CN105675758B

CN105675758B - 一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法

Info

Publication number: CN105675758B
Application number: CN201610056511.4A
Authority: CN
Inventors: 刘琳; 段小娟; 张丽; 郝鹏飞; 徐琴
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2016-01-27
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2036-01-27
Also published as: CN105675758A

Abstract

本发明涉及一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法，所述方法为HPLC‑示差折光检测法，其特征在于所述HPLC的色谱条件为：色谱柱采用酰胺键合柱，流动相为丙酮、水和三乙胺的单流动相，等度洗脱；柱温：70℃；流速：0.8ml/min；进样量：10μL。本发明检测方法可适用于牛奶、糕点、糖果、奶粉等含乳制品。通过对样品进行简单处理即可检测，该方法快捷，回收率高，方法的线性范围宽，相关系数好，检出限低，填补了乳制品中糖及糖醇同时检测的空白。

Description

一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法

技术领域

本发明涉及一种牛奶、糕点、糖果、奶粉等含乳制品中糖和糖醇的检测方法，特别涉及一种同时检测上述食品中山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖的高效液相色谱检测方法。

背景技术

目前糖类检测方法的研究中，主要有高效液相色谱(HPLC)-荧光检测法(FLD)，HPLC-示差折光法(RID)，离子色谱法，高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)，高效气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)。HPLC-FLD 法虽然灵敏度较高，但是具有较强的选择性；离子色谱法具有较好的重复性和准确性，但是糖类能在电极表面还原样品中某些分子；HPLC-MS/MS法和GC-MS/MS 法虽然具有高分离、高选择、高灵敏的特性，但是其设备昂贵，操作复杂，通用性较差；现行国标中对单、双糖、糖醇的检测方法主要为化学还原法和HPLC-示差折光检测法(RID)，但前者费时，操作繁琐，并且只能对具有还原性的糖进行定量检测，无法准确定性；而HPLC-示差折光检测法(RID)具有操作简便，灵敏度高的优点，是常用的方法。

在国标及日常糖类检测的液相色谱柱方面，目前较常使用的色谱柱是氨基柱，虽然氨基柱在糖类分析中有较高的灵敏度和分离度，但是氨基柱连通的HPLC-示差折光检测器(RID)灵敏度高，系统较难平衡。而且氨基容易水解，当样品通过时，水解产物可以与样品一同进入检测器检测造成干扰。在长时间的使用过程中，流动相通过氨基柱时氨基基团会有脱落，存在噪声；当样品纯度不高时，噪声也会很大，氨基柱的柱效下降很快。氨基柱的柱效下降是由氨基本身特性决定的，使用后的常规保养是起不到太大作用的，所以导致氨基柱的使用寿命较短。

同时，目前用于糖类检测的HPLC常采用反相系统，在流动相的选择上，多选择乙腈和水为流动相，通过乙腈与水不同比例的混合达到分离特定糖类的目的。但是在氨基柱-乙腈水系统的分析中，随着检测糖类数量的增加，氨基柱的柱效下降，部分糖类不能有效的分离。为了增大分离度，就需要不断调整乙腈水的比例，但是当有机相乙腈比例增大到一定程度后，氨基柱有效键合就会被破坏，从而降低柱寿命。

鉴于不同国家对糖及糖醇的不同要求和食品标签强制性标准的施行，以及进一步监督食品生产，预防不法商贩利用糖类添加剂的美味、廉价等优点，达到某种营养指标，对食品进行非法添加，所以需要对常用糖及糖醇进行检测。为了缩短检测周期，提高工作效率，需要建立一种食品中多种糖及糖醇的同时检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高速、准确、有效的同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的高效液相色谱分析方法，以大大减轻逐个检测的工作量，提高检测效率，保证产品的质量。

