CN109374815B - 一种治疗咳喘胸满药物组合的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗咳喘胸满药物组合物的质量检测方法，所述药物组合由松塔、棉花根、枇杷叶组成，所述质量检测方法包括：对活性成分松塔、棉花根、枇杷叶的鉴别，棉花根中游离棉酚的残留量测定。游离棉酚是一种多酚羟基双萘醛类化合物，是毒性物质，可造成人体红肿出血、神经失常、食欲不振、体重减轻、影响生育力。本发明在原有质量标准的基础上，对鉴别方法进行优化，同时增加枇杷叶的鉴别，以及棉花根中游离棉酚的残留量测定，使得治疗咳喘胸满药物组合的质量监控水平有了很大的提高，本质量检测方法准确度高，稳定性好，可以有效用于治疗咳喘胸满药物组合的质量检测，完善质量标准。
Description
技术领域
本发明涉及医药发明领域，具体涉及一种治疗咳喘胸满药物组合的质量检测方法。
背景技术
本品由由松塔、棉花根、枇杷叶组成；其中：松塔有祛痰，止咳，平喘，慢性气管炎，哮喘，咳嗽痰多等功效。棉花根具有止咳、祛痰、平喘作用，但棉花根中可能残留一种毒性物质游离棉酚，游离棉酚是一种多酚羟基双萘醛类化合物，可造成人体红肿出血、神经失常、食欲不振、体重减轻、影响生育力。枇杷叶，有清肺止咳，和胃利尿，止渴的功效。有治疗肺热痰嗽，咳血，衄血，胃热呕哕作用。
国家药品监督管理局国家药品标准WS3-B-1581-93中公开了松塔和棉花根鉴别方法为取本品内容物5g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇20ml，水浴加热回流30min，滤过，滤液置水浴蒸干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。
另分别取棉花根对照药材1.5g，松塔对照药材2.0g，各加水40ml，煮沸30min，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同一个或一个以上相同颜色的荧光斑点。然而，该方法在实际操作中，以该方法制备所述药物组合的供试品溶液并检测存在加热回流时间长，导致有效成分分解，目标斑点模糊，等问题，影响了所述药物组合的生产与质量检测。
国家药品监督管理局国家药品标准WS3-B-1581-93，缺少对有效成分枇杷叶的质量检验，难以对整个药品的质量进行有效控制，为了更好的检测枇杷叶质量，本发明增加了枇杷叶的鉴别项目。同时，为了避免残留游离棉酚对整个药品质量的影响，危害患者身体健康，本发明增加了棉花根中游离棉酚残留量的检测。
发明内容
本发明的目的是克服现有检测方法中：
1)鉴别项目在供试品溶液制备时蒸干时间长，目标斑点模糊；
2)缺少对有效成分枇杷叶的鉴别；
3)缺少对棉花根中残留棉酚的检验；
提供一种治疗咳喘胸满药物组合的质量检测方法，在大量的实验中，探索出一种有效缩短加热回流的时间和缩短蒸干时间的方法，同时增加对所述药物中枇杷叶的鉴别，增加对所述药物中残留游离棉酚的检测，使所述药物组合的质量检测方法更科学完善，药品质量得到更好的控制。
本发明提供一种治疗咳喘胸满药物组合的质量检测方法，所述药物组合由松塔、棉花根、枇杷叶组成，其特征在于所述质量检测方法为：对松塔、棉花根、枇杷叶的鉴别，对棉花根中游离棉酚的残留量测定
所述棉花根和松塔鉴别方法为：取所述药物4～6g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇15～25ml使溶解，水浴加热回流30～40min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；分别取棉花根对照药材1.3～1.7g，松塔对照药材1.5～2.5g，各加水30～50ml，煮沸25～35分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同一个或一个以上相同颜色的荧光斑点。
优选的，所述棉花根和松塔鉴别方法为：取所述药物4.5～5.5g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇18～22ml使溶解，水浴加热回流30～40min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；分别取棉花根对照药材1.4～1.6g，松塔对照药材1.7～2.2g，加水35～45ml，煮沸28～32分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同一个或一个以上相同颜色的荧光斑点。
进一步优选的，所述棉花根和松塔鉴别方法为：取所述药物4.8～5.2g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇20ml使溶解，水浴加热回流30～40min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；分别取棉花根对照药材1.5g，松塔对照药材2.0g，加水30ml，煮沸30分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同一个或一个以上相同颜色的荧光斑点。
更进一步优选的，所述棉花根和松塔鉴别方法为：取所述药物5g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇20ml使溶解，水浴加热回流40min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；分别取棉花根对照药材1.5g，松塔对照药材2.0g，加水30ml，煮沸30分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同一个或一个以上相同颜色的荧光斑点。
枇杷叶的鉴别方法为：取所述药物4.5～5.5g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次10～20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.0～2.0cm，长6～10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水40～60ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1.5～2.5g，加水90～110ml，煎煮30～60分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次10～20ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.0～2.0cm，长6～10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水40～60ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以4～6：1.6～2.4的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以15～25％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
