CN102636581A

CN102636581A - 同时检测谷物中黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法

Info

Publication number: CN102636581A
Application number: CN2011104416169A
Authority: CN
Inventors: 周有祥; 陈福生; 王小红; 董丽娜; 陈建彪; 路磊; 李书谦; 胡定金
Original assignee: Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2012-08-15

Abstract

本发明属于食品安全检测技术领域，提供一种高效液相色谱法同时检测谷物中的黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的方法。该方法通过通用型提取液提取，以高效液相色谱-荧光检测器法检测和外标法定量。本发明的检出限分别为黄曲霉毒素B₁1.08μg/kg、赭曲霉毒素A3μg/kg、玉米赤霉烯酮35.85μg/kg和桔霉素6.52μg/kg。该发明方法简便快捷，环境污染小，检测成本低，适用于谷物中四种真菌毒素的同时定量检测。

Description

同时检测谷物中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法。

背景技术

真菌毒素是指在产毒丝状真菌的生长代谢过程中，分泌产生的对人畜健康有害的次生代谢产物。由于这类真菌毒素分布广，某些毒素还具有致畸、致癌和致突变等作用，近年被世界卫生组织列为食源性疾病的三大根源之一。由于产毒真菌在适宜条件下，极易在产前产后侵染农产品，导致真菌毒素的污染，进而威胁人类和畜禽的健康，也带来了巨大的经济损失。目前，世界各国虽对真菌毒素建立较为完善的防控措施，但在现有生产力水平下，要完全杜绝真菌毒素进入人类的食物链是无法实现的。

通常条件下，黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁，AFB₁）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）等真菌毒素均易出现在霉变谷物中，而且多种毒素并存的现象也有报道，其毒素的加和毒性更是极具威胁。发生多种毒素并存的现象主要是由两方面原因导致的，其一，现代食品工业的高度集成化，增加了不同原料间交叉污染的可能，也极大增加了多种毒素并存的几率，其二，某些产毒真菌，特别是产毒曲霉，在特定的条件下可以分泌多种真菌毒素。但是不管是单一毒素还是多种毒素，都将严重威胁到人和动物的健康。下表为以上所述四种真菌毒素的基本信息。

由于真菌毒素存在范围广，危害大。因此，许多国家和地区已对谷物等农产品中的真菌毒素制定了严格的限量标准和分析方法。但是，由于各种真菌毒素的物理化学性质差异很大，现有的分析方法均是针对单一毒素或者化学结构类似的同族毒素，而且存在检测周期长，成本高，污染大，效率低的缺点，难以有效对谷物中的真菌毒素进行防控；而已有的多真菌毒素检测技术通常是基于检测成本极大的高效液相色谱-串联质谱等尖端仪器设备，但在现阶段，这类高成本的检测技术尚难以在基层推广。

为了最大限度降低人群和畜禽动物面临的真菌毒素暴露风险，减少食品安全隐患。建立一种适用于谷物中多种真菌毒素同时检测的高通量、高灵敏度、低污染、低成本方法就显得极为必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有真菌毒素分析技术存在的缺点和不足，提供了一种同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的高效液相色谱-荧光检测法，该方法具有检测成本低、分析毒素快、灵敏度高和重复性好等特点。

为了实现上述目的，本发明采用通用型提取液，对谷物样品中的真菌毒素提取、净化后，注入高效液相色谱仪分离，并采用荧光检测器检测，以外标峰面积法对样品中的黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素进行定量分析，该方法包括以下步骤：

(1)谷物中待测真菌毒素的提取

(1-1)将谷物样品全部磨碎并通过40目分样筛后，准确称取5 g磨碎的谷物样品，精确至0.01 g，置于50 mL 具盖离心管A中，加入15 mL通用型提取液，剧烈振荡1 min，然后于摇床上以60 r/min振摇20 min，接着加入20 mL乙腈，60 r/min振摇10 min后，加入3 g 无水硫酸镁和2 g氯化钠作为复合盐析试剂，迅速并剧烈振荡1 min，以3500 r/min离心10 min，取出上层溶液至100 mL磨口烧瓶B中；

