草净、伊维菌素无响应信号，用a)或b)做流动相时，在同等浓度条件下，b)流动相响应强度明显较a)流动相大，因此选择，甲醇-0.1％甲酸乙酸铵溶液(2mmol/L)做为流动相。如图1至图4所示。

②色谱柱的选择

分别选择，Shim-pack XR-ODSC₈柱(75.0mm×2.1mmi.d.，2.2μm particlesize)、Thermo C₁₈柱(100.0mm×2.1mmi.d.，5.0μmparticle size)以及Waters Acquty UPLC C₁₈柱(100.0mm×2.1mmi.d.,1.7μm particle size)，以甲醇-0.1％甲酸乙酸铵溶液(2mmol/L)为流动相进行梯度洗脱。如图5至图7所示，试验结果表明，以Shim-pack XR-ODSC₈柱作为分离柱，阿维菌素、伊维菌素峰形较差，响应强度较低，以Thermo C₁₈柱作为分离柱，半峰宽较宽，响应强度较低，以Waters Acquty UPLC C₁₈柱作为分离柱峰形好，响应强度高，因此，实验选择Waters Acquty UPLC C18柱(100.0mm×2.1mmi.d.,1.7μm particle size)作为色谱分离柱。

2)提取净化方式的选择

试验选择了3个品牌HLB(500mg/6mL)固相萃取柱作为目标化合物净化提取柱，分别是宁波鸿谱仪器科技有限公司生产的NPO HLB柱、Waters OASIS HLB柱、ANPELLoboratory Technologies公司生产的CNW HLB柱，另外还选择比较了二氯甲烷、乙酸乙酯液液萃取方式提取效果，如表3所示，试验结果表明，OASIS HLB柱净化效果最好，平均回收率为90.8％-95.1％，缺点自然流速过柱时间长，NPO HLB优点是自然流速过柱速度最快，柱净化效果一般，平均回收率为92.4％-96.2％，CNW HLB柱自然流速过柱速度较快，净化效果较好，缺点是平均回收率为82.7％-84.4％，回收效果不理想，采用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取平均回收率均较固相萃取柱差，不适合大批量提取，综合考虑大批量样品处理，采用NPOHLB作为固相萃取柱，既能满足速度快，也满足准确度高的要求。

表3不同提取方式加标回收率与精密度

3)扫描模式的选择

为获得扑草净、阿维菌素、伊维菌素较理想的信号强度，比较了正离子与负离子扫描模式下个目标化合物的响应强度，在负离子扫描模式下，阿维菌素、伊维菌素响应强度较低，按≥3倍S/N计算，扑草净检出限为5μg/kg，阿维菌素、伊维菌素检出限为100μg/kg，在正离子扫描模式下，分别用甲醇、乙腈、乙腈-0.1％甲酸乙酸铵溶液(2mmol/L)(3:7)、甲醇-0.1％甲酸乙酸铵溶液(2mmol/L)(3:7)作为定容溶液，如图8和图9所示，结果表明乙腈--0.1％甲酸乙酸铵溶液(2mmol/L)作为定容溶液其化合物母离子[M+NH₄]⁺响应值最高，按≥3倍S/N计算，扑草净检出限可达到0.2μg/kg，阿维菌素、伊维菌素检出限可达到2.0μg/kg，因此，试验选择以V_甲醇：V_{0.1％甲酸-醋酸铵溶液(2mmol/L)}(3:7)作为定容溶液，正离子模式扫描。

4)标准曲线、检出限和定量限

用(3:7)定容溶液将扑草净、阿维菌素、伊维菌素标准溶液稀释成梯度混合标准液，扑草净的质量浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和15.0ng/mL，阿维菌素、伊维菌素质量浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、150.0ng/mL。在上述液相色谱和质谱条件下，以扑草净-D为内标，用仪器自带工作站按内标法进行自动计算，以峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标Y、化合物浓度与内标物浓度比值为横坐标X，绘制标准曲线，再根据样品的峰面积响应值与内标物峰面积比值，利用标准曲线，算得样品制备液的实际测定浓度。实验结果表明，扑草净在质量浓度0.2～15.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r＝0.9989；阿维菌素、伊维菌素在质量浓度2.0～150.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r在0.9969-0.9989之间，结果见表4、图10至图14。检出限按≥3倍S/N计算，扑草净检出限为0.2μg/kg，阿维菌素、伊维菌素检出限为2.0μg/kg，定量限按≥10倍S/N计算，扑草净定量限为0.5μg/kg，阿维菌素、伊维菌素定量限为5.0μg/kg。标准色谱图见图4。

表4扑草净、阿维菌素、伊维菌素的回归方程以及相关系数

5)方法回收率和精密度

选取空白固态和液态非规范用药样品，分别添加3个浓度水平的标准溶液，每个浓度水平制备6个平行样品计算添加回收率，在添加浓度范围内，扑草净、阿维菌素、伊维菌素的回收率在89.2％～105.3％之间，相对标准偏差为1.3％～7.1％(如表5所示)，因此，本方法适合水产品基质中上述药物残留测定。

表5样品中化合物的加标回收率及精密度

6)实际样品的测定

使用本发明建立的方法用于天津市场的79个非规范用药样品：杀虫剂、促生长剂、水质改良剂、底质改良剂、微生态制剂、渔用饲料进行分析检测，其中有1个样品中检出阿维菌素，其残留量为718mg/kg，其他均未检出。

