CN108414647B - 一种紫脲酸及其相关物质的高效液相色谱分析检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种紫脲酸相关杂质氰乙酸、二甲脲、二甲氰乙酰脲、二甲4AU(6‑氨基‑1,3‑二甲基尿嘧啶)含量测定的方法,采用反相高效液相色谱峰面积归一化法定量分析，色谱条件为：色谱柱：Phenyl C18柱，柱规格：柱长150～250mm，柱内径4.0～4.6mm，填料粒径3.5～5μm；流速：0.9～1.1ml/min；检测波长为205nm；柱温：27～33℃；进样量：20μl；流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝2.8～3.2；B：乙腈；A:B＝(96～98):(2～4)(V/V)；本方法便于生产和质控过程中产品质量的控制，具有成本低，简单易行，准确性及精密度高、稳定性及重现性好的优点。

Description

一种紫脲酸及其相关物质的高效液相色谱分析检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体而言，涉及紫脲酸相关物质的高效液相色谱分析检测方法。
背景技术
紫脲酸(VIOLURIC ACID)，其化学名为1,3-二甲基-4-亚氨基-5-异亚硝基脲嗪,分子式：C4H3N3O4，分子量：157.08。
其结构式为：
Figure GDA0002694029380000011
紫脲酸是咖啡因制备工艺中的重要中间体，是咖啡因质量控制的关键一环。准确对紫脲酸进行检测，可为后续反应提供质量保证。结合紫脲酸工艺路线，对可能存在的工艺杂质、降解产物和其他杂质进行了全面分析。氰乙酸作为反应中间体，结合生产工艺分析，在中间体质量控制中考虑其会有残留。二甲基氰乙酰脲由氰乙酸在醋酐存在下与二甲脲缩合得到，在此步骤中，缩合反应原料二甲脲及缩合产物二甲基氰乙酰脲均有可能残留在紫脲酸中。二甲4AU(6-氨基-1,3-二甲基尿嘧啶)作为环和反应产物引入。
目前紫脲酸尚未有药典标准。王坤丽，赵旭等采用反相高效液相色谱法对紫脲酸样品含量进行检测。其检测方法为：色谱柱：ZARBAX SB-C18，5μm，4.6mm*150mm；检测波长：296nm；柱温：25℃；流速：0.6mL/min；进样量：20μl；流动相：0.02mol/L的KH2PO4溶液：乙腈＝92:8(王坤丽,赵旭,吴丽颖.反相高效液相色谱法快速分析紫脲酸[J].河北工业科技,2015,32(4):318-321.)。
目前为止，没有公开的紫脲酸有关物质的检测方法。经研究发现，在实际操作过程中，该紫脲酸含量测定方法对紫脲酸有关杂质进行分离存在以下不足：
(1)通过对紫脲酸杂质谱的全面分析，采用上述色谱条件进行有关物质分析，紫脲酸与杂质峰、杂质峰与杂质峰之间分离效果较差或不能分离，影响精密度及准确性；
(2)部分杂质在此条件下吸收极弱，不能检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种紫脲酸及其相关物质的高效液相色谱分析检测方法，其特征在于其色谱条件为：
a.色谱柱：Phenyl C18柱；柱规格：柱长150～250mm，柱内径4.0～4.6mm，填料粒径3.5～5μm；
b.流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝2.8～3.2；
B：乙腈；
A:B＝(96～98):(2～4)(V/V)；
c.流速：0.9～1.1ml/min；柱温：27～33℃；进样量：20μl；
d.UV检测器:检测波长为205nm；
e.所述的相关物质为氰乙酸、二甲脲、二甲氰乙酰脲、二甲4AU(6-氨基-1,3-二甲基尿嘧啶)；
样品溶液：精密称取干燥过的紫脲酸约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；
分离度测试溶液：取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液；
所述的紫脲酸及其相关物质的高效液相色谱分析检测方法，其特征在于采用反相高效液相色谱峰面积归一化法定量分析。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明方法采用苯基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，在适当流动相比例范围内，使氰乙酸、二甲脲、二甲氰乙酰脲、二甲4AU与紫脲酸能良好分离，便于生产和质控过程中产品质量的控制，具有成本低，简单易行，准确性及精密度高、稳定性及重现性好的优点。
附图说明
图1：紫脲酸及有关物质氰乙酸、二甲脲、二甲氰乙酰脲、二甲4AU的色谱峰定位图
具体实施方式
根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明技术思想的前提下，还可以做出其他多种形式的修改，替换和变更。
以下通过实施例形式对上述内容作进一步补充说明。
实施例1
实验器材及试剂
(1)实验仪器：
仪器：岛津20A，配紫外检测器
(2)色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl C18柱,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0ml/min；
检测波长：205nm；
柱温：30℃；
进样量：20μl
流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝3.0；B：乙腈；A:B＝97:3(V/V)
(3)实验试剂：
乙腈：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；
三乙胺：天津福晨化学试剂，分析纯
磷酸：天津大茂化学试剂，分析纯
