CN108181397A - 杭椒辣椒素浓缩提取测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杭椒辣椒素浓缩提取测定法,包括如下步骤:将新鲜辣椒真空冷冻干燥后磨粉,然后采用甲醇‑四氢呋喃溶液进行提取,提取所得的上清液进行浓缩,得浓缩液;将辣椒素和二氢辣椒素的标准品用高效液相色谱‑紫外检测器进行分析,从而获得辣椒素的浓度与色谱峰面积的对应关系以及二氢辣椒素的浓度与色谱峰面积的对应关系;将浓缩液用高效液相色谱‑紫外检测器进行分析,分析条件同上,从而最终获得待测样品中辣椒素和二氢辣椒素的浓度。本方法采用冷冻干燥技术去除鲜辣椒中水分并最大程度保留其活性物质,较其他干燥方法辣椒素的损失减少;同时解决了大批量测定分析时,鲜辣椒无法长期保存的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种辣椒素及二氢辣椒素的提取和测定方法,尤其是对低辣度杭椒中辣椒素含量较低、样品量有限情况下的辣椒素及二氢辣椒素的准确定量。
背景技术
辣椒是世界上重要的蔬菜之一,也是深受喜爱的一种调味品。辣椒营养价值高,具有多种有效成分。其中,主要引起辛辣味的是存在于辣椒中的五类辣椒素类化合物,被统称为类辣椒素。在这5种类辣椒素化合物中,辣椒素和二氢辣椒素占总量的90%左右,也提供了90%左右的辣感和热感。辣椒素亦是一种抗氧化物质,并能加速脂肪代谢。因此,辣椒和二氢辣椒素是辣椒最重要的品质指标之一,它们的提取和测定具有重要的价值和意义。
目前,辣椒素的提取方法主要有溶剂提取法、超临界CO2提取法、超声波提取法、微波提取法、酶法提取等,其中溶剂提取法是国内最常见的提取方法之一。CN 102516802A山东凯斯达机械制造有限公司的“萃取辣椒红色素及辣椒素的方法”用得就是正己烷和丙酮混合剂进行萃取;超临界CO2提取法和微波提取法效果虽好但需要昂贵的设备,如CN101735092A浙江中味酿造有限公司“一种利用超临界CO2流体从黄樱椒中萃取出辣椒素的方法”用的就是超临界CO2提取法。此外,传统辣椒素提取技术采用烘干样品,或者直接使用鲜样进行提取,过程中操作复杂,辣椒素损失较大。
面对样品量少、辣椒素含量过低的样品(如杭椒)提取时,常常无法使用传统提取方法获得准确数据,还存在提取过程中溶剂损耗较多,提取操作繁琐,费时费力等问题。在辣椒素检测中,常用的方法包括比色法、分光光度法和各种色谱法等。CN 102313708A北京市农林科学院“辣椒素的定量检测方法”和CN102313710A“二氢辣椒素的定量检测方法”使用近红外光谱仪采样后与化学检测方法建立联结;农业部发布的农业行业标准(NYT1381-2007)等方法采用液相色谱结合荧光检测器的方法,这些检测仪器相对来说都不如紫外检测器普遍,很多时候需要专门购买相关仪器才能进行检测分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结合冷冻干燥技术,浓缩提取和高效液相色谱-紫外检测器分析技术检测杭椒等低辣度辣椒样品中辣椒素和二氢辣椒素含量的方法。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种杭椒辣椒素浓缩提取测定法,包括如下步骤:
1)、干燥:
以新鲜辣椒作为待测样品,将待测样品用液氮处理15~30秒后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,直至含水率≤0.5%;
2)、磨粉:
将步骤1)冷冻干燥后辣椒粉碎至过50目筛;
3)、提取:
按照1g/2~10ml的料液比,在步骤2)所得的辣椒冻干粉末中加入甲醇-四氢呋喃溶液,用超声波仪提取5~30分钟后离心;分别得上清液和沉淀;
所述甲醇-四氢呋喃溶液由甲醇、四氢呋喃按照1:1的体积比混合而得;
4)、浓缩:
于60±0.5℃恒温水浴中,将步骤3)所得的上清液浓缩至原体积五分之一,得浓缩液;
5)、将辣椒素和二氢辣椒素的标准品(混标)用高效液相色谱-紫外检测器进行分析,从而获得辣椒素的浓度与色谱峰面积的对应关系以及二氢辣椒素的浓度与色谱峰面积的对应关系(线性系数R2≥0.9999;回收率97.73~100.47%、97.75~101.83%);