(1-2)往离心管A中再加入15 mL乙腈，经过剧烈振荡1 min后，以3500 r/min离心10 min，取出上层溶液，并与步骤（1-1）中取出的提取液合并于烧瓶B中，于40℃下减压浓缩近干；

(2)提取液净化

往烧瓶B中加入4 mL正己烷和1 mL酸性乙腈作为净化试剂充分荡洗，收集荡洗液，以3500 r/min离心后，弃去上层正己烷层，收集下层溶液于2.0 mL离心管C中，并用0.5 mL酸性乙腈重复洗涤烧瓶B 2次，收集荡洗液至离心管C中定容至2 mL，以15000 r/min离心1 min，取上清液过0.22 μm滤膜，得到待测样品溶液，供液相色谱分析；

(3)测定

（3-1）标准工作液和待测样品溶液在设定的液相色谱条件下进样，即将标准工作液和待测样品溶液注入高效液相色谱仪分离，并采用荧光检测器检测，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，待测样品溶液中真菌毒素的响应值应该在荧光检测器的线性范围内；

（3-2）在上述液相色谱条件下，若待测样品溶液中出现的真菌毒素色谱峰保留时间与标准工作液一致，则判断待测样品中存在相应的被测物，允许偏差小于±2.5%。

在上述技术方案中，步骤（1-1）中所述通用型提取液为12 mL冰乙酸以蒸馏水定容至100 mL制成。

在上述技术方案中，步骤（2）中所述酸性乙腈为乙酸和乙腈按照体积比1:9混合制成。

在上述技术方案中，步骤（3）中所述液相色谱条件为：

。

在上述技术方案中，步骤（3）中所述荧光检测器为四通道荧光检测器，设定的四种真菌毒素的四通道荧光检测器的参数为：

。

在上述技术方案中，步骤（3）中所述荧光检测器为单通道荧光检测器，设定的四种真菌毒素的单通道荧光检测器的程序时间波长参数为：

。

本方法通过液液萃取法提取，正己烷净化，高效液相色谱法分离，荧光检测器测定，外标法定量，回收率为：黄曲霉毒素B₁80.65%，赭曲霉毒素A 90.1%，玉米赤霉烯酮96%和桔霉素70%，相对标准偏差小于5.4%。本方法可以应用于谷物中黄曲霉毒素B₁，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮和桔霉素的同时检测。与现有技术相比本方法具有检测成本低，测定速度快，前处理操作简单，环境污染小等特点。该方法检出限：黄曲霉毒素B₁1.08 μg/kg、赭曲霉毒素A 3 μg/kg、玉米赤霉烯酮35.85 μg/kg和桔霉素6.52 μg/kg，满足目前国内谷物中四种真菌毒素的限量要求。

附图说明

图1是多通道荧光检测器条件下黄曲霉毒素B₁、桔霉素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮标准工作液的色谱图。

图2是多通道荧光检测器条件下加标回收样品溶液的色谱图。

图3是单通道荧光检测器条件下四种毒素标准工作液的色谱图。

图4是单通道荧光检测器条件下加标回收样品溶液的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步的描述。

本实施例提供一种同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法，该方法包括以下的步骤：

1 谷物中待测毒素的提取

1.1 试样制备

磨碎谷物样品并全部通过40目分样筛，充分混匀，避光低温保存备用。

1.2 通用型提取液的配制

吸取12 mL冰乙酸，以蒸馏水定容至100 mL，摇匀待用。

1.3 试样提取

准确称取5 g磨碎的谷物样品，精确至0.01 g，置于50 mL 具盖离心管A中，加入15 mL通用型提取液，剧烈振荡1 min，然后于摇床上以60 r/min振摇20 min，接着加入20 mL乙腈，60 r/min振摇10 min后，加入3 g 无水硫酸镁和2 g氯化钠作为复合盐析试剂，迅速并剧烈振荡1 min，以3500 r/min离心10 min，取出上层溶液至100 mL磨口烧瓶B中；