本发明选择Waters Xbridge Amide 柱作为HPLC色谱柱，Amide 柱是酰胺键合柱，相对于氨基键合柱的稳定性更高，柱流失减少，与示差折光检测器（RID）结合噪音较小，系统易平衡，且Amide 柱pH耐受性极佳，耐高温，随着柱温的升高，糖及糖类分析分离度明显增强，在70℃以上单糖分析效果最强，最高耐受温度为90℃，柱效下降慢，且柱子使用寿命更长。

本发明选择丙酮、水和三乙胺为流动相，系统为正相系统，结合Waters XbridgeAmide 柱，耐酸碱性极佳，耐高温，机器噪音小，系统易平衡，且对糖及糖类分离度高，灵敏度高，分析效果好，随着检测样品数量的增加，柱效下降慢；当大量检测后为了防止柱效下降，主要流动相丙酮、水比例不需改变，仅仅调整三乙胺的加入量即可保持柱效，且三乙胺加入量很小，对色谱柱填充物不会造成影响，色谱柱寿命长。

本发明采用的具体技术方案如下：

一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法，所述方法为HPLC-示差折光检测法，其特征在于所述HPLC的色谱条件为：色谱柱采用酰胺键合柱，流动相为丙酮、水和三乙胺的单流动相，等度洗脱；柱温为70℃，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。

上述酰胺键合柱具体型号为Waters Xbridge Amide。

上述流动相的组成为：丙酮：水=77:23（V/V），每1000mL流动相加入0.115-0.345mL三乙胺；当目标物分离度下降时，在上述范围内适当增加三乙胺的量。

本发明具体的检测步骤如下：

（1）糖单标溶液的配制：分别准确称取山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖配制成标准储备液，待用；

（2）标准工作溶液的配制：分别取上述浓度的标准储备液，配制成标准工作溶液；

（3）样品的制备：取样品5.00-20.00g，加水溶解，再加入沉淀剂混合摇匀，最后加入水定容至50mL，混匀后，离心机离心6 000 r/min，4℃条件下离心 5min，取上清液，用0.22μm针头滤膜过滤，滤液供检测；

（4）样品检测：选择液相外标法定量，按照一定浓度配制标准工作溶液，用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号做工作曲线，根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量，利用公式1进行计算：

（1）

式中：

X —试样中待测组分的含量（mg/g），

C —从标准曲线计算得到待测组分的浓度（mg/mL），

V1—试样溶液定容的体积（mL），

m—称取样品的质量（g）。

上述步骤（3）中所述的沉淀剂为亚铁氰化钾-乙酸锌、0.5%乙酸、氢氧化钠-硫酸铜溶液中的一种或多种。

所述的亚铁氰化钾-乙酸锌溶液的浓度分别为乙酸锌22wt%，亚铁氰化钾10.6wt%。

本发明检测方法可适用于牛奶、糕点、糖果、奶粉等含乳制品。检测结果表明：本发明检测样品分析谱图基线平稳，保留时间稳定，目标物与干扰物可以完全分离，由于以上基质涵盖了绝大多数检测样品基质的高糖分，高粘度，高干扰等特点，大量进样后，机器性能及谱图仍然稳定，且分离度好，没有较大波动，以上表明此方法对样品检测的适用性好，且抗干扰能力强。

本发明的有益效果：建立了多种糖及糖醇山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖同时检测的液相色谱方法，样品前处理简单，方法快捷，灵敏度高，回收率高，方法的线性范围宽，相关系数好，检出限低，适用性良好，填补了国内以上糖及糖醇同时检测的空白，大大提高了工作效率。

附图说明

图1七种糖及糖醇高效液相色谱图。

图2牛奶样品的高效液相色谱图。

图3糕点样品的高效液相色谱图。

图4糖果样品的高效液相色谱图。

图5奶粉样品的高效液相色谱图。

图6采用全新氨基柱检测的糖类高效液相色谱图。

图7采用氨基柱检测100次后糖类的高效液相色谱图。

图8采用氨基柱检测300次后糖类的高效液相色谱图。

图9采用酰胺柱和乙腈-水检测糖类的高效液相色谱图。

图10采用酰胺柱和丙酮-水检测糖类的高效液相色谱图。

图11采用酰胺柱检测500次后糖类的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，并通过对比例来进一步详细说明本发明。

