CN105628818B - 高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法 - Google Patents

高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，所述的六种甜味剂为A‑K糖、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜和新甲基橙皮苷二氢查耳酮NHDC；包括：(1)制备混合标准工作液；(2)制备待测样品溶液；(3)所用仪器为高效液相色谱仪；(4)所用前处理方法为加入乙醇，使样品中难溶于水的组分NHDC充分溶解；(5)标准曲线的绘制；(6)结果分析。采用了该发明中的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，操作简单，检测结果准确可靠、重复性好，21分钟内即可完成六种甜味剂含量的检测，检测效率高，分离效果优异，同时也减少了检测过程中检测试剂对环境造成的污染。

Description

高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法
技术领域
本发明涉及添加剂检测领域，尤其涉及甜味剂的检测方法，具体是指一种高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法。
背景技术
由于甜味剂有掩盖饲料原料异味和改善饲料适口性的作用，被广泛使用在在饲料行业中。目前在饲料工业应用的甜味剂已由传统的单一甜味剂(糖精钠)转变为复配型，即以糖精钠为主，并加增效剂(A-K糖、甜蜜素、阿斯巴甜等)和长效甜味剂(新甲基橙皮苷二氢查耳酮、纽甜等)而组成的复合物。复合甜味剂利用不同甜原料在口腔中的味觉时间差以及各甜原料之间的协同效应，提高甜味剂的甜度，改善甜味剂的甜感，能够达到更好的诱食效果。因此，如何有效的监控复合甜味剂的成分和含量，已成为饲料公司、养殖户以及饲料添加剂公司的关注热点。
目前，关于甜味剂的检测方法很多，最常见的有高效液相色谱-紫外检测法、毛细管气相色谱法、紫外分光光度法等，但这些检测方法大多是针对单一甜味剂或两种甜味剂进行测定，检测灵敏度也有待提高。因此，当需要检测复合甜味剂中的甜味剂成分时，需要采用各自的前处理技术和分析方法，检测费时、费力，并且消耗资金大。也有采用超高压液相色谱-飞行时间质谱仪、超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测多种甜味剂的报道，但这2种分析仪器造价高昂，不便于在我国普遍推广。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够实现的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法。
为了实现上述目的，本发明的方法具有如下构成：
该一种能够实现的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，其主要特点是，所述的包括所述的六种甜味剂为A-K糖、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜和新甲基橙皮苷二氢查耳酮NHDC；所述的检测方法包括：
(1)制备混合标准工作液，所述的混合标准工作液中甜味剂的浓度分别为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml；
(2)制备待测样品溶液，准确称取0.1g样品于100mL容量瓶中，加入10mL乙醇，超声溶解10～15min，使难溶于水的组分充分溶解，再用水定容至100mL，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液；
(3)所用仪器为高效液相色谱仪，检测器为紫外检测器VWD，检测波长为200nm，色谱柱为反相C18，色谱柱温度为30±1℃；流动相A为乙腈，流动相B为20mmol/L硫酸铵；梯度洗脱程序为乙腈：0～2min，5％；2～10min，5％～10％；10～18min，10％～50％；18～20min，50％～5％；流速：1.0ml/min；
(4)所用前处理方法为加入乙醇，使样品中难溶于水的组分NHDC充分溶解，用水稀释成1mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品溶液，进样体积为20μL；
