CN110794057A - 一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，它是以毛蕊花糖苷对照品为对照，以甲醇为流动相A、0.02％～2％磷酸水溶液为流动相B梯度洗脱的高效液相色谱法。本发明能够同时对维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量进行快速、准确、高重现性、高回收率的测定。

Description

一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法
技术领域
本发明涉及一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，属于中药质量检测技术领域。
背景技术
维血宁中药制剂是以虎枚、炒白芍、仙鹤草、地黄、鸡血藤、熟地黄、墨旱莲、太子参组成，具有滋阴养血，清热凉血的功效。用于阴虚血热所致的出血；血小板减少症见上述证候者。
维血宁中药制剂中含有地黄，其主要用于清热生津、凉血止血、清热凉血、养阴生津、补血滋阴、益精填髓等作用，在关节克痹丸复方制剂中具有重要作用，其主要成分为毛蕊花糖苷，作为复方制剂有效成分中的一种，对其进行含量测定显的尤为重要。
但是，现有的关节克痹丸的质量检测方法并没有对毛蕊花糖苷成分的含量进行测定，为进一步完善关节克痹丸的质量检测标准，以确保其药品质量，建立关节克痹丸中毛蕊花糖苷的含量测定项目非常必要。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，能够对维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量进行快速、准确、高重现性、高回收率的测定。
为解决现有技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于：它是以毛蕊花糖苷对照品为对照，以甲醇为流动相A、0.02％～2％磷酸水溶液为流动相B梯度洗脱的高效液相色谱法。
上述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法，按照如下步骤进行测定：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，0.02％～2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为203nm，流速为0.8～1.0mL/min，柱温为25～35℃，理论板数以毛蕊花糖苷峰计算不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含毛蕊花糖苷0.25mg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：采用下述方法①-④中的任一种：
①精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声或回流处理30～60min，用甲醇补足重量；滤过，取续滤液，即得；
②精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流提取30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，加水搅拌，滤过，加少量水洗涤滤饼及容器3次，合并洗液及滤液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
③精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用碱溶液洗3次，每次20mL，正丁醇液浓缩至干，残渣加水5mL使溶解，通过处理好的大孔吸附树脂柱或中性氧化铝柱，水洗至无色，收集50％～80％的乙醇洗脱液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
④精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置索氏提取器中加入石油醚、三氯甲烷或两者混合物加热回流3h，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100mL具塞锥形瓶中，加入醇碱溶液50mL，加热回流1h，放冷，滤过，用少量甲醇洗涤滤饼及容器3次，合并洗液和滤液，浓缩至干，残渣加水50mL溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，分别用氨试液、水、1％磷酸二氢钾溶液各洗涤1次，每次40mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
上述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体条件为：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
上述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法③中所述的碱溶液为1％氢氧化钠溶液或氨试液，所述的大孔吸附树脂柱为D101、AB-8或NKA-9树脂。
上述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法④中所述的醇碱溶液为2％氢氧化钾甲醇液。
上述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，所述流动相B为0.2％磷酸水溶液。
以下是申请人所进行的相关试验研究和考察的主要内容。
一、仪器与试药(见表1)
表1仪器与试剂表
Figure BDA0002260901640000031
二、方法与结果
1、色谱条件的选择
1.1柱温选择
为寻找最佳柱温，申请人采用不同柱温进行实验，观察结果，结果见表2。
表2柱温实验表
柱温(℃) 20 25 30 35 40
观察结果 分离度差 分离度良好 分离度良好 分离度良好 溶剂粘度大
由表2可知，选择25～35℃作为柱温均可。
1.2流速选择
为寻找最佳流速范围，申请人采用不同流速进行实验，记录色谱峰，结果见表3。
表3色谱峰记录表
Figure BDA0002260901640000032
由表3可知，设置流速为0.8～1.0mL/min，各峰间的分辨率良好，色谱时间短，峰面积适中，效果最好。
1.3流动相选择
为寻找最佳流动相，申请人采用不同流动相进行UV检测，记录色谱峰，结果如下。
