CN111948326A - 一种桑黄指纹图谱的构建方法、指纹图谱及应用 - Google Patents

一种桑黄指纹图谱的构建方法、指纹图谱及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种桑黄指纹图谱的构建方法、指纹图谱及应用，属于食药用菌指纹图谱构建和谱效研究技术领域。本发明提供了一种桑黄指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：取桑黄醇提物制成检测样品，进行高效液相色谱分析，流动相A为0.01％乙酸‑水溶液；流动相B为乙腈，检测波长为254nm；根据高效液相色谱分析结果，构建指纹图谱。本发明所述构建方法能够实现不同品种桑黄的高效筛选，更具体地，本发明所述构建方法得到的指纹图谱能够实现杨树桑黄(Sanghuangporous vaninii)的高效筛选。

Description

一种桑黄指纹图谱的构建方法、指纹图谱及应用
技术领域
本发明涉及食药用菌指纹图谱构建和谱效研究技术领域，具体涉及一种桑黄指纹图谱的构建方法、指纹图谱及应用。
背景技术
桑黄属于真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、锈革孔菌目Hymenochaetales、锈革孔菌科Hymenochaetaceae，主要包括来自Phellinus、Inonotus、Fomitiporia和Sanghuangporous等属，是一类珍贵的药用真菌，被人们称为“森林黄金”，它主要生长在桑树、杨树和柳树等阔叶树木上，它多数呈黄色，也有极少数呈褐色或者黑色，但剖开里面都呈黄色。生长分布集中在东亚地区、中非洲以及北美洲等地区。桑黄在我国很多古书药籍中都有所记载，传统中医中，其主要治疗女子崩中带下、月闭血凝、产后血凝，男子痃癖、兼廖疗伏血、下赤血。近年来，随着现代药理学、医学等技术的快速发展，研究发现桑黄具有许多生物活性作用，如增强人体免疫力、保护肝脏、抗肿瘤、抗炎、抗氧化作用、降血糖等，而这些生物活性与其在生长过程中产生的代谢活性物质息息相关，也因此吸引了国内外诸多学者，针对活性成分的提取、纯化和活性展开了大量研究工作。
桑黄因寄生树种、栽培方式和栽培条件不同，导致桑黄品种较多、形态多样，现对于桑黄品种的判断，依旧采用表观形态，或者通过个人经验结合简单化学法测定某些化学指标(如黄酮、三萜等)加以判定，结果通常主观影响因素较大，且不确定性突出，难免造成误判；也可以采用生物学分析手段进行判断，但是耗时较长，且成本较高，专业性强。目前并没有一种能够桑黄品种的高效筛选的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桑黄指纹图谱的构建方法、指纹图谱及应用。本发明所述构建方法能够实现不同品种桑黄的高效筛选，更具体地，本发明所述构建方法得到的指纹图谱能够实现杨树桑黄(Sanghuangporous vaninii)的高效筛选。
本发明提供了一种桑黄指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
取桑黄醇提物制成检测样品，进行高效液相色谱分析，流动相A为体积百分含量为0.01％的乙酸-水溶液；流动相B为乙腈，检测波长为254nm，梯度洗脱程序为：
从0～5min，流动相A的体积百分含量为75％～75％；流动相B的体积百分含量为25％～25％；
从5～25min，流动相A的体积百分含量为75％～70％；流动相B的体积百分含量为25％～30％；
从25～60min，流动相A的体积百分含量为70％～60％；流动相B的体积百分含量为30％～40％；
从60～70min，流动相A的体积百分含量为60％～5％；流动相B的体积百分含量为40％～95％；
从70～80min，流动相A的体积百分含量为5％～5％；流动相B的体积百分含量为95％～95％；
从80～90min，流动相A的体积百分含量为5％～75％；流动相B的体积百分含量为95％～25％；
从90～100min，流动相A的体积百分含量为75％～75％；流动相B的体积百分含量为25％～25％；
根据高效液相色谱分析结果，构建指纹图谱。
优选的是，所述桑黄醇提物的制备方法包括以下步骤：
取桑黄子实体在48～52℃下烘干至水分含量低于10％，以1:20g/mL的料液比与体积百分含量为80％的乙醇水溶液混合，浸提24h，过滤，浓缩，干燥，得到桑黄醇提物。