(5)标准曲线的绘制：将六种甜味剂的系列混合标准溶液注入高效液相色谱仪中，在(3)的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线；
(6)结果分析：取(2)中缩的的滤液，在(3)的色谱条件下进样分析，测得滤液中各组分的峰面积，以保留时间定性，根据步骤(5)中制作的标准曲线定量，计算滤液中各甜味剂的浓度，由此计算出待检测样品中甜味剂的含量。
优选地，所述的混合标准工作液为现配现用，所述的混合标准工作液由混合标准储备液稀释而来，分别准确量取0.10ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、10.00ml混合标准储备液至10ml容量瓶中，用水定容后混匀得混合标准工作液。
更优选地，所述的混合标准储备液的制备过程为：分别准确称取0.1000gA-K糖、0.0851g糖精钠标准品、0.1000g甜蜜素、0.1000g阿斯巴甜、0.1000g新甲基橙皮苷二氢查耳酮标准品、0.1000g纽甜于100ml容量瓶中，加30％乙腈水溶液溶解后，定容至100.00ml，摇匀。
进一步优选地，所述的混合标准储备液于4℃条件下储藏，保存期为3个月。
更进一步优选地，所述的反相C18色谱柱规格为250mm×4.6mm，5μm。
再进一步优选地，所述的流动相B中的硫酸铵用H3PO4调pH至4.4。
最优选地，所述的标准曲线的相关系数大于0.999。
采用了该发明中的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明建立了一种高效液相色谱仪同时检测饲用甜味剂中六种甜味剂的方法，能够对饲用甜味剂中的甜味剂进行定性和定量，为饲用甜味剂成分和含量的准确判定和快速检测提供科学依据。
(2)本发明中混合标准工作液中甜味剂的浓度分别为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml；能够一次性检测含量在1％～100％之间的任何浓度的甜味剂，适用于饲用甜味剂含量的检测。
(3)本发明中使用的分析仪器为高效液相色谱-紫外检测器，相对于超高压液相色谱-飞行时间质谱仪、超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪等造价高昂的仪器，更加普及，更利于检测方法的应用。
(4)本发明操作简单，检测结果准确可靠、重复性好，21分钟内即可完成六种甜味剂含量的检测，检测效率高。
(5)本发明中反相C18色谱柱与10～19mmol/L硫酸铵(用H3PO4调pH＝4.4)-乙腈流动相的选择对饲用甜味剂中的六种甜味剂的分离达到了优异的分离效果(特别是糖精钠与甜蜜素的分离)，同时也减少了检测过程中检测试剂对环境造成的污染，检测人员安全性高。
(6)本发明中样品的前处理加入乙醇并超声溶解，更利于难溶于水的组分的充分溶解，更能保证检测结果的准确性。
附图说明
图1为本发明的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的混合标准溶液高效液相色谱图。
图2为现有市售甜味剂样品溶液1的高效液相色谱图。
图3为现有市售甜味剂样品溶液2的高效液相色谱图。
图4为现有市售甜味剂样品溶液3的高效液相色谱图。
附图标记
1 A-K糖，保留时间7.4min
2 甜蜜素，保留时间10.9min
3 糖精钠，保留时间12.3min
4 阿斯巴甜，保留时间16.5min
5 新甲基橙皮苷二氢查耳酮，保留时间18.7min
6 纽甜，保留时间20.2min
11 A-K糖
12 甜蜜素
13 糖精钠
14 新甲基橙皮苷二氢查耳酮
15 纽甜
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
实施例1：市售某3种饲用甜味剂的检测
1.试剂和材料
除非有特殊说明，本测定方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。
1.1甲醇：色谱纯
1.2乙睛：色谱纯
1.3硫酸铵：优级纯
1.4A-K糖标准品：98.0％，东京化成工业株式会社
1.5糖精钠标准品：99.0％，Dr.Ehrenstorfer公司，德国
1.6甜蜜素标准品：98.0％，东京化成工业株式会社
1.7阿斯巴甜标准品：98.0％，东京化成工业株式会社
1.8新甲基橙皮苷二氢查耳酮标准品：98.0％，CNWTechnologiesGmbH，德国
1.9纽甜标准品：98.0％，东京化成工业株式会社