往离心管A中再加入15 mL乙腈，经过剧烈振荡1 min后，以3500 r/min离心10 min，取出上层溶液，并与上一步骤中取出的提取液合并于烧瓶B中，于40℃下减压浓缩近干。

1.4 净化

往烧瓶B中加入4 mL正己烷和1 mL酸性乙腈作为净化试剂充分荡洗，收集荡洗液，以3500 r/min离心后，弃去上层正己烷层，收集下层溶液于2.0 mL离心管C中，并用0.5 mL酸性乙腈重复洗涤烧瓶B 2次，收集荡洗液至离心管C中定容至2 mL，以15000 r/min离心1 min，取上清液过0.22 μm滤膜，得到待测样品溶液，供液相色谱分析。

2 标准工作液准备

黄曲霉毒素B₁标准储备液，10 mg/L；赭曲霉毒素A标准储备液，10 mg/L；玉米赤霉烯酮标准储备液，50 mg/L；桔霉素标准储备液：50 mg/L。避光贮存于-18℃以下冰箱中。

取适量四种标准储备液至10 mL容量瓶中，加乙腈（分析纯）稀释至刻度，现配现用，标准溶液浓度见下表，浓度：mg/L。

3 色谱分析，标准工作液和待测样品溶液在设定的液相色谱条件下进样，即将标准工作液和待测样品溶液注入高效液相色谱仪分离，并采用荧光检测器检测。

所述液相色谱条件为：

。

上述实施例中，所述荧光检测器为四通道荧光检测器时，设定的四种真菌毒素的四通道荧光检测器的参数为：

。

上述实施例中，所述荧光检测器为单通道荧光检测器时，设定的四种真菌毒素的单通道荧光检测器的程序时间波长参数为：

。

绘制标准曲线，向基线平稳的液相色谱分析仪连续注入各浓度混合标准工作溶液，浓度由高到低，以峰面积-浓度建立工作曲线。

注入待测样品溶液，各待测物的峰面积响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。将待测样品和黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的混合标样图谱对比，以保留时间定性，色谱峰面积定量，如图1-4。

以下是对本发明方法进行的评价。

方法评价指标包括以下方面：方法检测限，检测下限，精密度和加标回收率等。

一、方法检出限、检测下限的确定

以产生仪器信噪比2~5倍响应值所对应浓度（含量）的样品进行重复7次平行测定，计算测定结果的标准偏差，按照公式（1）计算方法检出限，并以 4 倍方法检出限作为方法的测定下限。

MDL=t _(n-1,0.99)×S ………………………… （1）

式中：MDL——方法检出限；

n——样品平行测定的次数；

t——自由度为n-1，置信度为99%时的t分布（单侧）；

S——n次平行测定的标准偏差。

其中，当自由度为n-1，置信度为99%时的t值可参考下表。

如果样品的浓度（含量）超过计算出的方法检出限10倍，或者样品浓度（含量）低于计算出的方法检出限，则都需要调整样品浓度重新进行测定。

配制含一定浓度的AFB₁、CIT、OTA和ZEN谷物样品，平行测定7次，检出限和检出下限结果见下表。

二、方法精密度的确定

配制含不同浓度AFB₁、CIT、OTA和ZEN的样品做精密度测定，各个平行做6次，结果见下表。

三、加标回收结果

按照下表，单位：μg/kg，分别在谷物样品中添加三个水平的AFB₁、CIT、OTA和ZEN标准品，

。

按照标准方法的分析步骤进行回收实验，平行测定，计算其相对误差和相对误差的最终值，见下表，单位：%。

综上所述，本方法中黄曲霉毒素B1的检出限为1.08 μg/kg，检出下限为3.25 μg/kg；桔霉素的检出限为6.52 μg/kg，检出下限为19.56 μg/kg；赭曲霉毒素A的检出限为3.00 μg/kg，检出下限为9.01 μg/kg；玉米赤霉烯酮的检出限为35.84 μg/kg，检出下限为107.53 μg/kg。