(1)乙腈-水梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(2)乙腈-0.02％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(3)乙腈-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(4)乙腈-1％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(5)乙腈-2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(6)甲醇-水梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(7)甲醇-0.02％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(8)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(9)甲醇-1％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(10)甲醇-2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
(11)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝10：90；5～40min：A：B＝10～28：90～72；40～75min：A：B＝28～38：72～62；75～80min：A：B＝38～10：62～90；80～110min：A：B＝10：90。
(12)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝15：85；5～40min：A：B＝15～30：85～70；40～75min：A：B＝30～40：70～60；75～80min：A：B＝40～15：60～85；80～110min：A：B＝15：85。
(13)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝12：88；5～40min：A：B＝12～30：88～70；40～75min：A：B＝30～35：70～65；75～80min：A：B＝35～12：65～88；80～110min：A：B＝12：88。
(14)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～8min：A：B＝15：85；8～40min：A：B＝15～25：85～75；40～55min：A：B＝25～35：75～65；55～80min：A：B＝35～15：65～85；80～110min：A：B＝15：85。
(15)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～10min：A：B＝15：85；10～45min：A：B＝15～25：85～75；45～60min：A：B＝25～35：75～65；60～80min：A：B＝35～15：65～85；80～110min：A：B＝15：85。
(16)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～10min：A：B＝20：80；10～45min：A：B＝20～35：80～65；45～60min：A：B＝35～45：65～55；60～80min：A：B＝45～20：55～80；80～110min：A：B＝20：80。
结果显示在流动相B与洗脱条件相同的条件下，流动相A运用乙腈与甲醇均可，且甲醇较乙腈效果稍好，又因甲醇价格比乙腈低廉，因此优选流动相A为甲醇；在流动相A为甲醇且洗脱条件相同的情况下，流动相B采用水或0.02％～2％磷酸水溶液均可，但用一定浓度的磷酸水溶液替代水可得到较好的效果，且流动相用甲醇-0.2％磷酸水溶液效果更好；采用甲醇-0.2％磷酸水溶液的流动相体系，对不同时间段不同比例的流动相进行调整，摸索得到甲醇-磷酸水溶液体系采用上述(8)的梯度洗脱方式所得色谱峰较好，其分离度均符合要求，峰形均较好。
2、对照品溶液的制备
取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含维血宁制剂中毛蕊花糖苷0.1mg的溶液，即得；
3、供试品溶液的制备
采用下述方法①-④中的任一种：
①精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声或回流处理30～60min，用甲醇补足重量；滤过，取续滤液，即得；
②精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流提取30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，加水搅拌，滤过，加少量水洗涤滤饼及容器3次，合并洗液及滤液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
③精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用碱溶液(如1％氢氧化钠溶液、氨试液)洗3次，每次20mL，正丁醇液浓缩至干，残渣加水5mL使溶解，通过处理好的大孔吸附树脂柱(如D101、AB-8、NKA-9树脂)或中性氧化铝柱，水洗至无色，收集50％～80％的乙醇洗脱液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
④精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置索氏提取器中加入石油醚、三氯甲烷或两者混合物加热回流3h，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100mL具塞锥形瓶中，加入醇碱溶液50mL(如2％氢氧化钾甲醇液)，加热回流1h，放冷，滤过，用少量甲醇洗涤滤饼及容器3次，合并洗液和滤液，浓缩至干，残渣加水50mL溶解，用水饱和的正丁醇提取4次(20，20，10，10mL)，合并正丁醇液，分别用氨试液、水、1％磷酸二氢钾溶液各洗涤1次，每次40mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对四种供试品制备方法进行比较，结果如表4所示：
表4
方法 测试结果
方法一 毛蕊花糖苷的提取效率高，但纯度稍低
方法二 毛蕊花糖苷的提取效率高，但纯度稍低
方法三 毛蕊花糖苷的提取效率稍低，但纯度高
方法四 毛蕊花糖苷的提取效率稍低，但纯度高
由表4可知，通过方法一与方法二制备供试品，步骤简单操作方便，提取效率高，但是纯度稍低，杂质较多；采用方法三和方法四制备供试品，步骤繁琐，提取效率较前两者低，但提取的毛蕊花糖苷纯度高，杂质残留量低，降低了检测过程中杂质的影响力，更利于保证检测结果的准确性和稳定性。
4、检测波长的选择
本发明人通过大量试验反复对毛蕊花糖苷对照品溶液进行光谱紫外扫描，发现特别是在203nm处有极大吸收波长，其它毛蕊花糖苷制剂溶液在此波长下也有较好的显示，因此本发明中毛蕊花糖苷检测波长确定为203nm。
