CN115128200B - 一种白花泡桐叶的hplc质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白花泡桐叶的HPLC检测方法，包括（1）配制毛蕊花糖苷的标准溶液；（2）对白花泡桐叶进行完全提取，提取液用0.45μm滤膜过滤；（3）进行HPLC检测：先将对照品溶液进样检测，再将供试品溶液进样检测，通过比对得出毛蕊花糖苷的含量。本发明采用HPLC对白花泡桐叶中的各项成分进行分析，通过大量试验，发现HPLC图谱中的11号峰为共有峰，强度较高，保留时间相对居中与其余色谱峰的分离度良好，通过核磁共振技术鉴定为毛蕊花糖苷。本发明首次在白花泡桐叶的HPLC谱图中发现非常适合做定量分析的成分毛蕊花糖苷，随后采用HPLC法对泡桐叶中的毛蕊花糖苷进行定量分析，该方法精密度高、误差小、重现性好，实现对白花泡桐叶的质量检测。
Description
技术领域
本发明属于中药材质量控制技术领域，具体涉及一种白花泡桐叶的HPLC质量检测方法。
背景技术
白花泡桐（Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl.）为玄参科泡桐属落叶乔木，在我国10多个省市均有分布。白花泡桐作为一种优质的速生木材，其除了广泛地应用于工农业生产外，还是一种常用的中药材，泡桐的花、叶、皮、根、果均可入药。本草纲目对白花泡桐各个部位的药理作用做了详细记载，现代医学研究表明白花泡桐具有抑菌，消炎，抗肿瘤甚至还有杀虫的作用。白花泡桐树枝繁叶茂，叶片的数量巨大，是一笔丰富的资源。用白花泡桐叶作饲料，不仅能促进动物生长，而且能提高动物抗病能力。医疗方面的价值可以体现在治疗痈疽、疔疮、创伤出血等，白花泡桐叶具有重要的经济价值和社会价值。由于泡桐属植物叶片相似度高，不同种类的泡桐及同种泡桐的不同时期的泡桐叶中化合物含量各不相同，目前并没有有效的方法对白花泡桐叶进行质量检测和控制。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明通过大量研究，首次在白花泡桐叶提取物的HPLC谱图中发现一个非常适合做定量分析的成分，经制备分离后鉴定为毛蕊花糖苷，以毛蕊花糖苷为对照品（标准品），采用HPLC对白花泡桐叶中的毛蕊花糖苷进行定量分析，用于白花泡桐叶的质量检测（一般来说，毛蕊花糖苷含量越高，质量越好）。
本发明的一种白花泡桐叶的HPLC质量检测方法采取以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：精密称取毛蕊花糖苷适量，配制成含毛蕊花糖苷的标准溶液。
（2）供试品溶液的制备：用一定量的溶剂对白花泡桐叶进行完全提取，提取液用0.45 μm滤膜过滤。
（3）进行HPLC检测：在一定色谱条件下，先将对照品溶液进样检测，再将供试品溶液进样检测，通过比对得出供试品溶液中毛蕊花糖苷的含量，再换算成白花泡桐叶中毛蕊花糖苷的含量。
步骤（2）中，溶剂优选为甲醇或乙醇。
步骤（3）中，色谱条件优选为：色谱柱：Agilent ZORBAX HC-C18(2) (4.6 mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇（B）-0.1%甲酸缓冲溶液（A）；梯度洗脱：时间变化（min）0-8-44-52-65-66-76、流动相A（%）90-68-50-0-0-90-90、流动相B（%）10-32-50-100-100-10-10；检测波长：254 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
本发明是在首次发现白花泡桐叶提取液的HPLC谱图中有一个非常适合做定量分析的成分，经制备分离后鉴定为毛蕊花糖苷的基础上做出的，耗费了大量的精力和创造性劳动，其过程如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B；梯度洗脱；
经大量试验，优化为在梯度洗脱过程中，流动相B的比例变化为：液相条件： 0-8min：10-32％甲醇，8-44 min：32-50％甲醇，44-52min：50-100％甲醇，52-65 min：100-100％甲醇，65-66 min：100-10％甲醇，66-76 min：10-10％甲醇；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱为Agilent ZORBAX HC-C18(2)，4.6×250 mm，5 μm。
供试品溶液的制备，以白花泡桐叶为原料，精密称定，研细，取细粉适量，精密称定，于置塞试管中加入提取溶剂适量，超声处理，放冷至室温，加提取溶剂至刻度，摇匀，离心，滤过，取续滤液，即得；
经大量试验，优化供试品溶液的制备为：将30 ℃干燥至恒重的白花泡桐叶粉碎，过三号筛，精密称取细粉0.5 g于50 ml锥形瓶中，加10 ml 70%甲醇超声提取30 min；放冷，用70%甲醇补足减失的质量，取上清液经微孔滤膜过滤，即得。
供试品溶液的检测：将供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，经大量试验发现： 所有HPLC图谱中的11号峰为共有峰，强度较高，保留时间相对居中与其余色谱峰的分离度良好，，因不确定该峰所代表的化合物，对其进行快速制备及鉴定。
称取白花泡桐叶粉末适量，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇提取，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，即得提取液。经半制备液相以甲醇-水（33:67）（t R =30.5 min）得到参照峰化合物。制备色谱条件为：色谱柱YMC-Pack Ph (10 mm×250 mm，5 µm)；等度洗脱；流动相：甲醇（B）-水（A）=（33:67）。检测波长254 nm；流动相流速2.5 mL/min；柱温30℃；tR=24.9 min；半制备液相为岛津LC-20AT。
