CN111175386B - 一种泻白散的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种泻白散的含量测定方法，属于中药质量检测技术领域，采用高效液相色谱法同时测定泻白散中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵的含量。通过对色谱条件和供试品的制备方法进行优选，实现了同时测定泻白散中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵的含量。本发明提高了检测效率，也可更全面地反映泻白散的质量。方法学试验的结果表明该质量检测方法具有准确度好、精密度高、专属性强、稳定性好的优势，可为泻白散质量标准的制订提供依据。

Description

一种泻白散的含量测定方法

技术领域

本发明属于中药质量检测技术领域，涉及一种中药组合物的含量测定方法，具体涉及一种使用高效液相色谱法同时测定泻白散中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵含量的方法。

背景技术

泻白散，由桑白皮、地骨皮、甘草、粳米组成，具有清泻肺热，止咳平喘之功效。现代临床常用本方治疗小儿肺炎、气管炎、肺气肿或肺气肿合并感染及小儿麻疹初期，而见有咳嗽气促，身热不退之证。

目前《中国药典》尚未对泻白散的质量标准做出规定，现有技术中也没有对泻白散中多种成分同时进行含量测定的方法，不能全面、准确地反映该中药组合物的质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时测定泻白散中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵含量的方法，全面、准确地反映该中药组合物的质量。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是采用高效液相色谱法同时对泻白散中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵三种成分进行含量测定，操作方法如下：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为1mL/min，桑皮苷A的检测波长为190-380nm，甘草苷的检测波长为190-350nm,甘草酸铵的检测波长为190-280nm，柱温为30℃。

表1梯度洗脱程序

对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵对照品1mg至10mL容量瓶，加入70％甲醇溶液定容至刻度，得到浓度为0.1mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称取泻白散喷干粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25-50mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，作供试品溶液。

测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

有益效果：在同一色谱条件下同时测定泻白散中的三种成分，与单一成分测定相比，提高了检测效率，也可更全面地反映泻白散的质量。方法学试验的结果表明该质量检测方法具有准确度好、精密度高、专属性强、稳定性好的优势，符合中药质量标准研究的技术要求。

附图说明

图1为实施例1中样品和对照品的液相色谱图。

图2为实施例2中样品和对照品的液相色谱图。

图3是实施例3中溶剂为70％乙醇时不同用量的液相色谱图。

图4是实施例3中溶剂为70％乙醇时不同用量的峰面积曲线图。

图5是实施例3中溶剂为70％乙醇时桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵的不同用量峰面积均值对比图。

图6是实施例3中溶剂为70％甲醇时不同用量的液相色谱图。

图7是实施例3中溶剂为70％甲醇时不同用量的峰面积曲线图。

图8是实施例3中溶剂为70％甲醇时桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵的不同用量峰面积均值对比图。

图9是实施例4中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵混标溶液的UV-VIS光谱图。

图10是实施例5中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵的标准曲线图。

图11是实施例6中桑皮苷A的标准曲线图。

图12是实施例6中甘草苷的标准曲线图。

图13是实施例6中甘草酸铵的标准曲线图。

图14是实施例6中桑皮苷A的加标标准曲线图。

图15是实施例6中甘草苷的加标标准曲线图。

图16是实施例6中甘草酸铵的加标标准曲线图。

图17是实施例8中空白溶液、对照品溶液、供试品溶液的液相色谱图。

图18是实施例9中不同时间的桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体说明。

仪器与试剂：配有DAD全波长扫描检测器，VWD紫外检测器的Ultimate 3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)，Syncronis C18色谱柱(赛默飞世尔科技有限公司)，AS系列超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，离心机(德国SIGMA公司，型号：1-14)，分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司，型号：SQP)。甲醇(天津市康科德科技有限公司，色谱纯)，乙醇(33天津市康科德科技有限公司，色谱纯)，乙腈(天津市康科德科技有限公司，色谱纯)，磷酸(天津市华东试剂厂，分析纯)。

对照品与样品：桑皮苷A(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号5343)，甘草苷(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号5594)，甘草酸铵(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号4674)。泻白散干粉(实验室自制)。

实施例1

采用高效液相色谱法同时测定泻白散中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵的含量，操作方法如下：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表2进行梯度洗脱；流速为1mL/min，检测波长为237nm，柱温为30℃。

表2梯度洗脱程序

对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵对照品1mg至10mL容量瓶，加入70％甲醇溶液定容至刻度，得到浓度为0.1mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称取泻白散喷干粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，作供试品溶液。

测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得，结果如图1所示。

实施例2

采用高效液相色谱法同时测定泻白散中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵的含量，操作方法如下：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表3进行梯度洗脱；流速为1mL/min，桑皮苷A的检测波长为325nm，甘草苷和甘草酸铵的检测波长为260nm，柱温为30℃。

表3梯度洗脱程序

对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵对照品1mg至10mL容量瓶，加入70％甲醇溶液定容至刻度，得到浓度为0.1mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称取泻白散喷干粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，作供试品溶液。

测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得，结果如图2所示。

实施例3

提取溶剂及其用量的选择

色谱条件：有机相为乙腈，水相为0.1％磷酸溶液，按表4进行梯度洗脱；流速为1mL/min，检测波长为237nm，柱温为30℃，进样量为5μL。

表4梯度洗脱程序

方案一：取泻白散喷干粉末约0.5g，精密称取，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％乙醇25mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，作供试品溶液。按照上述色谱条件进行实验，结果如图3、图4、图5、表5所示。