实施步骤：
1.检测波长确定：取紫脲酸及各杂质适量，加流动相溶解稀释成约20ug/ml的溶液，分别在200-400nm扫描，结果均在205nm附近有较强吸收，因此选用205nm作为检测波长。
2.专属性
2.1精密量取流动相20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；结果对杂质测定无干扰。
2.2各成分定位：分别取各化合物适量用流动相溶解成一定浓度的溶液，分别取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰结果氰乙酸：4.031分、二甲脲：4.409分、二甲氰乙酰脲：12.988分、二甲4AU：14.630分、紫脲酸：15.708分。
2.3.分离度试验
取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液(系统适应性)。取溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；紫脲酸与相邻杂质峰分离良好(分离度2.1)，符合要求。
实施例2
实验器材及试剂
(1)实验仪器：
仪器：岛津20A，配紫外检测器
(2)色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl C18柱,4.6×250mm,5μm；
流速：0.9ml/min；
检测波长：205nm；
柱温：30℃；
进样量：20μl
流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝3.0；B：乙腈；A:B＝97:3(V/V)
(3)实验试剂：
乙腈：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；
三乙胺：天津福晨化学试剂，分析纯
磷酸：天津大茂化学试剂，分析纯
实施步骤：
取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液(系统适应性)。取溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；紫脲酸与相邻杂质峰分离良好(分离度2.2)，符合要求。
实施例3
实验器材及试剂
(1)实验仪器：
仪器：岛津20A，配紫外检测器
(2)色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl C18柱,4.6×250mm,5μm；
流速：1.1ml/min；
检测波长：205nm；
柱温：30℃；
进样量：20μl
流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝3.0；B：乙腈；A:B＝97:3(V/V)
(3)实验试剂：
乙腈：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；
三乙胺：天津福晨化学试剂，分析纯
磷酸：天津大茂化学试剂，分析纯
实施步骤：
取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液(系统适应性溶液)。取溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；紫脲酸与相邻杂质峰分离良好，符合要求。
实施例4
实验器材及试剂
(1)实验仪器：
仪器：岛津20A，配紫外检测器
(2)色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl C18柱,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0ml/min；
检测波长为205nm；
柱温：27℃；
进样量：20μl
流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝3.0；B：乙腈；A:B＝97:3
(V/V)
(3)实验试剂：
乙腈：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；
三乙胺：天津福晨化学试剂，分析纯
磷酸：天津大茂化学试剂，分析纯
实施步骤：
取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液(系统适应性溶液)。取溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；紫脲酸与相邻杂质峰分离良好，符合要求。
实施例5
实验器材及试剂
(1)实验仪器：
仪器：岛津20A，配紫外检测器
(2)色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl C18柱,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0ml/min；
检测波长：205nm；
柱温：33℃；
进样量：20μl
流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝3.0；B：乙腈；A:B＝97:3(V/V)
(3)实验试剂：
乙腈：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；
三乙胺：天津福晨化学试剂，分析纯
磷酸：天津大茂化学试剂，分析纯
实施步骤：
取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液(系统适应性溶液)。取溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；紫脲酸与相邻杂质峰分离良好，符合要求。
实施例6
实验器材及试剂
(1)实验仪器：
