CN101581707B - 一种同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，包括以下步骤：1)预处理：将待检食醋与提取溶剂进行混合，然后进行超声提取；2)将上述预处理后食醋混合液按以下色谱条件进行检测：柱温45℃，进样量2μL，检测波长为285～300nm，流动相为甲醇∶含酸水溶液＝55∶45的体积比，等度洗脱；流速0.8ml/min；3)乙偶姻和川芎嗪的出峰时间分别为1.278～1.299min和1.982～2.039min；根据色谱图，分别确定待检食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪。该方法具有操作简便快速、重复性好、精密度高和检测成本低等特点。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术和现代仪器分析技术领域，特别涉及一种快速同时提取和定量检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法。
背景技术
乙偶姻是众多微生物的代谢产物，是在醋的酿制过程中由α-乙酰乳酸脱羧酶转化双乙酰产生，是食醋的重要风味物质，其含量是控制食醋质量的一个重要指标。川芎嗪(四甲基吡嗪)，是食品中重要的风味物质，也是一种常用的食品添加剂，广泛存在于各种食品中。同时，川芎嗪作为抗心血管疾病药物已在我国临床应用超过30年，被公认为安全无副作用。川芎嗪是一种从草药川芎中提取的生物碱，具有抗血小板聚集作用，并有扩张血管、增加冠脉血流量、改善微循环及增加脑血流量等作用。
近年来，在发酵制品，如食醋、白酒中，有检测到川芎嗪的报道，有的含量接近甚至超过了中草药川芎中的含量，大多数研究认为是美拉德反应的产物。也有报道证明两分子的乙偶姻与氨反应可以生成川芎嗪。在食品中川芎嗪的形成与乙偶姻密切相关。乙偶姻的检测一般采用气相色谱法。川芎嗪的检测方法有气相和液相色谱法，主要集中在医药领域，食品尤其是发酵制品中报道甚少，且检测的偏差很大。乙偶姻和川芎嗪两种物质的同时检测未见文献报道。
快速检测乙偶姻和川芎嗪对药品的监管、发酵产品的品质检测、川芎嗪形成机理的研究及富含川芎嗪保健品的研发等诸多方面具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪浓度的方法，该方法具有操作简便快速、重复性好、精密度高和检测成本低等特点。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪浓度的方法，包括以下步骤：
1)、预处理：
将待检食醋与提取溶剂进行混合，然后进行超声提取，得预处理后食醋混合液；
2)、将上述预处理后食醋混合液按以下色谱条件进行检测：
带有可变波长的紫外测器的高效快速液相色谱仪，耐酸的高通量快速C18反相柱(100×4.6mm，1.8μm)，柱温45℃，进样量2μL，检测波长为285～300nm(优选290nm)，流动相为甲醇∶含酸水溶液＝55∶45的体积比，所述含酸水溶液中含1％(体积比)冰醋酸和0.05％(体积比)三氟乙酸、其余为水，pH 2.5；等度洗脱；流速0.8ml/min；
3)、确定待检食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪：
乙偶姻和川芎嗪的出峰时间分别为1.278～1.299min和1.982～2.039min；根据色谱图，分别确定待检食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪。
作为本发明的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的改进：所述色谱图中，根据乙偶姻的线性回归方程A1＝26.5006C1-0.7685，获得待检食醋中乙偶姻的浓度C1；根据川芎嗪的线性回归方程A2＝5.8835C2-1.1001，获得待检食醋中川芎嗪的浓度C2；所述A1和A2分别代表乙偶姻和川芎嗪的峰面积。
作为本发明的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的进一步改进：步骤1)中提取溶剂与食醋的体积比为5～8∶1，优选6∶1；提取溶剂为酸性的醇水溶液。