优选的，所述枇杷叶的鉴别方法为：取所述药物4.8～5.2g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次13～17ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.4～1.6cm，长7～9cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水45～55ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1.8～2.2g，加水95～105ml，煎煮30～40分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次14～16ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.4～1.6cm，长7～9cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水45～55ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以5：2的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以15～25％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
进一步优选的，所述枇杷叶的鉴别方法为：取所述药物5.0g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.5cm，长8cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材2.0g，加水100ml，煎煮30～40分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.5cm，长8cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以5：2的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以20％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
其检查方法为：照粒度和粒度分布测定法即通则0982第二法双筛分法测定，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15％；照水分测定法即通则0832测定，水分不得超过8.0％；照干燥失重测定法即通则0831测定，于80℃干燥至恒重，减失重量不得超过2.0％；照下述方法检查，溶化性应符合规定，取本药物1袋，加70～80℃水200ml，搅拌5分钟，立即观察，可溶颗粒应全部溶化或轻微浑浊，不得有异物，不得有焦屑；取本药物10袋，除去包装，分别精密称定每袋内容物的重量，求出每袋内容物的装量与平均装量。每袋装量与标示装量比较，超出装量差异限度的颗粒剂不得多于2袋，并不得有1袋超出装量差异限度1倍，平均装量或标示装量装量差异限度士5％；照非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法即通则1105和控制菌检查法即通则1106及非无菌药品微生物限度标准即通则1107检查，应符合规定。
棉花根中游离棉酚的测定方法为：色谱条件与系统适用性实验：色谱柱Sepaxsapphire C18，柱温25℃；以乙腈为流动相A,10mmol/LKH2PO4为流动相B梯度洗脱，梯度洗脱的程序为0～4min流动相B的体积分数为50％，4～6min流动相B的体积分数由50％下降至38％，6～10min流动相B的体积分数下降至30％，10～35min，流动相B的体积分数下降至0％；35min～38min流动相B的体积分数上升至50，38min～50min流动相B的体积分数维持50％；检测器为紫外检测器；检测波长：238nm；流速1mL/min；取所述药物4.8～5.2g，加丙酮20ml，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心5min，上清液经微孔滤膜过滤,25℃氮气吹干，以比例为1∶1的乙腈～10mmol/LKH2PO45ml混合溶液溶解，即得；精密称取游离棉酚对照品，用色谱纯乙腈配制成质量浓度为101.3μg/mL的游离棉酚标准储备液，再精密量取2ml，置于100ml的量瓶中，用乙腈稀释成2.02μg/ml溶液，摇匀即得；精密吸取对照品与供试品液各10ul，注入液相色谱仪测定，即得。
根据权利要求1所述的治疗咳喘胸满药物组合，所述治疗咳喘胸满药物组合为咳宁颗粒、咳宁糖浆或以其活性成分棉花根、松塔、枇杷叶为原料制成的其他药物组合制剂。
注：本发明所述的通则指2015年版中国药典第四部通则。
本发明具有以下优点：
1.在薄层色谱鉴别实验中，加热回流和蒸干这两个环节最耗时间，本发明在蒸干环节使用蒸干环境为排空气的负压环境，该环境仅使用市售负压风扇就能达到，大大缩短蒸干时间，该技术不但降低时间成本，还减少样品溶液受热时间，从而保护目标活性成分，使目标成分不易被分解，色谱中目标斑点更清晰，实验效果更佳。
2.国家药品监督管理局国家药品标准WS3-B-1581-93，缺少对有效成分枇杷叶的质量检验，难以对整个药品的质量进行有效控制，为了更好的检测枇杷叶质量，本发明增加了枇杷叶的鉴别项目。同时，为了避免残留游离棉酚对整个药品质量的影响，危害患者身体健康，本发明增加了棉花根中游离棉酚残留量的检测。使所述药物组合的质量检测方法更科学完善，药品质量得到更好的控制。
3、经方法学验证试验，结果表明本方法在不同薄层板、温度、湿度条件下，色谱图斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，不同条件下均能得到较好的鉴别色谱,验证试验表明重现性好、耐用性好。
4、按本发明检测方法学验证:游离棉酚在10.1～1013μg范围内线性关系良好,回归方程为：Y＝4.0054X-3.4712，相关系数R2＝0.9999；重复性试验中游离棉酚的含量，平均含量为0.5658mg/kg，RSD值9.2342％(n＝6)，表明此游离棉酚的测定方法具有良好的重复性；加样回收率为91.76％，RSD％为0.61％,所以该方法符合药品质量标准分析方法验证要求,十批样品检测结果平均值为0.662mg/kg。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
【性状】本品为颗粒剂，内容物为浅棕色颗粒；味甜，微涩。
【鉴别】取所述药物4g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇15～25ml使溶解，水浴加热回流30min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；
分别取棉花根对照药材1.3g，松塔对照药材1.5g，各加水30ml，煮沸25分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；取上述三种溶液各5μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同一个或一个以上相同颜色的荧光斑点。