6)、将步骤4)所得的浓缩液用高效液相色谱-紫外检测器进行分析,分析条件同步骤5);从而获得待测样品中辣椒素和二氢辣椒素的色谱峰面积;
将上述色谱峰面积导入步骤5)所得的对应关系中,从而获得待测样品中辣椒素和二氢辣椒素的浓度。
作为本发明的杭椒辣椒素浓缩提取测定法的改进:
所述步骤5)和步骤6)中的高效液相色谱-紫外检测器分析条件均为:
色谱柱:Hypersil ODS2 250×4.0mm,5μm;
流动相:80%甲醇;
流速:0.8ml/min;
紫外波长:280nm;
柱温:30℃;
进样量:10μl。
作为本发明的杭椒辣椒素浓缩提取测定法的进一步改进:
所述步骤3)所得的沉淀替代辣椒冻干粉末,重复进行步骤3)所述的提取2~4次;
将所有的提取液合并后进行后续的步骤)。
作为本发明的杭椒辣椒素浓缩提取测定法的进一步改进:
真空冷冻干燥机的真空度为0.57~0.62mpa;冷冻温度为-60~-55℃,冷冻干燥时间为≥72小时。
作为本发明的杭椒辣椒素浓缩提取测定法的进一步改进:
步骤2)所得的辣椒冻干粉于-20℃保存。
作为本发明的杭椒辣椒素浓缩提取测定法的进一步改进:
所述步骤4)中,上清液浓缩后过0.45μm滤膜,得浓缩液。
作为本发明的杭椒辣椒素浓缩提取测定法的进一步改进:
所述步骤3)的提取中,在30~40分钟内分三次在步骤2)所得的辣椒冻干粉末中加入甲醇-四氢呋喃溶液。
本发明主要涉及样品干燥、提取和测定这三大步骤。
本发明的有益效果主要体现在:
1、本方法采用冷冻干燥技术去除鲜辣椒中水分并最大程度保留其活性物质,较其他干燥方法辣椒素的损失减少;同时解决了大批量测定分析时,鲜辣椒无法长期保存的问题。
2、提取过程中采用浓缩提取方法,解决了样品量少,样品辣椒素含量过低时无法进行准确测定的难题。
3、检测采用反相高效液相色谱结合DAD紫外检测器,采用C18反相色谱柱,用80%甲醇为流动相,检测波长经波谱扫描后确定,能准确测得样品辣椒素浓度。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为辣椒素和二氢辣椒素HPLC色谱图。
图2是分别采用60%、80%和100%甲醇作为流动相时的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
1仪器与设备
真空冷冻干燥机、样品粉碎机、通风柜、超声波仪、高效液相色谱仪、万分之一电子天平、高速离心机。
2实验试剂与器材
试剂:主要包括甲醇(色谱纯)、四氢呋喃(色谱纯)、辣椒素标品(97.5%)和二氢辣椒素标品(98.9%)。提取剂为甲醇与四氢呋喃(1:1)混合液。
器材:250ml量筒、500ml广口瓶、2L广口瓶、10ml容量瓶、10ml离心管、10ml玻璃试管、2ml针筒、2ml进样瓶、0.45μm有机溶剂过滤膜。
实施例1、杭椒辣椒素浓缩提取测定法,依次进行如下步骤:
1)、干燥:
以新鲜辣椒作为待测样品,将待测样品用液氮处理(处理方式为将鲜辣椒对半剖开,放入塑料网袋,浸没于液氮中预冻)15~30秒后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥至含水率≤0.5%;真空度为0.57mpa~0.62mpa;冷冻温度为-60~-55℃,冷冻干燥时间约为72小时以上;
2)、磨粉:
将步骤1)冷冻干燥后辣椒用样品粉碎机粉碎至过50目筛;装入自封袋中,低温保存备用(-20℃)。
3)、提取:
①、按照1g/2ml的料液比,称取2g步骤2)所得的辣椒冻干粉末置于10ml离心管中,加入4ml甲醇-四氢呋喃溶液,振荡混匀,于超声波仪(超声波参数为40KHZ)中超声提取20min后放入高速离心机中10000rpm离心10min,取上清液于10ml容量瓶中;
所述甲醇-四氢呋喃溶液由甲醇、四氢呋喃按照1:1的体积比混合而得;
②、向步骤①离心所得的位于10ml离心管中的沉淀再加入3ml甲醇-四氢呋喃溶液,振荡混匀后超声提取5min,放入高速离心机中10000rpm离心10min,取上清液于上述10ml容量瓶中。此步骤再重复一次1次。
即,将3次提取所得的上清液合并至10ml容量瓶,随后用甲醇-四氢呋喃溶液定容至10ml作为提取液。
4)、浓缩:
取5ml步骤3)所得的提取液于10ml玻璃试管,在通风橱内60℃水浴蒸发至为1ml,0.45μm滤膜过滤后,用高效液相色谱进行分析。