本发明涉及的仪器与设备：1100 HPLC（美国Agilent公司）配示差折光检测器；Waters Xbridge Amide（3.5μm，4.6*250mm，美国Waters公司）；PL602-S天平（Mettler-Toledo公司）；CR22GⅢ 离心机（日本HITACHI）；移液枪（10-100µL，20-200µL，100-1000µL，5000µL，Eppendorf公司）；0.22µm滤膜（德国Membrana公司）。

本发明HPLC的流动相为丙酮、水和三乙胺的单流动相（丙酮：水=77:23（V/V），每1000mL流动相加入0.230mL三乙胺），等度洗脱；柱温为70℃，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。

本发明涉及的试剂与材料：麦芽糖醇、木糖醇、山梨糖醇、蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖，纯度均>99%；丙酮（色谱纯）；三乙胺（优级纯）。

实施例1：牛奶样品中七种糖及糖醇的检测

（1）七种糖单标溶液的配制：分别准确称取山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖配制成标准储备液，其中乳糖的标准储备液浓度均为100 mg·mL^-1，木糖醇、果糖、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖的标准储备液浓度均为150 mg·mL^-1，麦芽糖醇的标准储备液浓度为200 mg·mL^-1，待用；标准系列浓度见表1。

表1 七种糖标准储备液浓度及标准系列溶液浓度

（2）标准工作溶液的配制：木糖醇标准工作溶液60 mg·mL^-1：取150 mg·mL^-1木糖醇标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度；果糖标准工作溶液60 mg·mL^-1：取150 mg·mL^-1果糖标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度；山梨糖醇标准工作溶液60 mg·mL^-1：取150 mg·mL^-1山梨糖醇标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度；葡萄糖标准工作溶液60 mg·mL^-1：取150 mg·mL^-1葡萄糖标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度；蔗糖标准工作溶液60 mg·mL^-1：取150 mg·mL^-1蔗糖标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度；麦芽糖标准工作溶液50 mg·mL^-1：取200mg·mL^-1麦芽糖标准储备液2.50mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度；乳糖标准工作溶液50mg·mL^-1：取100 mg·mL^-1乳糖标准储备液5.00mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度。

如下表2所示，七种糖及糖醇的标准曲线线性均在0.98以上，线性较好，线性范围为0.40-60 mg/mL ，最低定量限为0.27-0.50 mg/mL ，线性范围比较大，且灵敏度较高。

表2 七种糖及糖醇曲线方程、相关系数、线性范围及检出限表

名称	曲线方程	相关系数	线性范围/(mg·mL^-1)	检出限/(mg·mL^-1)
					木糖醇	y=43931.3954*Amt+2333.0999	0.9997	0.50-20	0.34
果糖	y=90992.2377*Amt-25104.5176	0.9896	1.00-50	0.50
					山梨糖醇	y=95026.3683*Amt-13944.083	0.9855	0.40-20	0.27
葡萄糖	y=96751.3872*Amt-26577.662	0.9888	1.00-40	0.43
					蔗糖	y=96225.0497*Amt-28558.309	0.9878	1.00-50	0.21
麦芽糖醇	y=100888.370*Amt-16364.615	0.9907	0.60-60	0.28
					乳糖	y=98278.6544*Amt-6355.2131	0.9918	0.75-50	0.49

（3）以牛奶为检测基质，样品的制备：充分混匀样品，取样品10.00-20.00g，加水混合，加入2.5mL乙酸锌22wt%，2.5mL亚铁氰化钾10.6wt%,混匀，再加入水定容至50mL，混匀后，离心机离心6000 r/min，4℃条件下离心 5min，取上清液，用0.22μm针头滤膜过滤，滤液供检测；