制备成分的鉴定：淡黄色粉末。ESI-MS m/z: 647.1940 [M+Na]+。1H NMR (600MHz, MeOD) δ: 7.59 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7'), 7.05 (1H , d, J = 1.8 Hz, H-2'), 6.95 (1H, dd, J = 7.8, 1.8 Hz, H-6'), 6.77 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-5'),6.69 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2), 6.67 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-5), 6.56 (1H, dd, J= 8.0, 1.8 Hz, H-6), 6.27 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8'), 5.18 (1H, d, J = 1.8Hz, H-1″'), 4.37 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1″), 4.05 (1H, m, H-8β), 3.71 (1H, m,H-8α), 2.79 (2H, m, H-7), 1.09 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6″').13C-NMR (MeOD, 125MHz) δ: 166.9 (C-9'), 148.5 (C-4'), 146.7 (C-7'), 145.5 (C-3'), 144.8 (C-3),143.3 (C-4), 130.0 (C-1), 126.2 (C-1'), 121.9 (C-6'), 119.8 (C-6),115.7 (C-2), 115.1 (C-5'), 114.9 (C-5), 113.7 (C-8'), 113.2 (C-2'), 102.8 (C-1″),101.7(C-1″'), 80.3 (C-3″), 74.8 (C-2″),74.6 (C-5″),72.4 (C-4″'), 71.0 (C-2″'), 70.9 (C-3″'), 70.6 (C-5″'), 69.1 (C-4″), 69.0 (C-5″'), 60.9 (C-6″),35.2 (C-7), 17.0 (C-6″')。以上数据与文献报道基本一致[Wang XQ, Li CF, Jiang LL,et al. Phenylethaniod glycosides from Orobanchepycnostachya Hance and theirchemotaxonomic significance[J]. Biochemical Systematics andEcology,https://doi.org/10.1016/j.bse.2020.104168.]，故鉴定为毛蕊花糖苷。
白花泡桐叶中毛蕊花糖苷的含量测定如下：
对照品溶液的制备：取毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇制备成每1mL含毛蕊花糖苷0.53 mg的对照品母液。将溶液分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍，配成毛蕊花糖苷的浓度梯度为0.256 mg/ml、0.1325mg/ml、0.06625 mg/ml、0.033125 mg/ml。
供试品溶液的制备：精密称取白花泡桐叶粉末（三号筛）约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，取上清液，即得。0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
色谱条件及系统适用性：使用Agilent ZORBAX HC-C18(2) (4.6 mm×250 mm，5μm）以0.1%甲酸为流动相A，甲醇为流动相B；在等度洗脱过程中流动相的比例为0.1%甲酸：甲醇=67:33。检测波长254 nm；流动相流速1 mL/min；柱温30 ℃，理论塔板数按毛蕊花糖苷峰计算应不低于20000。
线性关系考察：分别吸取不同浓度的毛蕊花糖苷对照品溶液20 μL进行含量测定，以毛蕊花糖苷进样浓度为横坐标，峰面积面积为纵坐标，绘制标准曲线。以毛蕊花糖苷标准品浓度(μg/mL)为横轴，峰面积为纵轴，回归方程为y=95.598X+114.95（r2=0.9996），表明对照品在33.125-530μg/mL范围内线性关系良好。
将19批白花泡桐叶样品按上述方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图峰面积，用外标法计算毛蕊花糖苷含量，各批次样品的毛蕊花糖苷含量在0.5174%~4.0922%。
样品回收率试验：取样品粉末6份，每份约0.25 g，精密称定。精密加入含等量毛蕊花糖苷对照品混合溶液2.5 mL，加入70%甲醇7.5 mL，其余操作按照上述方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，计算各待测成分的平均回收率及RSD。结果显示加样回收率为97.99%～100.84%，RSD为1.0335%。