仪器：岛津20A，配紫外检测器
(2)色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl C18柱,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0ml/min；
检测波长：205nm；
柱温：30℃；
进样量：20μl
流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝3.0；B：乙腈；A:B＝96:4(V/V)
(3)实验试剂：
乙腈：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；
三乙胺：天津福晨化学试剂，分析纯
磷酸：天津大茂化学试剂，分析纯
实施步骤：
取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液(系统适应性溶液)。取溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；紫脲酸与相邻杂质峰分离良好，符合要求。
实施例7
实验器材及试剂
(1)实验仪器：
仪器：岛津20A，配紫外检测器
(2)色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl C18柱,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0ml/min；
检测波长：205nm；
柱温：30℃；
进样量：20μl
流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝2.8；B：乙腈；A:B＝97:3(V/V)
(3)实验试剂：
乙腈：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；
三乙胺：天津福晨化学试剂，分析纯
磷酸：天津大茂化学试剂，分析纯
实施步骤：
取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液(系统适应性溶液)。取溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；紫脲酸与相邻杂质峰分离良好，符合要求。
实施例8
实验器材及试剂
(1)实验仪器：
仪器：岛津20A，配紫外检测器
(2)色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl C18柱,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0ml/min；
检测波长：205nm；
柱温：30℃；
进样量：20μl
流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝3.2；B：乙腈；A:B＝97:3(V/V)
(3)实验试剂：
乙腈：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；
三乙胺：天津福晨化学试剂，分析纯
磷酸：天津大茂化学试剂，分析纯
实施步骤：
取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液(系统适应性溶液)。取溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；紫脲酸与相邻杂质峰分离良好，符合要求。
实施例9
实验器材及试剂
(1)实验仪器：
仪器：岛津20A，配紫外检测器
(2)色谱条件：
色谱柱：不同批次的Phenyl C18柱,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0ml/min；
检测波长：205nm；
柱温：30℃；
进样量：20μl
流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝3.0；B：乙腈；A:B＝97:3(V/V)
(3)实验试剂：
乙腈：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；
三乙胺：天津福晨化学试剂，分析纯
磷酸：天津大茂化学试剂，分析纯
实施步骤：
取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液(系统适应性溶液)。取溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；紫脲酸与相邻杂质峰分离良好，符合要求。

Claims (2)

1.一种紫脲酸及其相关物质的高效液相色谱分析检测方法，其特征在于其色谱条件为：
a.色谱柱：Phenyl C18柱；柱规格：柱长150～250mm，柱内径4.0～4.6mm，填料粒径3.5～5μm；
b.流动相：A:0.2％(V/V)三乙胺水溶液，用磷酸调pH＝2.8～3.2；
B：乙腈；
A:B＝(96～98):(2～4)(V/V)；
c.流速：0.9～1.1ml/min；柱温：27～33℃；进样量：20μl；
d.UV检测器:检测波长为205nm；
e.所述的相关物质为氰乙酸、二甲脲、二甲氰乙酰脲、二甲4AU(6-氨基-1,3-二甲基尿嘧啶)；
样品溶液：精密称取干燥过的紫脲酸约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；
分离度测试溶液：取紫脲酸和杂质适量混合，加流动相溶解，摇匀，作为分离度测试溶液。
2.根据权利要求1所述的紫脲酸及其相关物质的高效液相色谱分析检测方法，其特征在于采用反相高效液相色谱峰面积归一化法定量分析。
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