（4）选择液相外标法定量，按照一定浓度配制标准工作溶液，用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号做工作曲线，根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量，利用公式1进行计算：

（1）

式中：

X —试样中待测组分的含量（mg/g），

C —从标准曲线计算得到待测组分的浓度（mg/mL），

V1—试样溶液定容的体积（mL），

m—称取样品的质量（g）。

牛奶样品中七种糖醇的3种不同浓度的检测结果及回收率结果见表3。由步骤（3）可以看出，此方法前处理简单，去除了影响回收和提取的步骤，简便快速。由图2可以看出，目标物被完全分离，液相方法的分离效果好，分离度高。由表3可知7种糖及糖醇回收率均在79%-106%间，回收率较好。综上所述，此发明方法对牛奶的前处理简便快速，液相方法对其中的7种糖及糖醇分离度高，此方法对牛奶的适用性好。

实施例2：糕点样品中七种糖及糖醇的检测

步骤（1）和（2）与实施例1相同；

（3）样品的制备：充分混匀样品，取样品约5.00g，加水溶解混合，加入2.5mL乙酸锌22wt%，2.5mL亚铁氰化钾10.6wt%,混匀，定容至50mL，混匀后，离心机离心6000 r/min，4℃条件下离心 5min，取上清液，用0.22μm针头滤膜过滤，滤液供检测；

选择液相外标法定量，按照一定浓度配制标准工作溶液，用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号作工作曲线，根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量，利用公式1进行计算：

（1）

式中：

X —试样中待测组分的含量（mg/g），

C —从标准曲线计算得到待测组分的浓度（mg/mL），

V1—试样溶液定容的体积（mL），

m—称取样品的质量（g）。

七种糖醇的3种不同浓度回收率结果见表3。

由表3可知糕点中7种糖醇回收率均在77%-108%之间，回收率较好。

综上所述，此方法前处理简单，只要简单的稀释定容，即可满足检测的需要，最大限度的去除了影响回收的步骤。由图3可以看出，目标物被完全分离，有效的避开了干扰，液相方法的分离效果好，分离度高。由表3可知7种糖及糖醇回收率均在77%-108%之间，回收率较好。此发明方法对糕点的前处理简便快速，液相方法对其中的7种糖及糖醇分离度高，此方法对糕点的适用性好。

实施例3:糖果样品中七种糖及糖醇的检测

步骤（1）和（2）与实施例1相同；

（1）

式中：

X —试样中待测组分的含量（mg/g），

C —从标准曲线计算得到待测组分的浓度（mg/mL），

V1—试样溶液定容的体积（mL），

m—称取样品的质量（g）。

糖果中七种糖醇的3种不同浓度回收率结果见表3。由表3可知糖果中7种糖醇回收率均在79%-104%之间，回收率较好。此发明方法对糖果的前处理简便快速，液相方法对其中的7种糖及糖醇分离度高，此方法对糖果的适用性好。

实施例4:奶粉样品中七种糖及糖醇的检测

步骤（1）和（2）与实施例1相同；

（1）

式中：

X —试样中待测组分的含量（mg/g），

C —从标准曲线计算得到待测组分的浓度（mg/mL），

V1—试样溶液定容的体积（mL），

m—称取样品的质量（g）。

因为奶粉，特别是婴幼儿配方奶粉，其成分比较复杂，干扰物多，目标物分离难度大，由图5可以看出，目标物被完全分离，有效的避开了干扰，此方法的分离效果好，分离度高。奶粉中七种糖醇的3种不同浓度回收率结果见表3。由表3可知奶粉中7种糖醇回收率均在74%-110%之间，回收率较好。此发明方法对奶粉的前处理简便快速，液相方法对其中的7种糖及糖醇分离度高，此方法对奶粉的适用性好。

