CN106053627B - 一种果汁中26种有机酸和无机阴离子同时检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果汁中26种有机酸和无机阴离子同时检测的方法其制作方法，通过对果汁进行样品前处理，利用多级梯度‑抑制电导离子色谱法实现了果汁中18种有机酸(奎尼酸、乳酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、乙酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、戊二酸、马来酸、富马酸、苯甲酸、顺乌头酸、反乌头酸、草酸)和8种无机阴离子(F^‑、Cl^‑、NO₃ ^‑、NO₂ ^‑、ClO₂ ^‑、BrO₃ ^‑、PO₄ ^3‑、CrO₄ ^2‑)共计26种组分同时检测分析的目标，具有样品前处理简单、快速、准确的技术优点，解决了对果汁中多类项目多种组分准确分析的技术难题，准确测定果汁中的有机酸和无机阴离子，为果汁营养价值、保鲜状态、是否掺假提供强有力的技术支持，对果汁成份检测做出重要的贡献。

Description

一种果汁中26种有机酸和无机阴离子同时检测的方法

技术领域

本发明涉及一种化学领域的检测方法，具体涉及一种果汁中26种有机酸和无机阴离子同时检测的方法。

背景技术

有机酸，是具有酸性特征的一类有机化合物，广泛存在于植物的果实、茎叶中。在我们日常食用的水果、蔬菜、果汁等多种食品中有机酸含量的大小，会直接影响到食品口感和风味，有机酸可以表征产品的质量好坏，辨别食品的新鲜程度。无机阴离子，是水果、蔬菜及其制品中不可或缺的部分，某些阴离子含量过高会危害人体健康，甚至会在体内累积转化为致癌物，可见无机阴离子测定的重要性同样毋庸置疑。

果汁、饮料中常见的有机酸和无机阴离子是其重要组成部分，无机阴离子均有限量范围，超标时会损害身体，某些有机酸含量较少时，直接影响到液体食品的营养、口感。准确测定果汁中的有机酸和无机阴离子，可为果汁营养价值、保鲜状态、是否掺假的判定提供强有力的技术支持。

目前，对于果汁中多种有机酸和无机阴离子含量同时测定的研究较少，也缺乏检测标准依据。当前，一种果汁中的监测项目中就含有10多种有机酸和无机阴离子，需要分别采用4-5种不同检测标准进行前处理和上机检测分析，如有机酸(GB 5009.157-2003苹果酸、柠檬酸、丁二酸)、防腐剂(GB/T 23495-2009苯甲酸)、添加剂(GB 5009.33-2010硝酸盐、亚硝酸盐)、无机阴离子(GB/T 5750.5-2006F^-、Cl^-、NO₃ ^-)。采用不同的检测标准、不同的前处理方法、不同的检测仪器(HPLC、IC)，会耗费大量人力物力，检测工作效率低，不能满足日益增长的检测需求，且目前资料库中所能检索到的仅仅是对某一类组分(单纯有机酸或者单纯无机阴离子)进行同时检测，或者同时检测的组分数量较少(如仅对10多种组分同时分析)，无法满足果汁基质中多类组分多种离子的同时检测的要求。因此，研究并建立一种适用性强、选择性好、灵敏度高的多种有机酸和无机阴离子同时检测的方法，具有重要的现实意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种灵敏准确且快速简便的检测方法，一次进样就可以实现对果汁中18种有机酸(奎尼酸、乳酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、乙酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、戊二酸、马来酸、富马酸、苯甲酸、顺乌头酸、反乌头酸、草酸)和8种无机阴离子(F^-、Cl^-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、ClO₂ ^-、BrO₃ ^-、PO₄ ^3-、CrO₄ ^2-)共计26种组分进行同时检测分析。

为达到上述目的，本发明公开了一种果汁中26种有机酸和无机阴离子同时检测的方法，采用多级梯度淋洗-抑制电导离子色谱法同时测定果汁中26种有机酸和无机阴离子。其具体步骤如下：

步骤一、标准储备液的配置：无机阴离子均为购自国家标物中心的F^-、Cl^-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、ClO₂ ^-、BrO₃ ^-、PO₄ ^3-、CrO₄ ^2-的标准溶液，离子浓度均为1000mg/L，有机酸均为购买的优级纯的奎尼酸、乳酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、乙酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、戊二酸、马来酸、富马酸、苯甲酸、顺乌头酸、反乌头酸、草酸的标准物质，用时根据需称取标准物质用超纯水配成标准储备液和标准工作液；