作为本发明的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的进一步改进：酸性的醇水溶液为水、无机酸和醇的混合物，所述醇占酸性的醇水溶液总体积的75～85％，优选80％。
作为本发明的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的进一步改进：无机酸为冰醋酸、盐酸或磷酸，所述醇为甲醇或乙醇。
作为本发明的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的进一步改进：无机酸选用冰醋酸时，冰醋酸占酸性的醇水溶液总体积的4～6％，优选5％。
作为本发明的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的进一步改进：无机酸选用盐酸或磷酸时，盐酸或磷酸在酸性的醇水溶液中的浓度为0.15～0.45mol/L，盐酸的优选浓度为0.2mol/L，磷酸的优选浓度为0.4mol/L。
作为本发明的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的进一步改进：步骤1)中超声提取时间为30～60min，优选45min。
本发明的步骤1)中，所用超声波的频率一般为40KHz，功率可为100W。
本发明的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪浓度的方法，步骤1)中，在食醋中加入一定比例的提取溶剂(即酸性的醇水溶液)是为了提取食醋中的乙偶姻和川芎嗪；在酸性环境下，经过超声预处理，将食醋中的川芎嗪酸化处理，增加其溶解性，使之更利于提取。本发明采用特定的分离条件，实现了食醋中乙偶姻和川芎嗪精确分离以及同时快速检测其含量，利用步骤(1)～步骤(2)的方法进行测定乙偶姻和川芎嗪含量时，利用外标法所得标准曲线，峰面积与乙偶姻和川芎嗪浓度间的相关系数R2均大于0.9999；对同一样品进行多次测定得到方法的精密度RSD＜2％；利用标准物质加入法测定方法的回收率在92.1％-100.3％；由此可见本发明方法具有很高的精确度。
本发明采用溶剂体系辅助超声提取对食醋样品进行预处理，并对川芎嗪进行酸化处理，以实现高效同时提取食醋中的乙偶姻和川芎嗪。处理后的样品可以用于定量分析。利用耐酸的高通量快速C18反相柱，在指定的HPLC条件下测定快速测定乙偶姻和川芎嗪含量，在3～5min内完成色谱检测。
本发明方法操作简便快速，样品前处理简单、科学有效，目前尚未见到同时检测乙偶姻和川芎嗪的报道；本方法与LC/MS和GC/MS分析方法相比需要的仪器设备简单，检测成本更低，对操作人员要求不高。
本发明方法不仅可以用于食醋的检测，还适用于乳制品、饮料等其它食品尤其是发酵制品的日常检测和监控，天然制品、中草约检测以及药品监管等领域。
本发明的发明过程具体如下：
1、分析方法的建立：
采用的高效液相色谱仪及检测器：安捷伦高效快速液相色谱1200系列；紫外可变波长检测器(美国安捷伦科技公司)。
色谱条件：SB-C18快速高通量反相柱(100×4.6mm，1.8μm)，检测温度(柱温)45℃，进样量2μL，检测波长为290nm，流动相为甲醇∶含酸水溶液(含1％醋酸，0.05％三氟乙酸，其余为水，pH 2.5；以上百分比为体积百分比；)＝55∶45，等度洗脱。
采用的相关试剂如下：乙偶姻、川芎嗪对照品购于中国生物制品药品检定所，甲醇(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司)，双蒸水，三氟乙酸、冰醋酸、盐酸(均为分析纯)。
试剂配制与样品前处理：1)准确称取乙偶姻、川芎嗪标准品，用流动相(同上)溶解，分别制成20mg/mL，80μg/mL的标准储备液，冰箱4℃保存。2)将乙偶姻储备液分别稀释2，4，5，10，20，30，40倍，得到不同浓度的乙偶姻标准供试液。川芎嗪储备液分别稀释2，4，5，10，20，30，40倍，得到川芎嗪标准供试液。3)在烧杯中加入800mL高纯水，加入10mL冰醋酸，0.5mL三氟乙酸，调pH到2.5，定容到1000mL；作为流动相水溶液(即含酸水溶液)。4)在50mL具塞三角瓶中加入5mL样品，同时加入提取溶剂25mL，超声提取45min(100W，40KHz)后；取2mL置于离心管中，8000g，离心5min，取上清液过滤备用；所述提取溶剂为水∶冰醋酸∶乙醇＝15∶5∶80(体积比)。
