CN108872452A - 白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法，所述的二氢查耳酮类物质为新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮,检测方法包括如下步骤：(1)制备混合标准储备液和混合标准工作液；(2)制备待测样品溶液；(3)高效液相色谱分析条件；(4)建立标准工作曲线；(5)结果分析。本方法建立了白酒中新橙皮苷二氢查耳酮（NHDC）和柚皮苷二氢查耳酮（Naringin DC）的高效液相色谱同时分离检测方法。本发明填适用于白酒中二氢查耳酮类物质含量的日常检测。

Description

白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法

技术领域

本发明涉及白酒中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的高效液相色谱同时分离检测方法。

背景技术

白酒在我国有着悠久的历史，在白酒的制作过程当中会产生高级醇、多元醇、氨基酸等物质使其有着醇甜、绵柔的口感。尽管我国国家标准中已经明确规定固液和液态法的白酒中可用香醅串香或者采用食品添加剂进行调味调香，固态法白酒中不能添加非白酒发酵产生的呈香呈味物质，但部分商家依然通过违规添加甜味物质来达到醇甜的口感。

新橙皮苷二氢查耳酮（NHDC）是从天然柑、橘等植物中提取得到的，因其能够起到增加甜味的作用，在生产过程中经常被用作甜味剂来使用。研究发现NHDC对百草枯诱导的急性肝损伤具有明显的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，还具有降低血脂和血糖、促进心血管收缩、抑制胃酸分泌等作用。NHDC作为甜味物质已被多个国家批准使用，其中欧盟食品添加剂法规中规定NHDC在啤酒中的添加量不得超过10 mg/L。柚皮苷二氢查耳酮也是属于二氢查耳酮类衍生物，具有甜度高、热值低、可安全使用、无毒性等优点，可应用在食品和医药工业。

目前并没有同时检测白酒中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的报道，因此本发明建立一种同时检测白酒中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的高效液相色谱法。

发明内容

该方法是一种能够实现白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法，所述的二氢查耳酮类物质为新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮，所述的检测方法包括：

本发明的白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法，其包括如下步骤：

（1）制备混合标准储备液和混合标准工作液，所述混合标准储备液均为1000 mg/L的混标储备液，混合标准工作液为将二氢查耳酮的标准储备液采用逐级稀释法用甲醇溶液配制浓度为0.1 mg/L,0.5 mg/L，1.0 mg/L，5.0 mg/L，10.0 mg/L，20.0 mg/L的系列标准工作溶液；

（2）制备待测样品溶液：称取白酒样品10 g（准确至0.0001 g）于25 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇，置于超声波振荡器中超声萃取30分钟后，用甲醇定容至刻度线，涡旋混匀。准确移取10 mL至鸡心瓶进行旋转蒸发，蒸至近干，再用2 mL甲醇进行复溶，涡旋，过0.22 μm滤膜后，滤液供分析用。

（3）所用仪器为高效液相色谱仪，检测器为光电二极管阵列检测器。色谱柱为反相C18柱，柱温为35±1 ℃，检测波长282nm。流动相A为甲醇，流动相B为纯水；梯度洗脱程序：0~10 min，47% A；10~10.5 min，47% A~20% A；10.5~15 min，保持20% A；15~15.5 min，20% A~47% A；15.5~20 min，保持47% A。流速1.0 mL / min；进样量10 μL。

（4）标准曲线的绘制：将二氢查耳酮类物质类甜味剂的系列混合标准工作溶液注入高效液相色谱仪中，在步骤（3）的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线。

（5）结果分析：取（2）中滤液注入高效液相色谱仪中，在步骤（3）的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据（4）中制作的标准曲线定量，计算出待测样品中各新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的含量。

本发明用于弥补和解决目前尚无白酒中二氢查耳酮类物质类甜味剂含量检测方法的不足，使得该方法能够针对白酒中二氢查耳酮类物质类甜味剂进行低含量准确分析。与现有技术相比较，本发明具有以下突出优点：

1.本发明填补了白酒中二氢查耳酮类物质含量检测领域空白，考虑到新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮最大吸收波长几乎相同，选择C18柱为固定相，不断优化流动相组成和比例，研究得出适合本发明新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮含量分离的色谱条件，使得各目标物能够完全分离，同时获得最佳峰型和灵敏度。