步骤二、待测样品前处理：检测前采用浓度为4.0mol/L的KOH溶液，调节pH值至中性，取10mL样品放入50mL离心管中，在10000r/min条件下高速离心15min，称取上清液样品1.00g，用超纯水定容至100mL容量瓶中，摇匀、静置10min，取10.0mL溶液，过0.22μm水相滤膜，弃去前面3mL，收集后面清液，等待检测；

步骤三、离子色谱条件：

离子色谱仪：DIONEX ICS-2100；

色谱柱：IonPac AS11-HC型分离柱(250mm×4mm)，IonPac AG11-HC型保护柱(50mm×4mm)；

超纯水仪：美国Millipore；

流动相：KOH梯度淋洗液；

实验用水：超纯水(电阻率18.2MΩ.cm)；

流速：1.00mL/min；

抑制器再生模式：外加水电导抑制，电导检测器检测；

柱温：30℃；

进样量：50μL；

优选的所述流速为1.0mL/min，所述柱温为30℃。

步骤四、多级梯度淋洗程序为：经大量实验研究发现，理想多级梯度淋洗条件为：0-8min时，淋洗液KOH浓度为1.25mmol；8-18min，淋洗液KOH浓度为1.25-15.0mmol；18-29min，淋洗液KOH浓度为15.0-28.0mmol；29-40min，淋洗液KOH浓度为28.0-70.0mmol；40-41min，淋洗液KOH浓度为70.0-1.25mmol；41-48min，淋洗液KOH浓度为1.25mmol；详见表1。

表1离子色谱多级梯度淋洗条件

序号	时间/min	KOH浓度/mmol/L	抑制器电流/mA
				1	0.0	1.25	174
2	8.0	1.25	174
				3	18.0	15.0	174
4	29.0	28.0	174
				5	40.0	70.0	174
6	41.0	1.25	174
				7	48.0	1.25	174

步骤五、将步骤一中所得标准储备液和标准工作液液按照步骤三中离子色谱条件和步骤四中多级梯度淋洗程序进行上机检测，并计算结果，根据保留时间定性，峰面积外标法定量；

步骤六、将步骤二中所得后面清液按照步骤三中离子色谱条件和步骤四中多级梯度淋洗程序进行上机检测，并计算结果；

步骤七、结果对比：通过步骤五标准溶液所测得的结果来校正步骤六所得计算结果，从而得出所测果汁中各组分含量。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

A.对于果汁中有机酸和无机阴离子两类组分多种物质同时检测，一直是本技术领域的技术难题，本发明对果汁中26种成份同时分析，提高了检测效率，显著降低了检测成本。

B.本发明同时分析果汁中26种成份技术难点主要在于，如何通过实验确定最佳的梯度淋洗程序等分析条件，单就剃度淋洗程序来讲，待分析待检测的成分越多，则对梯度淋洗程序的要求越高，需要在一个合理的分析时间内将某些保留特性非常相近的组分准确分离(比如一些弱保留的有机酸)，不同的梯度淋洗程序的优化选择决定了26种成分是否能够不受干扰的达到基线分离，这样才能进行准确地定量。本发明通过30多次的实验分析和改进，探索出了一种多级梯度淋洗条件，可以实现26种有机酸和无机阴离子有效分离和同时测定；实验证实，梯度条件的小改动，就可能造成组分之间重叠或出峰顺序改变，而本梯度淋洗实验条件的选取有效提高了检测灵敏度和准确性。

C.实际操作中前处理操作步骤简单，经过高速离心和滤膜过滤，可有效去除果粒及其他杂质，基质干扰组分少，检测灵敏度高。

D.探索出了pH值对26种有机酸和无机阴离子同时检测的影响，通过调节检测溶液的pH值，大大提高了检测准确性。经过对标准溶液和添加样品的pH值考察发现，在检测之前调节pH值，有机酸和无机阴离子能够保持稳定，线性相关性大大提高，在0.02mg/L-10mg/L线性范围内，相关系数由调节pH值前的均大于0.98提高到了均大于0.995。通过调节pH值来提高无机阴离子和有机酸同时检测的灵敏度，是本发明方法的又一重要创新。

