CN115856138A - 一种用hplc分离测定噁拉戈利钠中有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用HPLC分离测定噁拉戈利钠中有关物质的方法，包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01％～0.10％(V/V)磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为2～5)‑甲醇(90:10～70:30)(V/V)为流动相A、乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；本发明通过考虑流动相、pH值、梯度洗脱程序以及流速、柱温对分离检测的综合影响，可以将噁拉戈利钠中的杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J和杂质K在同一色谱条件进行快速高效的分离，并且该检测方法灵敏度高、专属性强、快速简便、操作方便，可有效控制其质量，适用于分离测定噁拉戈利钠的有关物质。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种用HPLC分离测定噁拉戈利钠中有关物质的方法。
背景技术
噁拉戈利钠(Elagolix sodium，商品名ORILISSA)，由艾伯维公司和NeurovrineBiosciences公司联合开发的一种促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂，其通过与脑垂体中的GnRH受体竞争结合、降低血液循环中的性腺激素水平发挥疗效。2018年7月23日，噁拉戈利钠获批用于治疗子宫内膜异位，成为美国FDA首个批准用于治疗子宫内膜异位症的新药。其分子式：C32H29F5N3O5Na分子量：653.58，化学结构如下式(1)：
噁拉戈利钠是以1-[[2-氟-6-(三氟甲基)苯基]甲基]-5-碘-6-甲基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮(SM1)、2-氟-3-甲氧基苯硼酸(SM2)、N-[(1R)-2-[(甲基磺酰基)氧基]-1-苯乙基]氨基甲酸1,1-二甲基乙基酯(SM3)、4-溴丁酸乙酯(SM4)为起始原料，经过多步反应合成得到。在噁拉戈利钠在制备过程中，因起始原料和合成中间体的残留、合成工艺副产物等因素产生多个杂质，噁拉戈利钠合成工艺如下：
杂质产生情况如下：
起始原料、中间体以及副产物等杂质的分析检测对终产品噁拉戈利钠的质量控制有着重要作用，所以建立一种操作简单、稳定有效的分析检测方法对噁拉戈利钠中杂质进行分析检测是非常必要的。
目前，在公开的专利中，专利(CN 110501446 A)公开了一种噁拉戈利钠原料及其合成中间体的分析方法，对7个杂质进行检测分离，各杂质结构如下：
该专利并没给出噁拉戈利钠的合成工艺，从杂质结构判断，该专利考察了起始原料(SM1、SM2、SM3、SM4)和中间体(M1、M2、M3)等杂质，附图显示有较好的分离度。该专利在杂质控制上存在缺陷，SM3和M1反应生成的中间体(杂质F)未得到质控；SM1、SM2的苯环上的脱氟杂质参与反应生成相应的副产物杂质I、J未得到质控；M3可能会发生分子内反应生成副产物杂质K未得到质控；这些杂质与终产品噁拉戈利钠的质量密切相关，专利(CN110501446 A)没有对这些杂质(I、J、K、F)进行质控，存在质量风险。经研究，专利(CN110501446 A)分析方法的流动相中有机相的占比较低(乙腈的体积百分比为5％～10％)，不能有效的检测出杂质I、J、K、F等杂质，难以满足噁拉戈利钠中有关物质的质控要求。
本发明在噁拉戈利钠的工艺基础上质控所述杂质，噁拉戈利钠、杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K之间可以很好分离，专属性良好；杂质D结构中仅有一个碳氧双键，其紫外光谱吸收值较弱，在其吸收较强的末端紫外波长(205nm)处，杂质D的检测灵敏度仍达不到质控限度要求(限度为不超过0.10％)[注释：专利(CN 110501446 A)分析方法中该杂质占主成分的质量百分比为10％，远达不到有关物质的质控要求]；另外，杂质D在含水的溶剂中易水解，不利于有关物质的质控；因此，本发明中噁拉戈利钠的有关物质方法不进行杂质D质控，另选择GC方法质控杂质D，本文不再叙述。本发明中噁拉戈利钠有关物质控制的杂质结构及分析如下：
发明内容
为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明人在进行了大量的深入研究之后，提供了一种用HPLC分离测定噁拉戈利钠中有关物质的方法，具有快速简便、灵敏度高、分离度好的优点。
本发明采用的技术方案是：
一种用HPLC分离测定噁拉戈利钠中有关物质的方法，包括如下步骤：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01％～0.10％(V/V)磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为2～5)-甲醇(90:10～70:30)(V/V)为流动相A、乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速为0.8～1.2ml/min；柱温为30～40℃；采用紫外检测器进行检测，所述紫外检测器的检测波长为200～230nm。
所述的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，优选Agilent 5TC-C18 250×4.6mm；
所述的流动相A为0.01％～0.10％(V/V)磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为2～5)-甲醇(90:10～70:30)(V/V)。磷酸比例改变主要影响杂质I与杂质E的分离度；pH值改变主要影响杂质A与杂质G，杂质I与杂质E的分离度；甲醇比例改变主要影响杂质I与杂质E、主峰与杂质G的分离度；故优选0.05％(V/V)磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(80:20)(V/V)。
所述的流动相B为乙腈；
所述梯度洗脱的条件为：
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 95～85 | 5～15 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
优选：
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
由此得到的分离效果最佳，峰形最好。
所述的流速为0.8～1.2ml/min，优选1.0ml/min。