HPLC测定：所用流动相、标样和样品均用0.2μm微孔膜过滤供液相分析使用，将处理好的标准样品和食醋样品用指定色谱条件进行检测。乙偶姻和川芎嗪标样的高效液相色谱图如图3所示，食醋样品的高效液相色谱图如图4所示。
2、标准工作曲线
对不同浓度的标准品进样检测，记录对应的峰面积值Area(A)，以考察其检测浓度相关性，具体如表1所示：
表1、乙偶姻和川芎嗪检测浓度与峰面积线性关系考察
| 编号 | 乙偶姻(mg/mL) | 峰面积 | 川芎嗪(μg/mL) | 峰面积 |
| 1 | 20 | 528.81 | 80 | 469.74 |
| 2 | 10 | 265.92 | 40 | 234.83 |
| 3 | 5 | 130.85 | 20 | 115.51 |
| 4 | 4 | 105.22 | 16 | 93.02 |
| 5 | 2 | 50.50 | 8 | 44.11 |
| 6 | 1 | 25.41 | 4 | 22.10 |
| 7 | 0.05 | 1.15 | 0.2 | 1.12 |
分别以乙偶姻和川芎嗪浓度对面积A作线性回归，得到乙偶姻的线性回归方程为A1＝26.5006C1-0.7685(R2＝0.99996)，如图1所示；川芎嗪的线性回归方程为A2＝5.8835C2-1.1001(R2＝0.99996)，如图2所示。由线性相关系数可以看出，乙偶姻和川芎嗪浓度与峰面积之间均具有良好线性关系。
3、重复性和精密度考察
对一定浓度标准品按上述方法连续进行8次重复测定，对乙偶姻、川芎嗪检测浓度和峰面积精密度进行考察，数据如下表2所示：
表2方法精密度考察
对不同浓度标准品按本方法连续三天进行重复测定，对乙偶姻、川芎嗪检测浓度和峰面积精密度进行考察，数据如下表3所示：
表3方法重复性考察
从上表2和表3中可以看出相对标准偏差RSD均小于2％，精密度高，可以精确测定食醋中乙偶姻和川芎嗪。
4、准确性考察
向食醋样品中添加不同浓度的乙偶姻和川芎嗪标准物质，测定被加入标准物质和样品的回收量，计算回收率，结果见表4。
表4方法加标回收率考察
结果显示，方法的回收率在92.1％-100.3％之间，可以用于乙偶姻和川芎嗪的准确测定。
5、最低检测限、定量限和检测线性范围考察
将对照品溶液逐步稀释成不同浓度进行测试来找出检测限。观察其峰高比基线噪音高多少倍。S/N＝3时的浓度是检测限，也就是峰高约在基线噪音高的3倍，注入液相色谱仪的对照品浓度。S/N＝10是定量限，也就是峰高约在基线噪音高的10倍时，注入液相色谱仪的对照品量。
表5最低检测限和定量限考察
| 线性范围(mg/mL) | 检测限(μg/mL) | 定量限(μg/mL) | |
| 乙偶姻 | 0.02-20 | 5.625 | 18.750 |
| 川芎嗪 | 1.2×10-4-8.0×10-2 | 0.033 | 0.111 |
另外，食醋样品加标后图5中川芎嗪位置的峰未出现分离；将醋中的川芎嗪分离提取纯化进行GC-MS分析，结果如图6所示。这些结果进一步验证了本发明方法的正确性。
综上所述，本发明与现行方法相比：乙偶姻和川芎嗪检测限更低分别为5.625μg/mL，0.033μg/mL，而且具有较低的RSD。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为乙偶姻标准曲线图；
图2为川芎嗪标准曲线图；
图3为乙偶姻和川芎嗪对照品的高效液相色谱图；
图4为食醋样品的高效液相色谱图；
图5为加标后食醋样品的高效液相色谱图；
图6从食醋中纯化得到川芎嗪样品的GC-MS谱图；
图中a为总离子流色谱图，峰1为川芎嗪；
b为质量色谱图；
c为与标准质谱图库匹配、识别后鉴定结果。
具体实施方式
实施例1、一种同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，依次包括以下步骤：
1)、预处理：