取所述药物4.5g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.0cm，长6cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水40ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1.5g，加水90ml，煎煮30分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.0cm，长6cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水40ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以4：1.6的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以15％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】粒度和粒度分布不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15％；(通则0982第二法双筛分法)
干燥失重不得超过2.0％(通则0831)
装量差异不得过5.0％(通则0942)
溶化性应取本药物1袋，加70℃水200ml，搅拌5分钟，立即观察，可溶颗粒应全部溶化或轻微浑浊，不得有异物，不得有焦屑；(通则0921)
微生物限度应符规定(通则1105)(通则1106)(通则1107)
【含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验色谱柱Sepax sapphire C18，柱温25℃；以乙腈为流动相A,10mmol/LKH2PO4为流动相B梯度洗脱，梯度洗脱的程序为0～4min流动相B的体积分数为50％，4～6min流动相B的体积分数由50％下降至38％，6～10min流动相B的体积分数下降至30％，10～35min，流动相B的体积分数下降至0％；35min～38min流动相B的体积分数上升至50，38min～50min流动相B的体积分数维持50％；检测器为紫外检测器；检测波长：238nm；流速1mL/min；
对照品溶液的制备精密称取游离棉酚对照品，用色谱纯乙腈配制成质量浓度为101.3μg/mL的游离棉酚标准储备液，再精密量取2ml，置于100ml的量瓶中，用乙腈稀释成2.02μg/ml溶液，摇匀即得；
供试品溶液的制备取所述药物4.8g，加丙酮20ml，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心5min，上清液经微孔滤膜过滤,25℃氮气吹干，以比例为1∶1的乙腈～10mmol/LKH2PO45ml混合溶液溶解，即得；
测定法精密吸取对照品与供试品液各10ul，注入液相色谱仪测定，即得。
实施例2
【性状】本品为颗粒剂，内容物为浅棕色颗粒；味甜，微涩。
【鉴别】取所述药物5g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇15ml使溶解，水浴加热回流35min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；
分别取棉花根对照药材1.4g，松塔对照药材1.5g，各加水35ml，煮沸25分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；取上述三种溶液各5μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同一个或一个以上相同颜色的荧光斑点。
取所述药物4.5g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.0cm，长6cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水40ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1.5g，加水90ml，煎煮35分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.0cm，长6cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水40ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以4：1.6的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以15％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】粒度和粒度分布不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15％；(通则0982第二法双筛分法)
干燥失重不得超过2.0％(通则0831)
装量差异不得过5.0％(通则0942)
溶化性应取本药物1袋，加75℃水200ml，搅拌5分钟，立即观察，可溶颗粒应全部溶化或轻微浑浊，不得有异物，不得有焦屑；(通则0921)
微生物限度应符规定(通则1105)(通则1106)(通则1107)
【含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验色谱柱Sepax sapphire C18，柱温25℃；以乙腈为流动相A,10mmol/LKH2PO4为流动相B梯度洗脱，梯度洗脱的程序为0～4min流动相B的体积分数为50％，4～6min流动相B的体积分数由50％下降至38％，6～10min流动相B的体积分数下降至30％，10～35min，流动相B的体积分数下降至0％；35min～38min流动相B的体积分数上升至50，38min～50min流动相B的体积分数维持50％；检测器为紫外检测器；检测波长：238nm；流速1mL/min；
对照品溶液的制备精密称取游离棉酚对照品，用色谱纯乙腈配制成质量浓度为101.3μg/mL的游离棉酚标准储备液，再精密量取2ml，置于100ml的量瓶中，用乙腈稀释成2.02μg/ml溶液，摇匀即得；
供试品溶液的制备取所述药物4.9g，加丙酮20ml，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心5min，上清液经微孔滤膜过滤,25℃氮气吹干，以比例为1∶1的乙腈～10mmol/LKH2PO45ml混合溶液溶解，即得；
测定法精密吸取对照品与供试品液各10ul，注入液相色谱仪测定，即得。
实施例3
【性状】本品为颗粒剂，内容物为浅棕色颗粒；味甜，微涩。
【鉴别】取所述药物6g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇25ml使溶解，水浴加热回流40min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；
分别取棉花根对照药材1.7g，松塔对照药材2.5g，各加水50ml，煮沸40分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同一个或一个以上相同颜色的荧光斑点。