滤膜过滤杂质,不影响体积。
5)、将辣椒素和二氢辣椒素的标准品用高效液相色谱-紫外检测器进行分析,从而分别获得辣椒素的浓度与色谱峰面积的对应关系以及二氢辣椒素的浓度与色谱峰面积的对应关系;
具体如下:
①、标准样品溶液的制备
对辣椒素和二氢辣椒素分别进行如下处理:
分别称取10mg,用甲醇溶解后定容至10ml,制成辣椒素和二氢辣椒素浓度均为1mg/ml的标准母液。随后依次稀释获得0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml浓度梯度的标准溶液。
②、色谱分析条件
色谱柱:Hypersil ODS2 250×4.0mm,5μm;
流动相:80%甲醇;
流速:0.8ml/min;
紫外波长:280nm;
柱温:30℃;
进样量:10μl。
所得结果如图1所述。
在一定范围内,辣椒素/二氢辣椒素的色谱峰面积和溶液浓度呈线性关系。因此,分别以标准辣椒素、二氢辣椒素溶液浓度(mg/ml)为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制获得辣椒素和二氢辣椒素的标准曲线(y=ax+b)。
辣椒素浓度与色谱峰面积的关系公式为提取液辣椒素浓度(mg/ml)=(A1-b1)/a1;
二氢辣椒素浓度与色谱峰面积的关系公式为:提取液二氢辣椒素浓度(mg/ml)=(相应色谱峰面积A2-b2)/a2;
上述A1代表辣椒素对应色谱峰面积;a1和b1为标准曲线线性回归方程系数,在对各批次样品进行分析测定时,由标准溶液进样后得到的色谱数据与浓度进行计算获得;
上述A2代表二氢辣椒素对应色谱峰面积;a2和b2为标准曲线线性回归方程系数,在对各批次样品进行分析测定时,由标准溶液进样后得到的色谱数据与浓度进行计算获得;
6)、将浓缩液用高效液相色谱-紫外检测器进行分析,分析条件同步骤5);从而获得待测样品中辣椒素和二氢辣椒素的色谱峰面积;
将上述色谱峰面积导入步骤5)所得的对应关系中,从而获得待测样品中辣椒素和二氢辣椒素的浓度。
具体如下:取步骤4)所得的10μl浓缩液按照步骤5)的②告知的色谱分析条件进行检测,获得浓缩液中辣椒素和二氢辣椒素的浓度,最终经换算获得待测样品中辣椒素和二氢辣椒素的浓度。
换算关系为:
样品中辣椒素浓度(mg/g干重)=提取液辣椒素浓度(mg/ml)×提取液体积(mL)/样品重(g)。
样品中二氢辣椒素浓度(mg/g干重)=提取液氢辣椒素浓度(mg/ml)×提取液体积(mL)/样品重(g)。
以下实验中,样品A为杭椒(3#)、样品B为杭椒(2#),样品C为永黄-17、样品D为750-25-1;均来自杭州市农科院;2#和3#表示不同杭椒品种,相对高辣和低辣品种。
对比例1、将实施例1的步骤1)的干燥改成于常规的“于60℃烘干至含水率≤0.5%”,其余等同于实施例1。
实验一、取3种辣椒样品分别按照实施例1和对比例1进行检测:
每种样品重复3次,最后取其平均值。
实施例1的数据获得过程以样品A举例如下表1-1:
表1-1
浓缩液所得的色谱峰面积 | 样品中辣椒素浓度(mg/g干重) | |
重复Ⅰ | 424.3 | 0.04372 |
重复Ⅱ | 418.1 | 0.04304 |
重复Ⅲ | 421.6 | 0.04342 |
最终所得的结果如下表1-2:
表1-2
不同字母表示达到显著性差异,其中小写字母指0.05水平显著,大写字母指0.01水平显著。
对比例2、取消实施例1步骤4)的浓缩,即,直接以提取液进行高效液相色谱-紫外检测器进行分析;其余等同于实施例1。
实验二、浓缩处理对结果的影响:
取4种辣椒样品分别按照实施例1和对比例2进行检测,所得结果见表2:
表2
不同字母表示达到显著性差异,其中小写字母指0.05水平显著,大写字母指0.01水平显著
根据该对比例2待测样品B~待测样品D可得知:浓缩处理后测得的辣椒素和二氢辣椒素浓度值没有明显区别。因此本发明的浓缩步骤不会对实际结果产生显著影响。
但是对于辣椒素和二氢辣椒素浓度低的杭椒而言,不进行浓缩,根本无法获得检测数据。
对比例3、将实施例1中的流动相由80%甲醇分别改成60%甲醇、100%甲醇;其余等同于实施例1;
当为60%甲醇时:
辣椒素的标准曲线为y=9254.1x+29.991(R2=0.9995)