1.10混合标准品储备液：分别准确称取0.1000gA-K糖(1.4)、0.0851g糖精钠标准((1.5)，120℃下烘干4h)、0.1000g甜蜜素(1.6)、0.1000g阿斯巴甜(1.7)、0.1000g新甲基橙皮苷二氢查耳酮标准品(1.8)、0.1000g纽甜(1.8)于100ml容量瓶中，加30％乙腈水溶液溶解后，定容至100.00ml，摇匀，此混合标准品储备液中六种甜味剂的浓度均为1.00mg/ml。此溶液4℃条件下储藏，保存期3个月。
1.11混合标准品工作液：分别准确量取0.10ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、10.00ml混合标准储备液(1.10)至10ml容量瓶中，用水定容，混匀，此为混合标准工作液。混合标准工作液中甜味剂的浓度分别为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml。此溶液现配现用。
2.仪器和设备
2.1实验室常用仪器设备
2.2分析天平：感量0.0001g
2.3水性微孔滤膜：孔径0.45μm
2.4有机相微孔滤膜：孔径0.45μm
2.5高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器或紫外检测器。
2.6超声波清洗器
2.7具塞塑料离心管：1.5ml
3.方法
3.1色谱条件
a)色谱柱：ZorbaxEclipsePlus反相C18(250mm×4.6mm，5μm)；
b)流动相：20mmol/L硫酸铵(用H3PO4调pH＝4.4)-乙腈；
c)梯度洗脱程序：乙腈：0～2min，5％；2～10min，5％～10％；10～18min，10％～50％；18～20min，50％～5％；
d)流速：1.0ml/min；
e)检测波长：200nm；
f)色谱柱温度：30±1℃；
g)进样体积：20μL；
3.2绘制标准曲线
分别取混合标准品工作液(1.11)，按照3.1的色谱条件进行色谱分析测定。以各甜味剂的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归，各线性回归方程所对应的曲线即为相应甜味剂的标准曲线。
所述的六种甜味剂对应的线性回归方程及相关系数r2见表1，方程中Y即为相应甜味剂所对应的峰面积，X即为甜味剂的质量浓度。
表1.六种甜味剂的线性回归方程、相关系数、检出限
精密量取溶液为0.01mg/ml的混合标准溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱仪，连续进样6次，根据标准曲线计算各甜味剂的测得浓度，再计算6次测得浓度的标准偏差，三倍标准偏差即为该调味剂的检测限。
精密量取溶液为0.01mg/ml的混合标准溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱仪，连续进样6次，根据标准曲线计算各甜味剂的测得浓度，再计算6次测得浓度的标准偏差，三倍标准偏差即为该调味剂的检测限。
3.3样品测定及结果计算
3.3.1待测样品的配制
准确称取0.1g(精确至0.0001g)样品于100ml容量瓶中，加入10mL乙醇，超声溶解10min，冷却至室温后，用水定容至100.00ml，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液作为样液。
3.3.2待测样品的测定
在相同的色谱条件下，分别精密量取样品溶液20μL注入液相色谱仪，进行梯度洗脱和检测，以表1中的混合标准工作液作多点校准，用色谱峰面积分值定量。
3.3.3结果计算与表述
试样中A-K糖、糖精钠、甜蜜素、新甲基橙皮苷二氢查耳酮、纽甜、阿斯巴甜的含量X，以质量分数表示，按下式计算：
式中C—由标准曲线得出的试样中A-K糖、糖精钠、甜蜜素、新甲基橙皮苷二氢查耳酮、纽甜、阿斯巴甜的浓度，mg/ml。
V—试样液总体积，ml。
m—试样的质量，g。
样品溶液1、2、3的色谱图分别见图2、图3、图4。不同甜味剂样品的检测结果见表2。
表2.样品中甜味剂的含量(％)
样品编号 安赛蜜 糖精钠 甜蜜素 阿斯巴甜 NHDC 纽甜
1 5.69 36.78 35.54 — 0.35 2.86
2 7.15 18.11 38.85 — 0.20 3.11
3 2.02 91.89 — — — 1.84
4.方法重复性
精密量取样品溶液注入液相色谱仪检测，连续检测5次，计算各甜味剂测得含量的相对标准偏差(RSD)。结果见表3.