2.本发明采用了一系列的操作以保证该检测方法具有极高的检测灵敏度满足白 酒企业在白酒中的新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮添加要求，包括采取较大的白酒样品称样克数和较小的定容体积；同时采取了浓缩的办法，将检测灵敏度提高10倍，此外还采取优化进样体积的方法来减少甲醇试剂溶剂效应的影响。

3.本发明具有极高的检测灵敏度，定量限低至0.030mg/kg以下，远低于欧盟相关法规对二氢查尔酮类甜味剂的最高限量要求（10 mg/kg），同时抗干扰能力强，完全能够满足饲料中二氢查耳酮类甜味剂的日常监测和监管需要。

4.本发明所使用的分析仪器为高效液相色谱仪配备光电二极管阵列检测器，相对于液质联用仪等造价高昂的仪器，更加易于方法普及和推广应用。同时又能克服毛细管电泳法、电化学传感器稳定性、重现性较差等缺点。

附图说明

图1为本发明的白酒中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮含量的同时分离检测方法的混合标准溶液高效液相色谱分离图。

具体实施方式

以下结合具体实施例肯说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细实施方式和具体的操作过程，来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例1

1 试剂和材料

除特别说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

1.1 甲醇：色谱纯。

1.2 标准品：新橙皮苷二氢查耳酮（NHDC，纯度≥98.0%, 中国上海麦克林公司）；柚皮苷二氢查耳酮（Naringin DC，纯度≥98.0%, 美国阿拉丁公司）。。

1.3标准储备液的配制：准确称取新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮标准品各0.1g左右，用甲醇溶液溶解并定容至100 mL，配制得浓度均为1000 mg/L的标准储备液。0 ℃ ~ 4 ℃保存，可使用3个月。

1.5 标准工作溶液的配制：将新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的标准储备液采用逐级稀释法用甲醇溶液配制浓度为0.1 mg/L,0.5 mg/L，1.0 mg/L，5.0 mg/L，10.0 mg/L，20.0 mg/L的系列标准工作溶液。所有标准工作溶液置于冰箱中于0 ℃ ~ 4 ℃温度下保存，可使用1个月。

2 仪器和设备

2.1高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器。

2.2分析天平：感量0.0001 g和感量0.01 g。

2.3超声波发生器：功率大于180 W。

2.4旋转蒸发仪。

2.5 尼龙66有机滤膜：0.45 μm。

3 方法

3.1 高效液相色谱条件

a) 色谱柱：C18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm；

b）流动相：（A）甲醇和（B）水；检测波长：282 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL；梯度洗脱程序：0~10 min，47% A；10~10.5 min，47% A~20% A；10.5~15 min，保持20%A；15~15.5 min，20% A~47% A；15.5~20 min，保持47% A。

c）流速：1.0 mL/min；

d）柱温：35 ℃；

e) 进样量：10 μL；

f）光电二极管阵列检测器的检测条件：检测波长282nm

3.2 标准曲线绘制

分别取混合标准工作溶液（1.5），按照3.1的色谱条件进行色谱测定。以各分析物的峰面积（Y）对相应的质量浓度（X，mg /L）进行线性回归绘制标准曲线，得到线性回归方程。

4 样品测试步骤

4.1样品前处理

称取白酒样品10 g（准确至0.0001 g）于25 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇，置于超声波振荡器中超声萃取30分钟后，用甲醇定容至刻度线，涡旋混匀。准确移取10 mL至鸡心瓶进行旋转蒸发，蒸至近干，再用2 mL甲醇进行复溶，涡旋，过0.22 μm滤膜后，进行HPLC分析。

4.2 试液测定

在相同色谱条件下，将制备的试样溶液进行色谱测定，以保留时间定性，以外标法定量。

5 分析结果的表述

试样中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的含量按下式（1）计算：

X＝ （1）

式中：

X——试样中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

C _i ——试液的进样浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；

m——试样质量，单位为克（g）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

6方法学考察，其中包括线性、检测限、定量限、回收率、精密度。

6.1线性、检测限、定量限：配制各浓度分别为0.1 mg/L,0.5 mg/L，1.0mg/L，5.0mg/L，10.0 mg/L，20.0 mg/L的新橙皮苷二氢查耳酮以及柚皮苷二氢查耳酮系列标准溶液，根据相应的峰面积（Y）和对应的检测浓度（X）制作标准曲线（见表1），结果表明，新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮在0.1 mg/L到20 mg/L内具有很好的线性关系，相关系数为r=0.9999，以3倍信噪比（S/N=3）时的质量浓度作为检出限，10倍信噪比（S/N=10）时的质量浓度作为定量限，柚皮苷二氢查耳酮的检出限为0.0075 mg/kg，定量限为0.0249 mg/kg，新橙皮苷二氢查耳酮的检出限为0.0085 mg/kg，定量限为0.0291 mg/kg。