E.检测灵敏度高，其中25种组分检出限在0.00017-0.0144mg/L之间；添加回收率检测浓度水平更低，以前的研究报道仅是对1-10mg/L水平上做添加回收，而本实验对0.1-2.0mg/L范围内五个更低浓度水平上做了添加回收，而且采用的是不同果汁基质，使用“三基质五浓度六平行”方式充分验证了方法的适应性和准确性，回收率检测结果符合食品理化检测的要求。

综上所述，本发明提供了优化的梯度淋洗程序和离子色谱测试条件，确定了利用离子色谱同时检测果汁中26种无机阴离子和有机酸的方法，一次进样对果汁中的无机阴离子F^-、Cl^-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、ClO₂ ^-、BrO₃ ^-、PO₄ ^3-、CrO₄ ^2-以及有机酸如奎尼酸、乳酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、乙酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、戊二酸、马来酸、富马酸、苯甲酸、顺乌头酸、反乌头酸、草酸等进行同时测定，具有样品前处理简单、快速、准确，并能在50分钟内同时测定果汁中26种无机阴离子和有机酸等的优点，解决了对果汁中多类项目多种组分准确分析的技术难题，准确测定果汁中的有机酸和无机阴离子，为果汁营养价值、保鲜状态、是否掺假提供强有力的技术支持，对果汁成份检测做出重要的贡献。

附图说明

图1为26种组分标准溶液色谱分离图。

图2为苹果汁、葡萄汁、橙汁添加色谱叠加图。

图3为ClO₂ ^-在调节pH值前线性图谱。

图4为ClO₂ ^-在调节pH值后线性图谱。

图5为六种果汁中有机酸和无机阴离子检测色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。

实施例一

色谱条件的确定

1、色谱柱的选择：先后考察了AS11、AS11-HC、AS19三种色谱柱的实验分离效果，发现同等条件下，采用AS11-HC色谱柱时峰型最尖锐，综合分离效果最好。这是因为AS11-HC是高柱容量色谱柱，对有机酸和无机阴离子具有很好的保留作用，非常适合多组分同时检测。因此，选择AS11-HC色谱柱进行实验测定。

2、流速的选择：先后考察了0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min的流速条件下的实验分离情况，0.5mL/min时色谱分离效果较1.0mL/min时降低，虽然分离度较1.0mL/min时稍大，但是总出峰时间变长，而且流速降低，保留时间增大，峰高也会随之变矮，峰灵敏度就会下降。而在1.5mL/min和2.0mL/min流速条件下，总出峰时间减小，但是很多组分色谱峰的分离度降低，无法有效分离。因此，经过数次反复实验探索，综合考虑提高分离效果和缩短检测时间的因素，选择在1.0mL/min条件下，进行色谱分离实验。

3、初始淋洗浓度的选择：26种组分同时检测时，整个色谱梯度分离过程被分成了4段(0-8min、8-18min、18-28min、28-40min)，通过多次改进梯度实验发现，初始浓度对整体分离效果影响最大，它是整个多级梯度淋洗条件中的基石。先后考察了1.0mL/min、1.25mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min初始浓度条件下的实验分离情况，发现初始浓度为1.25mL/min时，前10种出峰组分的分离效果最佳，在此实验条件下，再优化改进后面3段梯度淋洗条件，可有效地提高17min后出峰的16种组分的整体分离效果和检测灵敏度。因此，选择1.25mL/min浓度为初始淋洗浓度。

4、溶液pH值对检测的影响：当酸性较大时，特别是当标准储备液和标准工作液浓度大于5.0mg/L时，溶液中弱酸离子(ClO₂ ^-和NO₂ ^-)容易与高浓度的H⁺结合生成分子状态或析出气体分子。另外，PO₄ ^3-和CrO₄ ^2-也易受pH值影响，转化为其他离子态物质。实验测定分析发现，以上4种无机离子在中性或者弱碱性溶液中稳定性比酸性溶液中明显提高，例如5.0mg/L的标准工作液中ClO₂ ^-和NO₂ ^-，未调节pH值时的检测含量仅为调节pH值后检测含量的80％左右，说明书附图中图3和图4分别是ClO₂ ^-在调节pH值前和调节pH值后线性图谱，显然调节pH值后线性得到实质的改进，同样其他有机酸和无机阴离子在调节pH值后，线性也得到了不同程度的改进。