与现有技术相比，本发明的有益效果是:
采用HPLC对白花泡桐叶中的各项成分进行分析，通过大量试验，发现所有HPLC图谱中的11号峰为共有峰，强度较高，保留时间相对居中与其余色谱峰的分离度良好，因不确定该峰所代表的化合物，通过核磁共振技术鉴定为毛蕊花糖苷。
本发明首次在白花泡桐叶的HPLC谱图中发现非常适合做定量分析的成分，鉴定为白花泡桐叶中毛蕊花糖苷的基础上，采用HPLC法对泡桐叶中的毛蕊花糖苷进行定量分析，该方法精密度高、误差小、重现性好，实现对白花泡桐叶的质量检测，填补一项该领域的技术空白。
虽然有学者从白花泡桐花中发现了含量很低的毛蕊花糖苷(冯卫生, 吕锦锦, 张靖柯, 李孟, 张贝贝, 郑晓珂. 泡桐花中糖苷类成分及其抗氧化活性. 中成药. 2020,42(02): 369-374)，然而这种研究对首次在白花泡桐叶的HPLC谱图中发现非常适合做定量分析的成分，并鉴定为毛蕊花糖苷并无太多的借鉴作用，原因有二：
一是毛蕊花糖苷这种成分来源于不同的器官，白花泡桐的花与叶是不同的器官，不同的器官生理功能有差异、对环境的响应有差异、次生代谢产物的合成也各有侧重，从而造成其化学成分的组成差异，花中发现了较低含量的毛蕊花糖苷并不代表叶中就含有大量的毛蕊花糖苷，相反叶中可能含量更低甚至常规的分析方法根本检测不到；二是毛蕊花糖苷的获取方法有本质区别，文献报道的白花泡桐花中毛蕊花糖苷为系统分离纯化的方法获得，具有较大的偶然性，而本发明专利为通过指纹图谱找到共有的、含量大的一个色谱峰并对其进行定向分离制备鉴定而获得，这个共有的且含量大的色谱峰是什么化学成分是无法预测的。
附图说明
图1是白花泡桐叶中毛蕊花糖苷的HPLC检测图谱。
图2是19批白花泡桐叶的HPLC比对图谱。
图3是11号峰（毛蕊花糖苷）的核磁共振H谱。
图4是11号峰（毛蕊花糖苷）的核磁共振C谱。
图5是11号峰（毛蕊花糖苷）的制备色谱图。
具体实施方式
现结合具体实施例，对本发明进一步具体说明。
实施例1：
（1）对照品溶液的制备：精密称取毛蕊花糖苷适量，配制成含毛蕊花糖苷的标准溶液。
（2）供试品溶液的制备：用一定量的甲醇对白花泡桐叶进行完全提取，提取液用0.45 μm滤膜过滤。
（3）进行HPLC检测：在一定色谱条件下，先将对照品溶液进样检测，再将供试品溶液进样检测，通过比对得出供试品溶液中毛蕊花糖苷的含量，再换算成白花泡桐叶中毛蕊花糖苷的含量为2.375%。
步骤（3）中，色谱条件优选为：色谱柱：Agilent ZORBAX HC-C18(2) (4.6 mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇（B）-0.1%甲酸缓冲溶液（A）；梯度洗脱：时间变化（min）0-8-44-52-65-66-76、流动相A（%）90-68-50-0-0-90-90、流动相B（%）10-32-50-100-100-10-10；检测波长：254 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
实施例2：
（1）对照品溶液的制备：精密称取毛蕊花糖苷适量，配制成含毛蕊花糖苷的标准溶液。
（2）供试品溶液的制备：用一定量的乙醇对白花泡桐叶进行完全提取，提取液用0.45 μm滤膜过滤。
（3）进行HPLC检测：在一定色谱条件下，先将对照品溶液进样检测，再将供试品溶液进样检测，通过比对得出供试品溶液中毛蕊花糖苷的含量，再换算成白花泡桐叶中毛蕊花糖苷的含量为1.928%。
步骤（3）中，色谱条件优选为：色谱柱：Agilent ZORBAX HC-C18(2) (4.6 mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇（B）-0.1%甲酸缓冲溶液（A）；梯度洗脱：时间变化（min）0-8-44-52-65-66-76、流动相A（%）90-68-50-0-0-90-90、流动相B（%）10-32-50-100-100-10-10；检测波长：254 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
上述只是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。
Claims (1)
1.一种毛蕊花糖苷在白花泡桐叶质量检测中的应用方法，其特征在于包括以下几个步骤：
（1）对照品溶液的制备：精密称取毛蕊花糖苷适量，配制成含毛蕊花糖苷的标准溶液；
（2）供试品溶液的制备：用一定量的溶剂对白花泡桐叶进行完全提取，提取液用0.45 μm滤膜过滤；所述溶剂为甲醇或乙醇；
（3）进行HPLC检测：在一定色谱条件下，先将对照品溶液进样检测，再将供试品溶液进样检测，通过比对得出供试品溶液中毛蕊花糖苷的含量，再换算成白花泡桐叶中毛蕊花糖苷的含量；所述色谱条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX HC-C18(2)，4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相：甲醇B-0.1%甲酸缓冲溶液A；梯度洗脱：时间变化0-8-44-52-65-66-76 min、流动相A 90-68-50-0-0-90-90 %、流动相B 10-32-50-100-100-10-10 %；检测波长：254 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
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