取所述药物5.5g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径2.0cm，长10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材2.5g，加水110ml，煎60分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径2.0cm，长10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以6：2.4的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以25％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】粒度和粒度分布不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15％；(通则0982第二法双筛分法)
干燥失重不得超过2.0％(通则0831)
装量差异不得过5.0％(通则0942)
溶化性应取本药物1袋，加70～80℃水200ml，搅拌5分钟，立即观察，可溶颗粒应全部溶化或轻微浑浊，不得有异物，不得有焦屑；(通则0921)
微生物限度应符规定(通则1105)(通则1106)(通则1107)
【含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验色谱柱Sepax sapphire C18，柱温25℃；以乙腈为流动相A,10mmol/LKH2PO4为流动相B梯度洗脱，梯度洗脱的程序为0～4min流动相B的体积分数为50％，4～6min流动相B的体积分数由50％下降至38％，6～10min流动相B的体积分数下降至30％，10～35min，流动相B的体积分数下降至0％；35min～38min流动相B的体积分数上升至50，38min～50min流动相B的体积分数维持50％；检测器为紫外检测器；检测波长：238nm；流速1mL/min；
对照品溶液的制备精密称取游离棉酚对照品，用色谱纯乙腈配制成质量浓度为101.3μg/mL的游离棉酚标准储备液，再精密量取2ml，置于100ml的量瓶中，用乙腈稀释成2.02μg/ml溶液，摇匀即得；
供试品溶液的制备取所述药物5.1g，加丙酮20ml，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心5min，上清液经微孔滤膜过滤,25℃氮气吹干，以比例为1∶1的乙腈～10mmol/LKH2PO45ml混合溶液溶解，即得；
测定法精密吸取对照品与供试品液各10ul，注入液相色谱仪测定，即得。
实施例4
【性状】本品为颗粒剂，内容物为浅棕色颗粒；味甜，微涩。
【鉴别】取所述药物5g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇20ml使溶解，水浴加热回流30min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；
分别取棉花根对照药材1.5g，松塔对照药材2.0g，各加水40ml，煮沸30分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同一个或一个以上相同颜色的荧光斑点。
取所述药物5.0g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径2.0cm，长10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材2.0g，加水100ml，煎煮30分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径2.0cm，长10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以5：2的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以20％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】粒度和粒度分布不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15％；(通则0982第二法双筛分法)
干燥失重不得超过2.0％(通则0831)
装量差异不得过5.0％(通则0942)
溶化性应取本药物1袋，加70～80℃水200ml，搅拌5分钟，立即观察，可溶颗粒应全部溶化或轻微浑浊，不得有异物，不得有焦屑；(通则0921)
微生物限度应符规定(通则1105)(通则1106)(通则1107)
【含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验色谱柱Sepax sapphire C18，柱温25℃；以乙腈为流动相A,10mmol/LKH2PO4为流动相B梯度洗脱，梯度洗脱的程序为0～4min流动相B的体积分数为50％，4～6min流动相B的体积分数由50％下降至38％，6～10min流动相B的体积分数下降至30％，10～35min，流动相B的体积分数下降至0％；35min～38min流动相B的体积分数上升至50，38min～50min流动相B的体积分数维持50％；检测器为紫外检测器；检测波长：238nm；流速1mL/min；
对照品溶液的制备精密称取游离棉酚对照品，用色谱纯乙腈配制成质量浓度为101.3μg/mL的游离棉酚标准储备液，再精密量取2ml，置于100ml的量瓶中，用乙腈稀释成2.02μg/ml溶液，摇匀即得；
供试品溶液的制备取所述药物5.2g，加丙酮20ml，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心5min，上清液经微孔滤膜过滤,25℃氮气吹干，以比例为1∶1的乙腈～10mmol/LKH2PO45ml混合溶液溶解，即得；
测定法精密吸取对照品与供试品液各10ul，注入液相色谱仪测定，即得。
实验例：为证明本发明的科学性与合现性，进行了以下方法学实验研究：
实验例1：
1材料、设备及试剂
1.1材料
咳宁颗粒样品，批号：171201、171202、171203、171204、171205、171206、171207、171208、171209、171210共10批
对照品：棉酚对照品
对照品来源：中国食品药品检定研究院
对照药材：棉花根对照药材；松塔对照药材；枇杷叶对照药材
对照药材来源：中国药品生物制品检定所
1.2设备
薄层板：青岛海洋化工厂分厂硅胶G商品板(规格：200×100mm青岛海洋化工厂分厂高效薄层板(规格：200×100mm)
数显恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司
1.3试剂
乙酸乙酯：成都市科隆化学品有限公司
乙醇：重庆川东化工(集团)有限公司
无水硫酸钠：天津市科密欧化学试剂有限公司
正丁醇：重庆川东化工(集团)有限公司
丙酮：重庆川东化工(集团)有限公司
2检测
2.1.棉花根和松塔的鉴别
2.1.1供试品溶液的制备：
方法一：取所述药物5.0g，研细，加95％ml乙醇20ml，，水浴加热回流20min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；
方法二：取所述药物5.0g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇20ml使溶解，水浴加热回流20min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；