二氢辣椒素的标准曲线为y=11033x+38.913(R2=0.9991)
当为80%甲醇时:
辣椒素的标准曲线为y=9188.9x+22.619(R2=0.9999)
二氢辣椒素的标准曲线为y=10783x+32.789(R2=0.9999)
当为100%甲醇时:辣椒素和二氢辣椒素的色谱峰无法分离。
实验三、不同比例流动相对色谱检测的影响:
取样品A分别按照实施例1和对比例3进行检测,HPLC色谱图对比如图2所述,所得结果见表3:
表3
不同字母表示达到显著性差异,其中小写字母指0.05水平显著,大写字母指0.01水平显著。
根据实验三,可得知:分别采用60%、80%和100%甲醇作为流动相对样品中辣椒素和二氢辣椒素含量进行分析测定,结果可见不管从色谱分离效果高还是含量结果80%甲醇均为最优选择。
实验四、通过加标回收实验确定方法的准确性:
该回收实验具体为:称取已知辣椒素含量为0.07mg/g的杭椒(3#)冻干样2g,加入1mg/ml辣椒素标准溶液150ul后按照实例1进行提取,重复5次。同时称取3份2g相同de杭椒冻干样用作平行分析,最终获得样品含量平均值为0.06475mg/g。加标回收率(%)=(加标试样测定值-试样测定值)×100/加标量
表4、辣椒素回收率
该回收实验具体为:称取已知辣椒素含量为0.06mg/g的750-25-1冻干样2g,加入1mg/ml辣椒素标准溶液120ul后按照实例1进行提取,重复5次。同时称取3份2g相同的750-25-1冻干样用作平行分析,最终获得样品含量平均值为0.0677mg/g。加标回收率(%)=(加标试样测定值-试样测定值)×100/加标量。
表5、二氢辣椒素回收率
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.杭椒辣椒素浓缩提取测定法,其特征是包括如下步骤:
1)、干燥:
以新鲜辣椒作为待测样品,将待测样品用液氮处理15~30秒后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,直至含水率≤0.5%;
2)、磨粉:
将步骤1)冷冻干燥后辣椒粉碎至过50目筛;
3)、提取:
按照1g/2~10ml的料液比,在步骤2)所得的辣椒冻干粉末中加入甲醇-四氢呋喃溶液,用超声波仪提取5~30分钟后离心;分别得上清液和沉淀;
所述甲醇-四氢呋喃溶液由甲醇、四氢呋喃按照1:1的体积比混合而得;
4)、浓缩:
于60±0.5℃恒温水浴中,将步骤3)所得的上清液浓缩至原体积五分之一,得浓缩液;
5)、将辣椒素和二氢辣椒素的标准品用高效液相色谱-紫外检测器进行分析,从而获得辣椒素的浓度与色谱峰面积的对应关系以及二氢辣椒素的浓度与色谱峰面积的对应关系;
6)、将步骤4)所得的浓缩液用高效液相色谱-紫外检测器进行分析,分析条件同步骤5);从而获得待测样品中辣椒素和二氢辣椒素的色谱峰面积;
将上述色谱峰面积导入步骤5)所得的对应关系中,从而获得待测样品中辣椒素和二氢辣椒素的浓度。
2.根据权利要求1所述的杭椒辣椒素浓缩提取测定法,其特征是:
所述步骤5)和步骤6)中的高效液相色谱-紫外检测器分析条件均为:
色谱柱:Hypersil ODS2 250×4.0mm,5μm;
流动相:80%甲醇;
流速:0.8ml/min;
紫外波长:280nm;
柱温:30℃;
进样量:10μl。
3.根据权利要求2所述的杭椒辣椒素浓缩提取测定法,其特征是:
所述步骤3)所得的沉淀替代辣椒冻干粉末,重复进行步骤3)所述的提取2~4次;
将所有的提取液合并后进行后续的步骤)。
4.根据权利要求2或3所述的杭椒辣椒素浓缩提取测定法,其特征是:
真空冷冻干燥机的真空度为0.57~0.62mpa;冷冻温度为-60~-55℃,冷冻干燥时间为≥72小时。
5.根据权利要求2或3所述的杭椒辣椒素浓缩提取测定法,其特征是:
步骤2)所得的辣椒冻干粉于-20℃保存。
6.根据权利要求2或3所述的杭椒辣椒素浓缩提取测定法,其特征是:
所述步骤4)中,上清液浓缩后过0.45μm滤膜,得浓缩液。
7.根据权利要求2或3所述的杭椒辣椒素浓缩提取测定法,其特征是:
所述步骤3)的提取中,在30~40分钟内分三次在步骤2)所得的辣椒冻干粉末中加入甲醇-四氢呋喃溶液。
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