经过实验分析得出，在配置标准工作液，首先加入有机酸，然后加入一定体积的KOH溶液来调节pH值(中性或弱碱性)，最后再加入无机阴离子溶液，这样可避免有机酸中大量H⁺对无机阴离子的影响。样品检测前，同样将pH值调至中性或弱碱性。通过调节pH值来提高无机阴离子和有机酸同时检测的灵敏度，是本发明方法的又一重要创新。

实施例二

测定方法的准确性

1、检出限及校准曲线

分别配制不同浓度的18种有机酸和8种无机阴离子标准工作液，上机检测，得出26种组分标准溶液色谱分离图，详见说明书附图中图1。通过色谱峰信噪比来计算待测组分的检出限(S/N＝3)。在0.02mg/L到10.0mg/L浓度范围内，进行了9个不同浓度点(0.02、0.04、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L)标准工作液的检测及线性拟合，相关系数均大于0.995，说明在该实验条件下，多组分同时检测时线性良好。具体见表2，其中Y为峰面积(μS.min)，X为组分质量浓度(mg/L)。

表2线性方程、相关系数及检出限

从表2中，可以看出25种组分检出限在0.00017-0.0144mg/L之间，只有苯甲酸检出限为0.052mg/L。与有机酸相比，8种无机阴离子比较稳定，检出浓度较低，Cl^-检出限最低达到了1.7×10^-4mg/L。从相关系数来看，仅有F^-、丁酸、丙二酸三种组分线性系数低于0.999，其他23种组分相关系数均大于0.999。

2、分析方法验证

采用检测回收率的方法对本发明所述的一种果汁中26种有机酸和无机阴离子同时检测的方法进行适应性和准确性的验证。

分别选取三种果汁饮料(苹果汁、葡萄汁、橙汁)，依次在进行5个添加浓度水平实验0.1mg/L(苹果汁)、0.2mg/L(葡萄汁1)、0.5mg/L(橙汁1)、1.0mg/L(葡萄汁2)、2.0mg/L(橙汁2)，每个浓度水平进行6次平行测定实验，来充分验证方法的回收率和适应性，根据添加前样品浓度、添加浓度和添加后测定浓度计算回收率。

回收率计算式为：回收率＝(添加后测定浓度-样品浓度)/添加浓度*100％。

具体回收实验数据(如0.2mg/L)细分表见表3，三种基质、五个浓度水平、六次平行检测回收率统计总表见表4，检测色谱图详见说明书附图中图2。

表3回收率测定数据细分表(添加浓度0.2mg/L，基质葡萄汁1)

表4回收率测定数据统计总表(三种果汁添加浓度0.1mg/L-2.0mg/L)

通过表4可以看出，在0.1mg/L添加浓度水平时，虽然苯甲酸和顺乌头酸回收率为62.23％和64.27％，但是依然满足食品理化检验要求(测定含量小于0.1mg/L，回收率应在60％-120％)。其他组分回收率均高于80％，这说明在低于0.1mg/L添加浓度水平时，这两种组分不够稳定，为了提高检测准确性，苯甲酸和顺乌头酸测定时应该通过改变稀释倍数等方法，使定量浓度高于0.2mg/L(回收率大于80％)。总体来说，三种基质、五个浓度水平、六次平行检测回收率数据准确、可靠，符合食品理化检测要求。

3、重复性

配置0.2mg/L浓度水平标准溶液，进行6次平行进样检测，根据计算6次平行实验结果(检测含量和保留时间)的相对标准偏差RSD，另外，对添加了0.2mg/L的果汁溶液进行6次重复前处理实验，并上机检测，所得出实验数据符合GB/T 27404-2008附录F中对精密度的要求。

表5重复性实验数据分析表(检测含量单位为：mg/L)

从表5中可以看出，在0.2mg/L浓度时，6次平行测定，检测含量相对标准偏差最大为3.57％，最小仅为0.48％；保留时间相对标准偏差仅为0.01％-0.11％，这充分说明该实验梯度条件下，检测方法非常稳定可靠。