方法三(对比例)：取本品内容物5.0g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇20ml，水浴加热回流30min，滤过，滤液置水浴蒸干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。
2.1.2对照药材溶液的制备：
方法一：分别取棉花根对照药材1.50g，松塔对照药材2.0g，置于同一大烧杯中,加水70ml，煮沸30分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；
方法二(对比例)：另分别取棉花根对照药材1.5g，松塔对照药材2.0g，各加水40ml，煮沸30min，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；
2.1.3测定结果:取上述由2.1.1方法一，方法二，方法三(对比例)处理供试品溶液及对照药材溶液2.1.2(方法一)10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，2.1.1方法一，方法二斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，且在与对2.1.2照药材溶液(方法一)色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点。2.1.1方法三(对比例)斑点暗淡，颜色浅，不清晰，Rf值适中，在与2.1.2对照药材溶液(方法一)色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点。
取上述由2.1.1方法一，方法二，方法三(对比例)处理供试品溶液及对照药材溶液2.1.2(方法二)的两种溶液10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，2.1.1方法一，方法二斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，且在与2.1.2对照药材溶液(方法一)色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点。2.1.1方法三(对比例)斑点暗淡，颜色浅，不清晰，Rf值适中，在与对照药材溶液(方法一)色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点。
取上述由对照药材溶液2.1.1方法一和方法二的两种溶液各10μl，分别点于不同高效薄层板上，2.1.1方法一以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。2.1.2方法二中两种对照药材相应的荧光斑点在方法一的图谱中都能对应找到，且显相同颜色。
结论：在处理供试品时，2.1.1方法一和方法二采用排空气的负压环境进行蒸干，缩短了蒸干时间，实验结果显示2.1.1方法一，方法二斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，且在与对照药材溶液2.1.2(方法一)色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点。2.1.1方法三(对比例)斑点暗淡，颜色浅，不清晰，Rf值适中，说明蒸干时间长对影响实验结果，本发明能有效缩短蒸干时间，在对照品处理时两种对照药材同时置于一容器处理，操作方便简化，节约时间，能达到检测效果。
2.2枇杷叶薄层鉴别
2.2.1供试品溶液的制备：
方法一：取所述药物5.0g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径2.0cm，长10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
方法二(对比例)：采用CN201210312564.X一种无糖型强力枇杷露的检测方法取所述药物5.0g，研细，加水60mL，加热回流30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液30mL洗涤，弃去洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解；
2.2.2对照药材溶液的制备：
方法一：另取枇杷叶对照药材2.0g，加水100ml，煎煮30分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径2.0cm，长10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
方法二(对比例)：采用CN201210312564.X一种无糖型强力枇杷露的检测方法取枇杷叶对照药材0.5g，加水60mL，加热回流30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液30mL洗涤，弃去洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解；
测定结果：取上述由2.2.1方法一处理供试品溶液及由2.2.2方法一处理的对照药材溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以5：2的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以20％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视。同时取上述由2.2.1方法二处理供试品溶液及由2.2.2方法二处理的对照药材溶液按CN201210312564.X一种无糖型强力枇杷露的检测方法检测。
供试品色谱中，2.2.1方法一图谱斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，且在与对照药材溶液2.2.2方法一色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点。
2.2.1方法二(对比例)斑点暗淡，颜色浅，不清晰，分离度不符合要求，在与对照药材溶液2.2.2(方法二)色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点。
结论：本发明的方法更适合咳宁颗粒中枇杷叶的鉴别。
2.2.3为了验证本发明试验方法、条件及重现性，做如下实验：
用上述方法一处理10批不同批次的样品，同时与对比例的方法进行实验比较，按规定的方法展开，结果见表1。
表1试验方法、条件及重现性试验结果
| 序号 | 批号 | 结果 |