5、标准曲线的制备
分别精密量取毛蕊花糖苷对照品溶液，其浓度为0.1mg/mL，分别进样5、10、15、20、25μL，测得峰面积并记录，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，回归方程及线性范围见表5。
表5 4种人参皂苷回归方程及相关系数
组分 回归方程 相关系数 线性范围(μg)
Rg1 Y＝289.59X+33.504 0.9999 0.51～2.55
Re Y＝242.19X+2.560 0.9999 0.515～2.575
Rb1 Y＝463.96X+53.460 0.9999 1.025～5.125
Rc Y＝405.97X+46.785 0.9999 1.02～5.10
6、精密度实验
取对照品溶液10μL，重复进样6次，测得毛蕊花糖苷峰面积，计算得RSD分别为0.47％、0.36％、0.51％、0.33％，表明精密度良好。
7、稳定性实验
精密吸取同一供试品溶液，室温下分别于0、2、4、8、12、24h各吸取10μL，共进样6次，测得毛蕊花糖苷峰面积，计算得RSD为0.91％，表明处理后的溶液在室温下24h内稳定，稳定性良好。
8、重复性实验
取同一供试品溶液6份，各进样10μL，测得毛蕊花糖苷峰面积，计算得RSD为0.83％，表明重复性良好。
9、加样回收率实验
精密称取已知含量的样品100mg，分别加入相当于各被测物含量的80％、100％、120％的对照品储备液，按照供试品溶液的制备项下方法制备低、中、高回收率样品各3份，测定各毛蕊花糖苷成分的含量并计算加样回收率(n＝9)，结果毛蕊花糖苷的平均回收率为100.4％(RSD＝1.06％)，表明本方法准确度良好。
10、样品含量测定
取5批维血宁制剂或其内容物适量，精密称定，分别按对照品溶液的制备项、供试品溶液的制备项下方法进行制备，按线性关系的考察项下含量测定(供试品溶液、对照品溶液分别进样10μL)，计算出毛蕊花糖苷含量，结果见表6。
表6样品含量测定结果(n＝5)
批号 含量(mg/g)
20180601 0.829
20180602 0.812
20180603 0.820
20180604 0.823
20180605 0.788
本发明通过高效液相色谱法对维血宁制剂中毛蕊花糖苷成分的含量进行测定，所述方法的专属性强、精密度高、重复性好、回收率高、稳定性高、测量结果准确，达到了有效控制药物质量的目的，确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。
具体实施方式
本发明实施例1：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，步骤如下：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，0.02％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75；检测波长为203nm，流速为0.8mL/min，柱温为25℃，理论板数以毛蕊花糖苷峰计算不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：取维血宁制剂中毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲制成每1mL含毛蕊花糖苷的溶液、，即得；
(3)供试品溶液的制备：精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声或回流处理30～60min，用甲醇补足重量；滤过，取续滤液，即得；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
本发明实施例2：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，步骤如下：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75；检测波长为203nm，流速为0.9mL/min，柱温为30℃，理论板数以维毛蕊花糖苷峰计算不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含毛蕊花糖苷Rg10.1mg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流提取30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，加水搅拌，滤过，加少量水洗涤滤饼及容器3次，合并洗液及滤液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
本发明实施例3：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷含量测定方法，步骤如下：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，1％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75；检测波长为203nm，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，理论板数以毛蕊花糖苷峰计算不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含毛蕊花糖苷Rg10.1mg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用碱溶液(氨试液)洗3次，每次20mL，正丁醇液浓缩至干，残渣加水5mL使溶解，通过处理好的大孔吸附树脂柱(D101)，水洗至无色，收集50％～80％的乙醇洗脱液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
本发明实施例4：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，步骤如下：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75；检测波长为203nm，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，理论板数以毛蕊花糖苷峰计算不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含毛蕊花糖苷Rg10.1mg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置索氏提取器中加入石油醚、三氯甲烷或两者混合物加热回流3h，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100mL具塞锥形瓶中，加入醇碱溶液(2％氢氧化钾甲醇液)50mL，加热回流1h，放冷，滤过，用少量甲醇洗涤滤饼及容器3次，合并洗液和滤液，浓缩至干，残渣加水50mL溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，分别用氨试液、水、1％磷酸二氢钾溶液各洗涤1次，每次40mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