采用溶剂体系辅助超声提取对待检食醋进行预处理，提取溶剂与食醋的体积比为6∶1，提取溶剂为水∶冰醋酸∶乙醇＝15∶5∶80(体积比)，提取时间45min；得预处理后食醋混合液。
2)、将上述预处理后食醋混合液按以下色谱条件进行检测：
按指定方法在安捷伦1200液相色谱仪进行检测，采用耐酸的C18高通量反相柱(100×4.6mm，1.8μm)，检测温度(柱温)45℃，进样量2μL，检测波长为290nm，流动相为甲醇∶含酸水溶液(含1％醋酸，0.05％三氟乙酸，其余为水，pH 2.5)＝55∶45(体积比)，等度洗脱，流速0.8ml/min。
3)、确定待检食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量：
乙偶姻和川芎嗪的出峰时间分别为1.278～1.299min和1.982～2.039min；根据色谱图，再根据乙偶姻的线性回归方程A1＝26.5006C1-0.7685，获得待检食醋中乙偶姻的浓度C1；根据川芎嗪的线性回归方程A2＝5.8835C2-1.10001，获得待检食醋中川芎嗪的浓度C2。
分别以浙醋、镇江香醋和陈醋、上海陈醋和米醋、山西老醋等作为样品1～20，所得结果如表6所示：
表6食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量
| 样品编号 | 乙偶姻含量(g/Kg) | 川芎嗪含量(mg/Kg) |
| 1 | 5.228±0.025 | 68.959±1.379 |
| 2 | 3.841±0.035 | 131.108±1.966 |
| 3 | 3.797±0.046 | 5.407±0.075 |
| 4 | 0.444±0.005 | 3.338±0.059 |
| 5 | 5.009±0.091 | 63.551±1.108 |
| 6 | 4.875±0.044 | 21.162±0.263 |
| 7 | 4.169±0.071 | 15.888±0.218 |
| 8 | 3.963±0.059 | 12.750±0.153 |
| 9 | 1.803±0.018 | 8.945±0.169 |
| 10 | 3.350±0.009 | 13.551±0.235 |
| 11 | 3.728±0.031 | 12.884±0.095 |
| 12 | 4.313±0.045 | 15.821±0.125 |
| 13 | 5.506±0.095 | 25.234±0.375 |
| 14 | 5.375±0.037 | 23.832±0.412 |
| 15 | 1.166±0.008 | 14.352±0.215 |
| 16 | 5.603±0.051 | 19.092±0.083 |
| 17 | 3.100±0.015 | 15.421±0.285 |
| 18 | 1.938±0.031 | 5.140±0.052 |
| 19 | 2.628±0.042 | 5.674±0.047 |
| 20 | 3.147±0.025 | 10.521±0.096 |
从表中可以看出，不同菌种、不同品牌和不同生产工艺的食醋样品中乙偶姻和川芎嗪的含量存在较大的差异。
实施例2、一种同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，依次包括以下步骤：
1)、预处理：
采用溶剂体系辅助超声提取对待检食醋进行预处理，提取溶剂与食醋的体积比为5∶1，提取溶剂为水∶冰醋酸∶乙醇＝20∶5∶75(体积比)，提取时间30min；得预处理后食醋混合液。
步骤2)和步骤3)同实施例1。
选用实施例1中的样品1～样品5，检测结果如下表7所示：
表7食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量
| 样品编号 | 乙偶姻含量(g/Kg) | 川芎嗪含量(mg/Kg) |
| 1 | 5.238 | 67.258 |
| 2 | 3.831 | 130.138 |
| 3 | 3.394 | 5.287 |
| 4 | 0.454 | 3.358 |
| 5 | 5.019 | 62.531 |
实施例3、一种同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，依次包括以下步骤：