| 1 | 171201 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 2 | 171202 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 3 | 171203 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 4 | 171204 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 5 | 171205 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 6 | 171206 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 7 | 171207 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 8 | 171208 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 9 | 171209 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 10 | 171210 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 11 | 对比例 | 斑点不明显，分离度不符合要求，重现性差 |
比较常压和排空气的负压环境环境下高效薄层板展开效果，(各10批次的样品)，结果见表2
表2试验方法、条件及重现性试验结果
| 批号 | 常压环境蒸干 | 负压环境蒸干 |
| 171201 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 171202 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 171203 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 171204 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 171205 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 171206 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 171207 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 171208 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 171209 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 171210 | 斑点不明显，分离度不符合要求 | 斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中 |
说明常压环境蒸干，消耗时间长，目标成分分解，影响实验结果，2.2.1方法一能有效缩短蒸干时间，结果图谱斑点清晰，节约时间，达到良好的检测效果。
2.2.4耐用性
2.2.4.1不同薄层板的比较
取2.2.1方法一项下的供试品溶液，比较了青岛海洋化工厂分厂硅胶G商品板和高效硅胶G商品板(各10批次的样品)，结果见表3。
表3：不同薄层板耐用性结果表
结果高效硅胶板商品板斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中；硅胶G商品板斑点清晰，分离达到要求,Rf值适中，故本方法耐用性好。
2.2.4.2不同湿度的比较
比较了低湿度(30％)和高湿度(75％)环境下高效薄层板展开效果，结果见表4。
表4：低湿度(30％)和高湿度(75％)环境下高效薄层板展开效果表
结果：斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两个条件下均能得到较好的鉴别色谱。
经上述方法学验证试验，结果表明在负压环境蒸干时间明显减少，同时斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中；不同湿度条件下，用高效薄层板和硅胶G商品板进行试验，色谱图斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，验证试验表明重现性好、耐用性好。
3.【检查】
依据《中国药典》相关内容，结合本品特性，研究制定了相应的检查项目。
3.1干燥失重不得超过2.0％
照干燥失重测定法(通则0831)测定，取供试品1.0g，置于80℃减压干燥至恒重，减失重量不得超过2.0％，结果见表5
表5干燥失重测定结果表
3.2粒度和粒度分布测定法即通则0982第二法双筛分法测定，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15％照崩解时限测定法《中国药典》2015版四部通则0982)测定。实测十个不同批次样品各1批，结果见表6
表6粒度和粒度分布结果表
3.3装量差异取本药物10袋，除去包装，分别精密称定每袋内容物的重量，求出每袋内容物的装量与平均装量。每袋装量与标示装量比较，超出装量差异限度的颗粒剂不得多于2袋，并不得有1袋超出装量差异限度1倍，平均装量或标示装量装量差异限度士5％；结果见表7
表7装量差异测定结果表
4【含量测定】
仪器与试药
高效液相色谱仪：安捷伦1260；
色谱柱：Sepax sapphire C18，
安捷伦ZORBAX SB-C18
电子天平：梅特勒托利多ME203TE，赛多利斯QUINTIX125D-1CN
乙腈：美国天地(色谱纯)
甲醇：美国天地(色谱纯)
丙酮：重庆川东化工(集团)有限公司
HS-10260D型超声波清洗机(功率250W，频率30KHZ)；
棉酚(批号111869-201122)含量以94.9％计。
水为超纯水；其它试剂为分析纯。
4.1方法一
方法来源：参照高效液相色谱法《中国药典》2015年版四部通则0512)测定的方法结合本公司的仪器设备而拟定的.
色谱条件与系统适用性试验色谱柱Sepax sapphire C18，柱温25℃；以乙腈为流动相A,10mmol/LKH2PO4为流动相B梯度洗脱，梯度洗脱的程序为0～4min流动相B的体积分数为50％，4～6min流动相B的体积分数由50％下降至38％，6～10min流动相B的体积分数下降至30％，10～35min，流动相B的体积分数下降至0％；35min～38min流动相B的体积分数上升至50，38min～50min流动相B的体积分数维持50％；检测器为紫外检测器；检测波长：238nm；流速1mL/min；
对照品制备精密称取棉酚对照品，用色谱纯乙腈配制成质量浓度为101.3μg/mL的棉酚标准储备液，再精密量取2ml，置于100ml的量瓶中，用乙腈稀释成2.02μg/ml溶液，摇匀即得；
供试品制备取所述药物5g，加丙酮20ml，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心5min，上清液经微孔滤膜过滤,25℃氮气吹干，以比例为1∶1的乙腈～10mmol/LKH2PO45ml混合溶液溶解，即得；
测定法精密吸取对照品与供试品液各10ul，注入液相色谱仪测定，即得。对棉花根中游离棉酚残留量的测定方法为参照高效液相色谱法(通则0512)测定。
4.2方法二:方法二为对比文件
方法来源：高效液相色谱法检测畜产品中的游离游离棉酚，刘冬梅，蒲明，昌吉州畜产品质量检测中心，新疆昌吉831100
色谱条件:安捷伦ZORBAX SB-C18，0.1％甲酸乙腈∶0.1％甲酸水，梯度洗脱。