3、结论

本发明建立了液质质联用法同时测定非规范用药中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的分析方法，扑草净在质量浓度0.2～15.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r＝0.9989；阿维菌素、伊维菌素在质量浓度2.0～150.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r在0.9969-0.9989之间，结果见表4。扑草净检出限为0.2μg/kg，阿维菌素、伊维菌素检出限为2.0μg/kg，扑草净定量限为0.5μg/kg，阿维菌素、伊维菌素定量限为5.0μg/kg。现有上述药物检测技术检测基质主要包括食品与水，GB/T18629-2002与SN/T1968-2007中规定食品中扑草净的检出限分别为20μg/kg、10μg/kg。SC/T9412-2014中规定水、底质中扑草净的检出限分别为0.3μg/L、16μg/kg。GB29695-2013中规定水产品中阿维菌素、伊维菌素检出限为2.0μg/kg，GB-31658.16-2021中规定食品中阿维菌素、伊维菌素的检出限为0.2μg/kg，还没有报道水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留测定技术，具有较强的创新性，本发明方法快速、灵敏、准确且简单，能满足实验室质量控制规范的技术要求。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims

1.一种同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)标准溶液配制

(2)样品前处理

固态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品固态样品，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液，加入后保证内标溶液浓度是10ng/mL，然后加入超纯水，匀浆机均质20sec，超声波震荡5min，10000r/min离心5min，上清液使用超纯水定容，待净化；

液态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品液态样品，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液，加入后保证内标溶液浓度是10ng/mL，然后加入超纯水，涡旋震荡1min，10000r/min离心5min，上清液使用超纯水定容，待净化；

(3)采用固相萃取柱净化

淋洗：用超纯水淋洗，清洗掉一些干扰杂质；

洗脱液40℃下氮气吹至近干，加入1.0mL定容溶液，涡旋1min，超声波震荡1min，转入离心管中，20000r/min高速离心5min，过0.2μm微孔滤膜，待UPLC-MS/MS测定；

(4)液相色谱条件

色谱柱为Waters Acquty UPLC C₁₈柱100.0mm×2.1mm i.d.,1.7μm particle size或等效色谱柱；流动相A为0.1％甲酸-醋酸铵溶液，流动相B为甲醇；流速0.2mL/min；柱温40℃，进样体积5.0μL；采用梯度洗脱分离扑草净、阿维菌素、伊维菌素化合物，洗脱条件如下：

其中，示流动相A体积分数，示流动相B体积分数；

(5)质谱条件

离子化模式为电喷雾离子源正离子模式；离子源温度550℃；气帘气20psi；碰撞气：Medium；喷雾电压4500v；辅气1：50psi；辅气2：50psi；扫描模式为多反应监测，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量如下：

注：^*代表定量离子；

所述步骤(3)中固相萃取柱为NPO HLB固相萃取柱。

2.根据权利要求1所述的同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法，其特征在于：具体步骤如下：

步骤如下：

(1)标准溶液配制

(2)样品前处理

固态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品固态样品1.00g于50mL塑料离心管中，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液10μL，加入后保证内标溶液浓度是10ng/mL，然后加入20mL超纯水，匀浆机均质20sec，超声波震荡5min，10000r/min离心5min，上清液转入200mL带刻度的塑料瓶中，超纯水定容至100mL，待净化；

液态样品处理：准确称取水产养殖用非规范药品液态样品1.00g于50mL塑料离心管中，加入1.0μg/mL扑草净内标溶液10μL，加入后保证内标溶液浓度是10ng/mL，然后加入20mL超纯水，涡旋震荡1min，10000r/min离心5min，上清液转入200mL带刻度的塑料瓶中，超纯水定容至100mL，待净化；

(3)采用固相萃取柱净化

淋洗：用5mL超纯水淋洗，清洗掉一些干扰杂质；

洗脱液40℃下氮气吹至近干，加入1.0mL定容溶液，涡旋1min，超声波震荡1min，转入1.5mL离心管中，20000r/min高速离心5min，过0.2μm微孔滤膜，待UPLC-MS/MS测定；

(4)液相色谱条件

其中，示流动相A体积分数，示流动相B体积分数；

(5)质谱条件

离子化模式为电喷雾离子源正离子模式；离子源温度550℃；气帘气20psi；碰撞气Medium；喷雾电压4500v；辅气1：50psi；辅气2：50psi；扫描模式为多反应监测，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量如下：

注：^*代表定量离子。

3.根据权利要求1所述的同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法，其特征在于：扑草净在质量浓度0.2～15.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r＝0.9989；阿维菌素、伊维菌素在质量浓度2.0～150.0ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r在0.9969-0.9989之间。

4.根据权利要求1所述的同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法，其特征在于：所述方法测定时，扑草净的检出限为0.2μg/kg，阿维菌素、伊维菌素的检出限为2.0μg/kg，扑草净的定量限为0.5μg/kg，阿维菌素、伊维菌素的定量限为5.0μg/kg。

5.根据权利要求1所述的同时测定水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素残留的方法，其特征在于：所述方法中扑草净在0.5-15ng/ml、阿维菌素、伊维菌素在5.0-150ng/ml添加浓度范围内回收率在89.2％～105.3％之间；所述方法的重现性好，相对标准偏差为1.3％～7.1％。

6.如权利要求1至5任一项所述的方法在水产养殖用非规范药品中扑草净、阿维菌素、伊维菌素的同时测定方面中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述水产养殖用非规范药品为水质改良剂、底质改良剂、微生态制剂、杀虫剂或促生长剂。