所述的柱温为30～40℃，优选35℃。
所述紫外检测器的的检测波长为205～230nm，本品经紫外扫描，在200-230nm处有强吸收且在275nm处有最大吸收；杂质C在275nm处吸收较弱，难以检出；各成分在越接近紫外末端处吸收强度越强，故优选205nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明所述的用HPLC分离测定噁拉戈利钠有关物质的方法，通过考虑流动相、pH值、梯度洗脱程序以及流速、柱温对分离检测的综合影响，使得检测结果达到了最优化，可以将噁拉戈利钠中的杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J和杂质K在同一色谱条件进行快速高效的分离，并且该检测方法灵敏度高、专属性强、快速简便、操作方便，可有效控制其质量，适用于分离测定噁拉戈利钠的有关物质。
附图说明
图1为本发明中按实施例1条件检测的空白溶液的色谱图；
图2为本发明中按实施例1条件检测的系统适用性溶液的色谱图；
图3为本发明中按实施例1条件检测的供试品溶液的色谱图；
图4为本发明中按实施例1条件检测的定量限溶液的色谱图；
图5为本发明中按实施例1条件检测的检测限溶液的色谱图；
图6为本发明中按实施例2条件检测的系统适用性溶液的色谱图(流动相A：0.01％磷酸水溶液(用1mol/LNaOH溶液调节pH为3.5)-甲醇(体积比80:20))；
图7为本发明中按实施例2条件检测的系统适用性溶液的色谱图(流动相A：0.10％磷酸水溶液(用1mol/LNaOH溶液调节pH为3.5)-甲醇(体积比80:20))
图8为本发明中按实施例3条件检测的系统适用性溶液的色谱图(流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/LNaOH溶液调节pH为2.0)-甲醇(体积比80:20))；
图9为本发明中按实施例3条件检测的系统适用性溶液的色谱图(流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/LNaOH溶液调节pH为5.0)-甲醇(体积比80:20))；
图10为本发明中按实施例4条件检测的系统适用性溶液的色谱图(流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/LNaOH溶液调节pH为3.5)-甲醇(体积比90:10))；
图11为本发明中按实施例4条件检测的系统适用性溶液的色谱图(流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/LNaOH溶液调节pH为3.5)-甲醇(体积比70:30))；
图12为本发明中按实施例5条件检测的系统适用性溶液的色谱图(柱温-30℃)；
图13为本发明中按实施例5条件检测的系统适用性溶液的色谱图(柱温-40℃)；
图14为本发明中按实施例6条件检测的系统适用性溶液的色谱图(柱流速-0.8ml/min)；
图15为本发明中按实施例6条件检测的系统适用性溶液的色谱图(柱流速-1.2ml/min)
图16为本发明中按实施例7条件检测的系统适用性溶液的色谱图(梯度起始比例流动相A-流动相B(95：5))；
图17为本发明中按实施例7条件检测的系统适用性溶液的色谱图(梯度起始比例流动相A-流动相B(85：15))
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。所用试剂及仪器未注明生产厂商者，均可以通过市购获得常规产品。
本发明实施例中所用的噁拉戈利钠及杂质对照品均为发明人自制。
实施例1
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18 250×4.6mm
流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(80:20)
流动相B：乙腈
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：205nm
进样量：10μL
梯度洗脱程序为：
表1 梯度洗脱程序
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品、杂质J对照品、杂质K对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取噁拉戈利钠工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取噁拉戈利钠约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
噁拉戈利钠对照品贮备液：取噁拉戈利钠工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
定量限溶液：精密量取所述杂质对照品贮备液及所述噁拉戈利钠对照品贮备液各1ml至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml至25ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：精密量取所述定量限溶液5ml置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：分别将空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液注入高效液相色谱仪进行检测，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(粒径为5μm，柱内径为4.6mm，色谱柱长为250mm)，按表1梯度洗脱程序检测，记录色谱图。
空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液的色谱图分别如图1、2、3、4和5所示，可知，图1表明空白不干扰杂质检查；图2表明各杂质及噁拉戈利钠之间分离度良好，具体噁拉戈利钠系统适用性图谱数据见表2；图3表明自制的噁拉戈利钠样品中未检出杂质A、杂质B、杂质E、杂质F、杂质H、杂质I和杂质J，检出的杂质C、杂质G、杂质K均在0.10wt％以下；检出的其它单个杂质均在0.10wt％以下；图4表明噁拉戈利钠及杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J和杂质K的定量限分别为0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％和0.04wt％；图5表明噁拉戈利钠及杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J和杂质K的检测限分别为0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％和0.02wt％，低于各杂质的限度0.10wt％；本法的检测灵敏度高。