对照品溶液的制备:醋酸游离棉酚标样(为Sigma-Aldrich公司提供)，标准溶液：用色谱纯乙腈配制成质量浓度为100mg/L的游离棉酚标准储备液，再分别稀释成0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L的标准工作液。
供试品溶液的制备:取2g样品，加乙腈10ml，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心5min，上清液转移至另一离心管中，重复提取1次，合并上清液，40℃氮气吹干，用乙腈-0.1％甲酸水溶液(1∶1)5ml溶解，备用。即得。
结论：用此方法测棉花跟中游离棉酚的含量，其杂质峰多，目标峰响应值低，分离差，不再进行此方法的研究。故不载入正文。
针对4.1方法一，进行如下实验
4.2.1线性试验
精密吸取游离棉酚对照品溶液(2.02μg/ml)5μl、10μl以及游离棉酚对照品溶液(101.3μg/ml)2μl、5μl、10μl注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归,线性方程为:Y＝4.0054X-3.4712,R2＝0.9999；表明游离棉酚进样量在10.1～1013μg范围内呈良好的线性关系。结果见表9。
表9游离棉酚线性试验结果
4.2.2仪器精密度试验
取4.1项下制备的对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，测定游离棉酚峰面积，计算RSD％(游离棉酚)值为1.18％，表明仪器精密度好，测定结果见表10。
表10仪器精密度试验结果
4.2.4重复性试验
精密称取同一批样品(批号171205)6份，同时按4.1项方法一、4.2方法二所述方法测定样品中游离棉酚的含量，4.1项方法一平均含量为0.5658(mg/kg)，RSD值9.2342％，表明此游离棉酚的测定方法具有良好的重复性；4.2方法二响应值低，含量偏低，结果见表11。
表11重复性试验结果
4..2.5稳定性试验
按4.1项和4.2项下方法各制备供试品溶液一份，室温放置，按拟定色谱条件下于0，2，4，6，8，10h分别进样，测定峰面积。计算RSD％为9.846％，表明4.1方法一项棉酚在10h内相对稳定。4.4方法二项棉酚在10h内稳定性不好，稳定性试验结果见表12。
表12稳定性试验结果
4.2.6回收试验
采用加样回收法。取已知含量的样品(含量：0.56mg/kg)6份，每份精密称取约5.0g，分别加入游离棉酚对照品溶液(2.02μg/ml)1ml，按照4.1方法一项下制备方法制备。在上述色谱条件下测定，测得其平均回收率为91.76％，RSD％为0.61％，4.2方法二同时做对比实验，回收率为65.17％，低于4.1方法一的结果，说明方法一优于方法二。结果见表13。
表13加样回收试验结果表
4.2.7样品含量测定
按4.1方法一的方法的方法对十批样品进行含量测定，同时对比4.2方法二进行含量检测，结果见表14。
表14十批样品含量结果表
结论：采用本发明的检测方法，棉酚的线性范围为10.1～101mg,线性方程为:Y＝4.0054X-3.4712,R2＝0.9999,平均回收率91.76％,RSD为0.61％(n＝6)回收率优于对比例。采用本发明方法处理的供试品溶液的稳定性RSD％为9.846，方法二(对比例)RSD％为14.407％，回收率优于对比例的回收率；采用本发明方法供试品的响应值高，结果准确可靠，该方法简便、重复性好,可有效地控制咳宁颗粒、咳宁糖浆的质量。
国家药品质量标准《中国药典》2015版中对游离棉酚最高残留量没有明确规定，现行食用油中的游离游离棉酚最高残留限(200mg/kg)，虽然10个批号中均有游离棉酚检出，仅为0.662mg/kg，为现行食用油中的游离游离棉酚最高残留限量的0.3％左右，因此，本药品中游离棉酚的含量是在安全范围的。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种治疗咳喘胸满药物组合物的质量检测方法，所述药物组合物由棉花根、松塔、枇杷叶组成，其特征在于所述质量检测方法为：(1)鉴别：棉花根和松塔的鉴别、枇杷叶的鉴别；(2)检查；(3)棉花根中游离棉酚的残留量测定；
所述棉花根和松塔的鉴别方法为:(1)供试品溶液的制备：取所述药物4～6g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇15～25ml使溶解，水浴加热回流30～40min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；(2)对照药材溶液的制备：分别取棉花根对照药材1.3～1.7g，松塔对照药材1.5～2.5g，各加水30～50ml，煮沸25～35分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；(3)薄层色谱法鉴别：取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点；
所述枇杷叶的鉴别方法为：(1)供试品溶液的制备：取所述药物4.5～5.5g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次10～20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.0～2.0cm，长6～10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水40～60ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；(2)对照药材溶液的制备：另取枇杷叶对照药材1.5～2.5g，加水90～110ml，煎煮30～60分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次10～20ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.0～2.0cm，长6～10cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水40～60ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；(3)薄层色谱法鉴别：吸取上述二种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G板薄层板上，以4～6：1.6～2.4的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以15～25％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
所述检查为：照粒度和粒度分布测定法即通则0982第二法双筛分法测定，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15％；照水分测定法即通则0832测定，水分不得超过8.0％；照干燥失重测定法即通则0831测定，于80℃干燥至恒重，减失重量不得超过2.0％；照下述方法检查，溶化性应符合规定，取本药物1袋，加70～80℃水200ml，搅拌5分钟，立即观察，可溶颗粒应全部溶化或轻微浑浊，不得有异物，不得有焦屑；取本药物10袋，除去包装，分别精密称定每袋内容物的重量，求出每袋内容物的装量与平均装量；每袋装量与标示装量比较，超出装量差异限度的颗粒剂不得多于2袋，并不得有1袋超出装量差异限度1倍，装量差异限度±5％；照非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法通则1105和控制菌检法通则1106及非无菌药品微生物限度标准通则1107检查，应符合规定；