表3.样品1中甜味剂含量的相对标准偏差
样品编号 安赛蜜(％) 糖精钠(％) 甜蜜素(％) NHDC(％) 纽甜(％)
1 5.69 36.78 35.54 0.35 2.86
2 5.91 36.49 36.35 0.34 2.84
3 5.78 35.57 36.08 0.34 2.77
4 5.60 35.64 35.91 0.32 2.64
5 5.93 36.13 35.79 0.33 2.84
6 5.82 35.92 36.21 0.32 2.83
7 5.95 35.61 35.99 0.35 2.87
8 6.00 35.76 36.26 0.33 2.81
平均值(％) 5.84 35.99 36.02 0.33 2.81
RSD(％) 2.34 1.24 0.74 3.67 2.64
5.准确度试验
在试样1中，加入不同量的甜味剂原料，配成6个已知样，在相同的色谱操作条件下，定量分析、计算，测得各个甜原料的回收率如表4。
表4.样品1中甜味剂的加标回收实验
备注：A-K糖(AK)、糖精钠(SA)、甜蜜素(SC)、阿斯巴甜(ASP)、新甲基橙皮苷二氢查耳酮(NHDC)、纽甜(S)
采用了该发明中的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明建立了一种高效液相色谱仪同时检测饲用甜味剂中六种甜味剂的方法，能够对饲用甜味剂中的甜味剂进行定性和定量，为饲用甜味剂成分和含量的准确判定和快速检测提供科学依据。
(2)本发明中混合标准工作液中甜味剂的浓度分别为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml；能够一次性检测含量在1％～100％之间的任何浓度的甜味剂，适用于饲用甜味剂含量的检测。
(3)本发明中使用的分析仪器为高效液相色谱-紫外检测器，相对于超高压液相色谱-飞行时间质谱仪、超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪等造价高昂的仪器，更加普及，更利于检测方法的应用。
(4)本发明操作简单，检测结果准确可靠、重复性好，21分钟内即可完成六种甜味剂含量的检测，检测效率高。
(5)本发明中反相C18色谱柱与10～19mmol/L硫酸铵(用H3PO4调pH＝4.4)-乙腈流动相的选择对饲用甜味剂中的六种甜味剂的分离达到了优异的分离效果(特别是糖精钠与甜蜜素的分离)，同时也减少了检测过程中检测试剂对环境造成的污染，检测人员安全性高。
(6)本发明中样品的前处理加入乙醇并超声溶解，更利于难溶于水的组分的充分溶解，更能保证检测结果的准确性。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (7)

1.一种高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，其特征在于，所述的六种甜味剂为A-K糖、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜和新甲基橙皮苷二氢查耳酮NHDC；所述的检测方法包括：
(1)制备混合标准工作液，所述的混合标准工作液中甜味剂的系列浓度分别为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml；
(2)制备待测样品溶液，准确称取0.1g样品于100mL容量瓶中，加入10mL乙醇，超声溶解10～15min，使难溶于水的组分充分溶解，再用水定容至100mL，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液；
(3)所用仪器为高效液相色谱仪，检测器为紫外检测器VWD，检测波长为200nm，色谱柱为反相C18，色谱柱温度为30±1℃；流动相A为乙腈，流动相B为20mmol/L硫酸铵；梯度洗脱程序为乙腈：0～2min，5％；2～10min，5％～10％；10～18min，10％～50％；18～20min，50％～5％；流速：1.0ml/min；
(4)所用前处理方法为加入乙醇，使样品中难溶于水的组分NHDC充分溶解，用水稀释成1mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品溶液，进样体积为20μL；
(5)标准曲线的绘制：将六种甜味剂的系列混合标准溶液注入高效液相色谱仪中，在(3)的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线；
(6)结果分析：取(2)中的滤液，在(3)的色谱条件下进样分析，测得滤液中各组分的峰面积，以保留时间定性，根据步骤(5)中制作的标准曲线定量，计算滤液中各甜味剂的浓度，由此计算出待检测样品中甜味剂的含量。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，其特征在于，所述的混合标准工作液为现配现用，所述的混合标准工作液由混合标准储备液稀释而来，分别准确量取0.10ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、10.00ml混合标准储备液至10ml容量瓶中，用水定容后混匀得混合标准工作液。
3.根据权利要求2所述的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，其特征在于，所述的混合标准储备液的制备过程为：分别准确称取0.1000gA-K糖、0.0851g糖精钠标准品、0.1000g甜蜜素、0.1000g阿斯巴甜、0.1000g新甲基橙皮苷二氢查耳酮标准品、0.1000g纽甜于100ml容量瓶中，加30％乙腈水溶液溶解后，定容至100.00ml，摇匀。
4.根据权利要求3所述的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，其特征在于，所述的混合标准储备液于4℃条件下储藏，保存期为3个月。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，其特征在于，所述的反相C18色谱柱规格为250mm×4.6mm，5μm。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，其特征在于，所述的流动相B中的硫酸铵用H3PO4调pH至4.4。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，其特征在于，所述的标准曲线的相关系数大于0.999。
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