本方法中黄曲霉毒素B₁在各浓度水平下相对标准偏差为≤ 6.8 %；桔霉素在各浓度水平下相对标准偏差为≤ 12.31 %；赭曲霉毒素A在各浓度水平下相对标准偏差为≤ 8.95 %；玉米赤霉烯酮在各浓度水平下相对标准偏差为≤ 6.36 %。

本方法中黄曲霉毒素B₁在各浓度水平下回收率均在79.97 % ~ 96.29 %范围之内；本方法中桔霉素在各浓度水平下回收率均在68.55 % ~ 79.74 %范围之内；本方法中赭曲霉毒素A在各浓度水平下回收率均在102.24% ~ 113.40 %范围之内；本方法中玉米赤霉烯酮在各浓度水平下回收率均在81.63 % ~ 94.49 %范围之内。

由于谷物的基质比较复杂，必须严格按照该色谱条件进行操作，特别是提取液、提取步骤、流动相的配比和pH值是能否对谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素进行分离，定性或定量分析的关键所在。

本发明参照附图和实施例进行说明，但保护范围不限于此，在本发明技术范围内具有普通技术人员可以经过简单的变化，而获得本发明相同的技术效果，同样在本发明的保护范围内。

本发明提供的检测方法主要是通过通用型提取液和净化液，获得样品中的真菌毒素目标物，在经过高分辨率的高相液相色谱分离后，在荧光检测器条件下，实现了多种真菌毒素的联合检测。较之现有的薄层色谱法和酶联免疫吸附法，具有检测灵敏度高、准确度高，检测效率高、环境污染小的优点，可满足我国对谷物对真菌毒素的限量要求，为保证谷物的安全性提供了技术保障，对谷物中真菌毒素污染水平的检测具有重要的应用价值，具有较好的经济效益和社会效益。

Claims

1.同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（1）谷物样品中待测毒素提取液的制备

（1-1）准确称取5 g磨碎的谷物样品，精确至0.01 g，置于50 mL 具盖离心管A中，加入15 mL通用型提取液，剧烈振荡1 min，然后于摇床上以60 r/min振摇20 min，接着加入20 mL乙腈，60 r/min振摇10 min后，加入3 g 无水硫酸镁和2 g氯化钠作为复合盐析试剂，迅速并剧烈振荡1 min，以3500 r/min离心10 min，取出上层溶液至100 mL磨口烧瓶B中，待用；

（1-2）往离心管A中再加入15 mL乙腈，经过剧烈振荡1 min后，以3500 r/min离心10 min，取出上层溶液，并与步骤（1-1）中取出的提取液合并于烧瓶B中，于40℃下减压浓缩近干；

（2）提取液净化

（3）测定

2.根据权利要求1所述的同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法，其特征在于：步骤（1-1）中所述通用型提取液为12 mL冰乙酸以蒸馏水定容至100 mL制成。

3.根据权利要求1所述的同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法，其特征在于：步骤（2）中所述酸性乙腈为乙酸和乙腈按照体积比1:9混合制成。

4.根据权利要求1所述的同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法，其特征在于步骤（3）中所述液相色谱条件为：

。

5.根据权利要求1所述的同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法，其特征在于步骤（3）中所述荧光检测器为四通道荧光检测器，设定的四种真菌毒素的四通道荧光检测器的参数为：

。

6.根据权利要求1所述的同时检测谷物中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色谱-荧光法，其特征在于步骤（3）中所述荧光检测器为单通道荧光检测器，设定的四种真菌毒素的单通道荧光检测器的程序时间波长参数为：

。