所述棉花根中游离棉酚的残留量测定的方法为；(1)色谱条件与系统适用性实验：色谱柱Sepax sapphire C18，柱温25℃；以乙腈为流动相A,10mmol/LKH2PO4为流动相B梯度洗脱，梯度洗脱的程序为0～4min流动相B的体积分数为50％，4～6min流动相B的体积分数由50％下降至38％，6～10min流动相B的体积分数下降至30％，10～35min，流动相B的体积分数下降至0％；35min～38min流动相B的体积分数上升至50％，38min～50min流动相B的体积分数维持50％；检测器为紫外检测器；检测波长：238nm；流速1mL/min；(2)供试品溶液的制备：取所述药物4.8～5.2g，加丙酮20ml，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心5min，上清液经微孔滤膜过滤,25℃氮气吹干，以比例为1∶1的乙腈～10mmol/LKH2PO45ml混合溶液溶解，即得；(3)对照品溶液的制备：精密称取游离棉酚对照品，用色谱纯乙腈配制成质量浓度为101.3μg/mL的游离棉酚标准储备液，再精密量取2ml，置于100ml的量瓶中，用乙腈稀释成2.02μg/ml溶液，摇匀即得；(4)测定法：精密吸取对照品与供试品液各10ul，注入液相色谱仪测定，即得。
2.根据权利要求1所述的质量检测方法,其特征在于，所述棉花根和松塔的鉴别方法为：(1)供试品溶液的制备：取所述药物4.5～5.5g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇18～22ml使溶解，水浴加热回流30～40min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；(2)对照药材溶液的制备：分别取棉花根对照药材1.4～1.6g，松塔对照药材1.7～2.2g，各加水35～45ml，煮沸28～32分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；(3)薄层色谱法鉴别：取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点。
3.根据权利要求1所述质量检测方法,其特征在于，所述棉花根和松塔的鉴别方法为：(1)供试品溶液的制备：取所述药物5g，研细，加比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇20ml使溶解，水浴加热回流40min，滤过，滤液置水浴蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；(2)对照药材溶液的制备：分别取棉花根对照药材1.5g，松塔对照药材2.0g，各加水30ml，煮沸30分钟，滤过，滤液用比例为4:1的乙酸乙酯﹣乙醇溶液10ml振摇提取，提取液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，滤过，即得；(3)薄层色谱法鉴别：取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以比例为3:1:1的乙酸丁酯﹣甲醇﹣水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显一个以上相同颜色的荧光斑点。
4.根据权利要求1所述质量检测方法，其特征在于，所述枇杷叶的鉴别方法为：(1)供试品溶液的制备：取所述药物4.8～5.2g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次13～17ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.4～1.6cm，长7～9cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水45～55ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；(2)对照药材溶液的制备：另取枇杷叶对照药材1.8～2.2g，加水95～105ml，煎煮30～40分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次14～16ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.4～1.6cm，长7～9cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水45～55ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；(3)薄层色谱法鉴别：吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一高效薄层板上，以5：2的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以15～25％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
5.根据权利要求1所述质量检测方法，其特征在于，所述枇杷叶的鉴别方法为：(1)供试品溶液的制备：取所述药物5.0g，研细，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.5cm，长8cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；(2)对照药材溶液的制备：另取枇杷叶对照药材2.0g，加水100ml，煎煮40分钟，滤过，滤液加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过内径1.5cm，长8cm的D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用稀乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，蒸干，蒸干环境为排空气的负压环境，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；(3)薄层色谱法鉴别：吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G板薄层板上，以5：2的甲苯～丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以20％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与枇杷叶对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
6.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述治疗咳喘胸满药物组合物为咳宁颗粒、咳宁糖浆或以其活性成分棉花根、松塔、枇杷叶为原料制成的其他药物组合制剂。
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