表2实施例1中噁拉戈利钠系统适用性图谱数据表
实施例2
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18 250×4.6mm
流动相A：0.01％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(80:20)或0.10％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(80:20)
流动相B：乙腈
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：205nm
进样量：10μl
梯度洗脱程序为：
表3 梯度洗脱程序
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品、杂质J对照品、杂质K对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取噁拉戈利钠工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：取系统适用性溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。见图6、7。
结果表明，在上述色谱条件下，基线平稳，磷酸浓度升高，杂质E与杂质I的分离度明显降低，其他各峰之间分离度无明显差异，本发明在0.01％～0.10％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)内均可实现11种物质的基线分离。综合分离度及实验室温度等因素，本发明最优选浓度为0.05％磷酸水溶液进行色谱分离。
表4实施例2中噁拉戈利钠系统适用性图谱(不同磷酸浓度)数据表
实施例3
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18 250×4.6mm
流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为2.0)-甲醇(80:20)或0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为5.0)-甲醇(80:20)
流动相B：乙腈
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：205nm
进样量：10μl
梯度洗脱程序为：
表5 梯度洗脱程序
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品、杂质J对照品、杂质K对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取噁拉戈利钠工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：取系统适用性溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。见图8、9。
结果表明，在上述色谱条件下，基线平稳，pH值升高，杂质E与杂质I的分离度略有降低，pH值降低，杂质G与噁拉戈利钠的分离度略有降低，其他各峰之间分离度无明显差异，本发明在0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为2.0～5.0)内均可实现11种物质的基线分离。综合分离度及实验室温度等因素，本发明最优选在0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)下进行色谱分离。
表6实施例3中噁拉戈利钠系统适用性图谱(不同pH值)数据表
实施例4
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18 250×4.6mm
流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(90:10)或0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(70:30)
流动相B：乙腈
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：205nm
进样量：10μl
梯度洗脱程序为：
表7 梯度洗脱程序
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品、杂质J对照品、杂质K对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取噁拉戈利钠工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：取系统适用性溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。见图10、11。
结果表明，在上述色谱条件下，基线平稳，流动相A中甲醇比例升高，各个峰保留时间略有提前，杂质E与杂质I的分离度降低，其他各峰之间分离度无明显差异，本发明流动相A(0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇)的体积比在(90:10～70:30)内均可实现11种物质的基线分离。综合分离度及实验室温度等因素，本发明最优选在0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(80:20)作为流动相A进行色谱分离。
表8实施例4中噁拉戈利钠系统适用性图谱(不同流动相A)数据表
实施例5
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18 250×4.6mm
流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(80:20)
流动相B：乙腈
柱温：30℃/40℃
流速：1.0ml/min
检测波长：205nm
进样量：20μl
梯度洗脱程序为：
表9 梯度洗脱程序
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品、杂质J对照品、杂质K对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取噁拉戈利钠工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：取系统适用性溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。见图12、13。