1)、预处理：
采用溶剂体系辅助超声提取对待检食醋进行预处理，提取溶剂与食醋的体积比为7∶1，提取溶剂为水∶乙醇＝1∶4(体积比)含0.2mol/L的盐酸的溶液体系，提取时间30min；得预处理后食醋混合液。
步骤2)和步骤3)同实施例1。
选用实施例1中的样品1～样品5，检测结果如下表8所示：
表8食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量
| 样品编号 | 乙偶姻含量(g/Kg) | 川芎嗪含量(mg/Kg) |
| 1 | 5.337 | 68.255 |
| 2 | 3.852 | 130.135 |
| 3 | 3.496 | 5.186 |
| 4 | 0.423 | 3.367 |
| 5 | 5.119 | 62.334 |
实施例4、一种同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，依次包括以下步骤：
1)、预处理：
采用溶剂体系辅助超声提取对待检食醋进行预处理，提取溶剂与食醋的体积比为8∶1，提取溶剂为水∶甲醇＝1∶4(体积比)含0.4mol/L的磷酸的溶液体系，提取时间40min；得预处理后食醋混合液。
步骤2)同实施例1。
步骤3)中检测波长为297nm，其余同实施例1。
选用实施例1中的样品1～样品5，检测结果如下表9所示：
表9食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量
| 样品编号 | 乙偶姻含量(g/Kg) | 川芎嗪含量(mg/Kg) |
| 1 | 5.436 | 67.254 |
| 2 | 3.754 | 129.233 |
| 3 | 3.385 | 5.288 |
| 4 | 0.425 | 3.555 |
| 5 | 5.025 | 64.535 |
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、预处理：
将待检食醋与提取溶剂进行混合，然后进行超声提取，得预处理后食醋混合液；
所述提取溶剂为以下任意一种：
体积比为水∶冰醋酸∶乙醇＝15∶5∶80，
体积比为水∶冰醋酸∶乙醇＝20∶5∶75，
体积比为水∶乙醇＝1∶4的含0.2mol/L的盐酸的溶液体系，
体积比为水∶甲醇＝1∶4的含0.4mol/L的磷酸的溶液体系；
2)、将上述预处理后食醋混合液按以下色谱条件进行检测：
带有可变波长的紫外测器的高效快速液相色谱仪，耐酸的高通量快速C18反相柱，柱温45℃，进样量2μL，检测波长为285～300nm，流动相为甲醇∶含酸水溶液＝55∶45的体积比，所述含酸水溶液中含1％冰醋酸和0.05％三氟乙酸、其余为水，pH 2.5；等度洗脱；流速0.8ml/min；
3)、确定待检食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪：
乙偶姻和川芎嗪的出峰时间分别为1.278～1.299min和1.982～2.039min；根据色谱图，分别确定待检食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪。
2.根据权利要求1所述的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是：所述色谱图中，根据乙偶姻的线性回归方程A1＝26.5006C1-0.7685，获得待检食醋中乙偶姻的浓度C1；根据川芎嗪的线性回归方程A2＝5.8835C2-1.1001，获得待检食醋中川芎嗪的浓度C2；所述A1和A2分别代表乙偶姻和川芎嗪的峰面积。
3.根据权利要求1或2所述的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是：所述步骤1)中提取溶剂与食醋的体积比为5～8∶1。
4.根据权利要求3所述的同时检测食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是：所述步骤1)中超声提取时间为30～60min。
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