表5溶剂为70％乙醇时不同用量的峰面积

方案二：取泻白散喷干粉末约0.5g，精密称取，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，作供试品溶液。按照上述色谱条件进行实验，结果如图6、图7、图8、表6所示。

表6溶剂为70％甲醇时不同用量的峰面积

实验结果：

25mL 70％甲醇或25mL 70％乙醇能将0.5g泻白散干粉中桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵提取出来，且70％甲醇作为溶剂比70％乙醇作为溶剂提取有效成分更稳定，因此确定提取溶剂为70％甲醇，用量为25mL。

实施例4

检测波长的选择

配制桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵混标溶液进行液相分析，采用DAD检测器进行全波长扫描，得到190-800nm的UV-VIS光谱图，如图9所示。光谱图显示，桑皮苷A在190-800nm下的最大吸收波长为324.58nm，甘草苷为193.05nm，甘草酸铵为250.96nm，由以上光谱图可以看出，当波长小于300nm时，三种物质都有响应，因此鉴于2015版《中国药典》推荐甘草苷与甘草酸铵检测波长237nm，本方法也优先选用波长237nm。

实施例5

线性关系考察

母液配制：用十万分之一天平分别精密称取桑皮苷A 5.05mg，甘草苷5.00mg，甘草酸铵标准品1.70mg，溶解转移并用甲醇定容至10mL容量瓶中，得到浓度分别为0.505mg/mL、0.500mg/mL、0.170mg/mL的桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵母液。

标准溶液及空白样品制备：用甲醇对以上配制的母液进行稀释，分别稀释成浓度分别为原母液的100％、75％、50％、25％、10％、1％的桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵标准溶液，取样过0.45μm微孔滤膜得到标准溶液。取甲醇1mL，过0.45μm微孔滤膜，制得空白样品。

样品制备：精密称取泻白散喷干粉末0.5g，平行两份，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，即得。

对桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵标准溶液以及泻白散干粉样品，按照实施例3中的色谱条件进行液相分析。

以测得的响应信号对相应标准物浓度作图，制作桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵的标准曲线，对标准曲线进行线性回归分析，得到拟合方程，并计算相关系数R2(均大于0.99)，结果显示线性良好。用方程对泻白散中桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵进行定量。结果如表7、图10所示。

表7线性关系考察

实施例6

准确度

标准曲线制作：分别精密称取桑皮苷A 5.13mg,甘草苷5.02mg，甘草酸铵2.5mg于10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到混标母液。将母液分别稀释成100％，75％，50％，25％，10％，1％含量的标准溶液。将上述标准溶液按实施例3中的色谱条件进行液相分析，并绘制浓度-峰面积标准曲线如图11、图12、图13。

供试品含量测定：精密称定取同一供试品约0.5g，共6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，得到供试品溶液，按实施例3中的色谱条件进行液相分析，按照上述标准曲线拟合方程计算供试品溶液中桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵质量如表8。

表8供试品含量测定

加标实验：根据供试品溶液中三种成分浓度配制加标溶液，精密称取三种标准品，配制成浓度为桑皮苷A 0.306mg/mL，甘草苷0.043mg/mL，甘草酸0.023mg/mL的加标溶液。分别取加标溶液0.5mL，按1:1体积加入到6组供试品溶液中，充分混匀，进行含量测定。标准曲线如图14、图15、图16，结果如表9、表10、表11所示，计算得到桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵加样回收率试验RSD分别为4.4133％，2.5066％，1.1851％，准确度良好。

表9桑皮苷A

表10甘草苷

表11甘草酸铵

实施例7

精密度

取泻白散喷干粉末约0.5g，精密称取，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，得到供试品溶液，按照实施例3中的色谱条件进行液相分析，连续进样6次，对桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵进行积分，分别计算其峰面积的相对标准偏差。不同人员，采用不同仪器重复上述实验，计算三种物质峰面积的相对标准偏差。对数据进行分析，结果如表12所示，可以看出，此方法精密度良好。

表12精密度试验

实施例8

专属性

取泻白散喷干粉末约0.5g，精密称取，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，得到供试品溶液，与空白溶液，混标溶液一起，按照实施例3中的色谱条件进行液相分析。结果如图17所示，泻白散供试品溶液在与对照品溶液峰相同的位置出峰，对照组显阴性反应，分析方法专属性良好。

实施例9

样品稳定性

取泻白散喷干粉末约0.5g，精密称取，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1mL于1.5mL EP管中，离心10min，取上清液，得到供试品溶液。考察供试品溶液的稳定性，分别在0h，2h，4h，6h对供试品溶液进行液相分析，对桑皮苷A，甘草苷，甘草酸铵峰面积进行分析。结果如图18、表13所示，在6h内，样品稳定性良好。

表13稳定性试验

Claims (2)

1.一种泻白散的含量测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法同时测定泻白散中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵的含量，包括如下步骤：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1%磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为1mL/min，桑皮苷A、甘草苷和甘草酸铵的检测波长为237nm，或者桑皮苷A的检测波长为325nm、甘草苷和甘草酸铵的检测波长为260nm，柱温为30℃；

表1 梯度洗脱程序

时间，min A，% B，% 0 95 5 15 80 20 35 40 60

对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加70%甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 0.1mg、甘草苷0.1mg、甘草酸铵0.1mg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：精密称取泻白散干粉0.5g，加入70%甲醇25-50mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，离心，取上清液，作供试品溶液；

测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的泻白散的含量测定方法，其特征在于：供试品溶液制备时，超声处理前加入70%甲醇的用量为25mL。

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