表1 二氢查耳酮类物质的回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限

y: 峰面积; x:质量浓度, mg/L.

6.2回收率和精密度：在优化后的测试条件下，取白酒空白基质进行加标回收测试，新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮加标水平分别为0.5 mg/kg，1.0 mg/kg，2.0 mg/kg,每个水平重复分析3次，根据峰面积计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。从表2可知，各个样品测定结果的重现性较好，加标回收率为93.4%~96.0%，相对标准偏差RSDs为0.7%~1.8%，表明该色谱分析方法适用于白酒中新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮的分析检测。

表2 新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮加标回收率实验结果

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照校佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法，其特征在于, 所述的二氢查耳酮类物质为新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮；所述的检测方法包括：

（1）制备混合标准储备液和混合标准工作液，所述混合标准储备液均为1000 mg/L的混标储备液，混合标准工作液为将二氢查耳酮的标准储备液采用逐级稀释法用甲醇溶液配制浓度为0.1 ~ 20.0 mg/L的系列标准工作溶液；

（2）制备待测样品溶液：称取白酒样品10 g于25 mL容量瓶中，加入甲醇，置于超声波振荡器中超声萃取30分钟后，用甲醇定容至刻度线，涡旋混匀。准确移取10 mL至鸡心瓶进行旋转蒸发，蒸至近干，再用2 mL甲醇进行复溶，涡旋，过膜后，滤液供分析用;

（3）所用仪器为高效液相色谱仪，检测器为光电二极管阵列检测器。色谱柱为反相C18柱，柱温为35±1 ℃，检测波长282nm。流动相A为甲醇，流动相B为纯水；梯度洗脱程序：0~10min，47% A；10~10.5 min，47% A~20% A；10.5~15 min，保持20% A；15~15.5 min，20% A~47%A；15.5~20 min，保持47% A;流速1.0 mL / min；进样量10 μL;

（4）标准曲线的绘制：将二氢查耳酮类物质类甜味剂的系列混合标准工作溶液注入高效液相色谱仪中，在步骤（3）的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线;

（5）结果分析：取（2）中滤液注入高效液相色谱仪中，在步骤（3）的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据（4）中制作的标准曲线定量，计算出待测样品中各新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的含量。

2.根据权利要求1所述白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法，其特征在于，（1）中所述混合标准储备液的配制具体步骤为：准确称取新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮标准品各0.1000g，用甲醇溶液溶解并定容至100 mL，配制得浓度均为1000 mg/L的标准储备液；（1）中所述混合标准工作溶液的配制具体步骤为：将新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的标准储备液采用逐级稀释法用甲醇溶液配制浓度为0.1 mg/L,0.5mg/L，1.0 mg/L，5.0 mg/L，10.0 mg/L，20.0 mg/L的系列标准工作溶液。所有标准储备液和标准工作溶液置于冰箱中于0 ℃ ~ 4 ℃温度下保存。

3.根据权利要求1白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法，其特征在于，（2）中所述待测样品溶液的制备具体步骤为：称取白酒样品10 g（准确至0.0001 g）于25 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇，置于超声波振荡器中超声萃取30分钟后，用甲醇定容至刻度线，涡旋混匀。准确移取10 mL至鸡心瓶进行旋转蒸发，蒸至近干，再用2 mL甲醇进行复溶，涡旋，过0.22 μm滤膜后，滤液供分析用。

4.根据权利要求1白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法，其特征在于，（3）中所述反相C18色谱柱规格为250 mm×4.6 mm内径，颗粒粒径5 μm。

5.根据权利要求1白酒中二氢查耳酮类物质含量的同时分离检测方法，其特征在于，（4）中所述标准曲线系数不小于0.999。