表3 不同基质中7种糖及糖醇回收率表

综上所述，此发明方法对牛奶、糕点、糖果、奶粉前处理简单，只要加入沉淀剂，离心，上清液过滤膜，即可满足检测的需要，最大限度的去除了影响回收的步骤。由图2-5可以看出，目标物被完全分离，液相方法的分离效果好，分离度高，回收率在74%-110%之间，回收效果好。本发明对牛奶、糕点、糖果、奶粉的适用性好。

对比例1：采用氨基色谱柱及不同流动相进行比较

步骤（1）、（2）和（3）与实施例1相同；

（4）采用新启用的氨基色谱柱对果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖进行分析，应用乙腈-水（v/v=90:10）为流动相，流速1.0mL/min, 柱温30℃，进样量10μL。结果如图6所示。图7和图8分别为100次和300次糖类检测后的色谱图。由图6-8可以看出，新启用的氨基柱，糖类分析分离度较好，目标糖类可以完全分离；随着检测样品数的增多，氨基柱柱效下降很快，当糖类检测100次左右后，果糖与葡萄糖不能完全分离，且乳糖出现肩峰，或是拖尾；当继续增加检测次数，300次左右糖类检测后，柱子填料有塌陷，如图8，综上可以看出，氨基柱柱效下降很快，分离效果不理想。

（5）采用用酰胺柱对果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖进行分析，应用乙腈水为流动相乙腈水（v/v=90:10）为流动相，流速1.0mL/min, 柱温70℃，进样量10μL，检测结果如图9。

（6）采用Waters Xbridge Amide酰胺柱对果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖进行分析，丙酮、水和三乙胺的单流动相（丙酮：水=77:23（V/V），每1000mL流动相加入0.230mL三乙胺），等度洗脱；柱温为70℃，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。新柱和500次检测后的结果如图10 和图11所示。

由图9-11可以看出酰胺柱-乙腈水流动相体系虽然分离度高，但是出峰时间长，对于大批量进样浪费了时间和流动相。酰胺柱-丙酮水流动相体系，对果糖、葡萄糖分离度高，检测时间短，且流动相对柱子填料影响小，多次进样峰形仍然很好，没有出现肩峰及峰明显变宽现象，柱效下降慢。

综上所述：采用的酰胺柱-丙酮水流动相体系对大批量糖醇检测效果好，节约时间和试剂，提高了检测效率。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不以此限制本发明的保护范围。本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims

1.一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法，所述方法为HPLC-示差折光检测法，其特征在于所述HPLC的色谱条件为：色谱柱采用Waters Xbridge Amide酰胺键合柱，流动相为丙酮、水和三乙胺的单流动相，所述流动相的体积比组成为：丙酮：水= 77:23，每1000ml流动相加入0.115-0.345ml三乙胺，等度洗脱；柱温：70℃；流速：0.8ml/min；进样量：10μL，具体的检测步骤如下：

（3）样品的制备：取样品5.00-20.00g，先加入适量水溶解，再加入沉淀剂混合摇匀，最后加水定容至50ml，混匀后，离心机离心6000r/min，4℃条件下离心 5min，取上清液，用0.22μm针头滤膜过滤，滤液供检测；所述的沉淀剂为亚铁氰化钾-乙酸锌、0.5%乙酸、氢氧化钠-硫酸铜溶液中的一种或多种；

（4）样品检测：选择液相外标法定量，按照一定浓度配制标准工作溶液，用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号做工作曲线，根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量，利用下列公式进行计算：

式中：

X —试样中待测组分的含量，单位为mg/g，

C —从标准曲线计算得到待测组分的浓度，单位为mg/mL，

V1—试样溶液定容的体积，单位为mL，

m—称取样品的质量，单位为g。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳制品为牛奶、糕点、糖果、奶粉中的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的亚铁氰化钾-乙酸锌溶液的浓度分别为乙酸锌22wt%，亚铁氰化钾10.6wt%。