另外对添加0.2mg/L浓度的果汁进行6次平行检测，具体数据见表3，通过分析发现26种组分检测含量相对标准偏差在0.30％-7.65％之间，重复性实验数据同样符合食品理化检验的要求。

实施例三

实际样品测定

选取了6种常见果汁饮料(苹果汁、葡萄汁、橙汁、桃汁、梨汁、混合果汁)，进行了实际样品中有机酸和无机阴离子含量的检测。

检测前采用浓度为4.0mol/L的KOH溶液，调节pH值至中性(6.5-8.0)，取10mL样品放入50mL离心管中，在10000r/min条件下高速离心15min，称取上清液样品1.00g，用超纯水定容至100mL容量瓶中。摇匀、静置10min，取10.0mL溶液，过0.22μm水相滤膜，弃去前面3mL，收集后面清液，等待检测。

将所得后面清液按照离子色谱条件和多级梯度淋洗程序进行上机检测，并计算结果。

具体检测数据详见表6和说明书附图中图5。

表6六种果汁样品中有机酸和无机阴离子测定含量

从表6和说明书附图图5中，可以看出果汁中主要的有机酸是柠檬酸、草酸、苹果酸、乳酸、乙酸、甲酸等；主要的无机离子是PO₄ ^3-、NO₃ ^-、Cl^-。从果汁种类看，橙汁中有机酸种类和含量最丰富，其次是苹果汁。其中有毒有害离子BrO₃ ^-、CrO₄ ^2-、ClO₂ ^-均未检出，这说明这6种果汁在生产加工过程中，对水果原料和使用水质控制较好。从实际样品测定结果来看，该检测方法简单、快速、准确、实用。

Claims (2)

1.一种果汁中26种有机酸和无机阴离子同时检测的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、标准储备液的配置：无机阴离子均为购自国家标物中心的F^-、Cl^-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、ClO₂ ^-、BrO₃ ^-、PO₄ ^3-、CrO₄ ^2- 的标准溶液，离子浓度均为1000mg/L，有机酸为奎尼酸、乳酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、乙酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、戊二酸、马来酸、富马酸、苯甲酸、顺乌头酸、反乌头酸、草酸的标准物质，用时根据需要称取标准物质用超纯水配成标准储备液和标准工作液；

步骤二、待测样品前处理：检测前采用浓度为4.0mol/L的KOH溶液，调节pH值至中性，取10mL样品放入50mL离心管中，在10000r/min条件下高速离心15min，称取上清液样品1.00g，用超纯水定容至100mL容量瓶中，摇匀、静置10min，取10.0mL溶液，过0.22μm水相滤膜，弃去前面3mL，收集后面清液，等待检测；

步骤三、离子色谱条件：

离子色谱仪：DIONEX ICS-2100；

色谱柱：IonPac AS11-HC型分离柱，250 mm×4 mm，IonPac AG11-HC型保护柱，50 mm×4 mm；

超纯水仪：美国Millipore；

流动相：KOH梯度淋洗液；

实验用水：超纯水，电阻率18.2MΩ.cm；

流速：1.00 mL/min；

抑制器再生模式：外加水电导抑制，电导检测器检测；

柱温：30℃；

进样量：50μL；

步骤四、多级梯度淋洗程序为：0-8min时，淋洗液KOH浓度为1.25mmol；8-18min，淋洗液KOH浓度为1.25-15.0mmol；18-29min，淋洗液KOH浓度为15.0-28.0mmol；29-40min，淋洗液KOH浓度为28.0-70.0mmol；40-41min，淋洗液KOH浓度为70.0-1.25mmol；41-48min，淋洗液KOH浓度为1.25mmol；

步骤五、标准溶液检测：将步骤一中所得标准储备液和标准工作液按照步骤三中离子色谱条件和步骤四中多级梯度淋洗程序进行上机检测，并计算结果；

步骤六、样品检测：将步骤二中所得后面清液按照步骤三中离子色谱条件和步骤四中多级梯度淋洗程序进行上机检测，并计算结果；

步骤七、结果对比：通过步骤五标准溶液所测得的结果来校正步骤六所得计算结果，从而得出所测果汁中各组分含量。

2.根据权利要求1所述的果汁中26种有机酸和无机阴离子同时检测的方法，其特征在于，所述步骤二中调节pH值至6.5-8.0。