本发明实施例5：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷含量测定方法，步骤如下：
除了“梯度洗脱条件为：0～10min：A：B＝15：85；10～45min：A：B＝15～25：85～75；45～60min：A：B＝25～35：75～65；60～80min：A：B＝35～15：65～85；80～110min：A：B＝15：85”外，其余同实施例2。
本发明实施例6：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，步骤如下：
除了“梯度洗脱条件为：0～10min：A：B＝20：80；10～45min：A：B＝20～35：80～65；45～60min：A：B＝35～45：65～55；60～80min：A：B＝45～20：55～80；80～110min：A：B＝20：80”外，其余同实施例2。
本发明实施例7：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷含量测定方法，步骤如下：
除了步骤(3)中供试品溶液的制备中“通过处理好的大孔吸附树脂柱(AB-8)，水洗至无色”外，其余同实施例3。
本发明实施例8：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷含量测定方法，步骤如下：
除了步骤(3)中供试品溶液的制备中“通过处理好的大孔吸附树脂柱(NKA-9)，水洗至无色”外，其余同实施例3。
本发明实施例9：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，步骤如下：
除了步骤(3)中供试品溶液的制备中“用碱溶液(1％氢氧化钠溶液)洗3次”以及“通过处理好的中性氧化铝柱，水洗至无色”外，其余同实施例3。
本发明实施例10：一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，步骤如下：
除了“梯度洗脱条件为：0～5min：A：B＝10：90；5～40min：A：B＝10～28：90～72；40～75min：A：B＝28～38：72～62；75～80min：A：B＝38～10：62～90；80～110min：A：B＝10：90”外，其余同实施例2。
上述实施例中的所有条件参数的任意组合，均可得到一致的含量测定结果。

Claims (6)

1.一种维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于：它是以毛蕊花糖苷对照品为对照，以甲醇为流动相A、0.02％～2％磷酸水溶液为流动相B梯度洗脱的高效液相色谱法。
2.根据权利要求1所述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法，按照如下步骤进行测定：
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，0.02％～2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为203nm，流速为0.8～1.0mL/min，柱温为25～35℃，理论板数以毛蕊花糖苷峰计算不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含毛蕊花糖苷0.25mg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：采用下述方法①-④中的任一种：
①精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声或回流处理30～60min，用甲醇补足重量；滤过，取续滤液，即得；
②精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流提取30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，加水搅拌，滤过，加少量水洗涤滤饼及容器3次，合并洗液及滤液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
③精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用碱溶液洗3次，每次20mL，正丁醇液浓缩至干，残渣加水5mL使溶解，通过处理好的大孔吸附树脂柱或中性氧化铝柱，水洗至无色，收集50％～80％的乙醇洗脱液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
④精密称取维血宁制剂或其内容物5～20g，置索氏提取器中加入石油醚、三氯甲烷或两者混合物加热回流3h，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100mL具塞锥形瓶中，加入醇碱溶液50mL，加热回流1h，放冷，滤过，用少量甲醇洗涤滤饼及容器3次，合并洗液和滤液，浓缩至干，残渣加水50mL溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，分别用氨试液、水、1％磷酸二氢钾溶液各洗涤1次，每次40mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
3.根据权利要求2所述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体条件为：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75。
4.根据权利要求2所述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法③中所述的碱溶液为1％氢氧化钠溶液或氨试液，所述的大孔吸附树脂柱为D101、AB-8或NKA-9树脂。
5.根据权利要求2所述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法④中所述的醇碱溶液为2％氢氧化钾甲醇液。
6.根据权利要求1、2或3所述的维血宁制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于，所述流动相B为0.2％磷酸水溶液。
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