结果表明，在上述色谱条件下，基线平稳，柱温升高，各峰保留时间略有提前，杂质E与杂质I的分离度降低，其他各峰之间分离度无明显差异，本发明柱温在30-40℃内均可实现11种物质的基线分离。综合分离度及实验室温度等因素，本发明最优选在35℃柱温下进行色谱分离。
表10实施例5中噁拉戈利钠系统适用性图谱(不同柱温)数据表
实施例6
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18 250×4.6mm
流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(80:20)流动相B：乙腈
柱温：35℃
流速：0.8ml/min或1.2ml/min
检测波长：205nm
进样量：10μl
梯度洗脱程序为：
表11 梯度洗脱程序
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品、杂质J对照品、杂质K对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取噁拉戈利钠工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：取系统适用性溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。见图14、15。
结果表明，在上述色谱条件下，基线平稳，流速升高，各峰保留时间略有提前，杂质E与杂质I的分离度降低，其他各峰之间分离度无明显差异，本发明柱流速在0.8-1.2ml/min内均可实现11种物质的基线分离。综合分离度及实验室温度等因素，本发明最优选在1.0ml/min柱流速下进行色谱分离。
表12 实施例6中噁拉戈利钠系统适用性图谱(不同柱流速)数据表
实施例7
在对实例1的色谱条件中主要参数不变情况下，改变流动相梯度来考察梯度变动影响，具体实施内容如下：
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18 250×4.6mm
流动相A：0.05％磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(80:20)
流动相B：乙腈
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：205nm
进样量：10μl
梯度洗脱程序为：
表13 梯度洗脱程序
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 95 | 5 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
或
表14 梯度洗脱程序
| 时间，分钟 | 流动相A，体积％ | 流动相B，体积％ |
| 0 | 85 | 15 |
| 10 | 74 | 26 |
| 35 | 55 | 45 |
| 40 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质E对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质I对照品、杂质J对照品、杂质K对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取噁拉戈利钠工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：取系统适用性溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。见图16、17。
结果表明，在上述色谱条件下，基线平稳，起始比例有机相(流动相B)升高，杂质E与杂质I的分离度明显降低；其他各峰之间分离度无明显差异，本发明在梯度洗脱程序起始比例流动相A-流动相B(95:5～85:15)内均可实现11种物质的基线分离。综合分离度等因素，本发明最优选梯度洗脱程序起始比例为流动相A-流动相B(90:10)。
表15 实施例7中噁拉戈利钠系统适用性图谱(不同梯度初始比例)数据表
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用HPLC分离测定噁拉戈利钠中有关物质的方法，其特征在于：包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.01％～0.10％(V/V)磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为2.0～5.0)-甲醇(90:10～70:30)(V/V)为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为30～40℃，采用紫外检测器进行检测，所述紫外检测器的检测波长为200～230nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，优选Agilent 5TC-C18250×4.6mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相A为0.01％～0.10％(V/V)磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为2.0～5.0)-甲醇(90:10～70:30)(V/V)；优选0.05％(V/V)磷酸水溶液(用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3.5)-甲醇(80:20)(V/V)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：
优选：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流速为0.8～1.2ml/min，优选1.0ml/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的柱温为30～40℃，优选35℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的紫外检测器的检测波长为200～230nm，优选205℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，噁拉戈利钠、杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J和杂质K11种组分之间的分离度＞1.5。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述噁拉戈利钠的杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J和杂质K，具体结构式如下所示：
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