优选的是，所述检测样品的制备方法包括以下步骤：将桑黄醇提物以20:1mg/mL的料液比与甲醇混合，过滤，得到检测样品。
优选的是，所述高效液相色谱分析中，色谱柱为YMC-PACKODS-AQ；流速为1mL/min；柱温为25℃；进样量为10μL。
本发明还提供了基于上述技术方案所述构建方法构建得到的杨树桑黄的指纹图谱，所述指纹图谱共有27个指纹峰，其相对保留时间分别为0.063min、0.070min、0.081min、0.097min、0.105min、0.124min、0.134min、0.143min、0.157min、0.182min、0.204min、0.217min、0.229min、0.280min、0.312min、0.322min、0.352min、0.390min、0.467min、0.541min、0.592min、0.660min、0.721min、0.783min、0.879min、0.916min和1.000min。
本发明还提供了上述技术方案所述指纹图谱在筛选杨树桑黄中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的指纹图谱或上述技术方案所述指纹图谱在抗肿瘤预测模型构建中的应用。
优选的是，当所述肿瘤为乳腺癌时，所述抗肿瘤预测模型如式I所示：
Y＝-0.201X1-1.299X2+0.577X3+1.762X4-1.172X5+0.705X6-1.110X7-3.099X8+6.361X9-1.278X10+1.870X11-0.726X12+0.037X13+1.604X14-1.884X15-2.384X16+2.465X17-1.536X18+2.192X19-2.245X20-0.545X21+1.625X22+0.405X23-0.111X24-1.505X25-0.386X26-0.897X27——式I；
当所述肿瘤为肝癌时，所述抗肿瘤预测模型如式II所示：
Y＝1.733X1+2.504X2-0.660X3-1.414X4-1.080X5+0.312X6+1.349X7+1.213X8-3.314X9+0.492X10-0.879X11+0.652X12-0.382X13-1.668X14+3.240X15+1.174X16-2.994X17+2.989X18-1.862X19+0.016X20+4.363X21–0.397X22-0.555X23-0.021X24-0.292X25-3.553X26+2.627X27——式II。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的指纹图谱或上述技术方案所述指纹图谱或上述技术方案所述应用构建得到的抗肿瘤预测模型在筛选抗肿瘤活性药物中的应用。
优选的是，当所述肿瘤为乳腺癌时，上述技术方案所述指纹图谱中抗乳腺癌活性从高到低的峰对应的相对保留时间分别为：0.143min、0.322min、0.541min、0.312min、0.390min、0.879min、0.070min、0.182min、0.105min、0.134min、1.000min、0.217min、0.592min、0.916min、0.063min和0.783min；
当所述肿瘤为肝癌时，上述技术方案所述指纹图谱中抗肝癌活性从高到低的峰对应的相对保留时间分别为：0.916min、0.157min、0.352min、0.467min、0.280min、0.097min、0.105min、0.204min、0.081min、0.721min、0.660min、0.229min、0.879min和0.783min。
本发明提供了一种桑黄指纹图谱的构建方法。本发明所述方法构建得到的指纹图谱能够实现桑黄品种的快速、高效筛选，且方法稳定和易于掌握。具体地，本发明所述构建方法得到的指纹图谱能够实现杨树桑黄(Sanghuangporousvaninii)的高效筛选。本发明构建方法得到的指纹图谱能够用于抗肿瘤预测模型的构建和抗肿瘤活性药物的筛选，即可以对桑黄药用活性价值进行评价，结合指纹图谱研究可以为桑黄产业相关质量标准的制定奠定科学基础。
附图说明
图1为本发明提供的32个桑黄醇提物样品色谱图；
图2为本发明提供的桑黄醇提物指纹图谱(A)和对照指纹图谱中的共有指纹峰(B)；
图3为本发明提供的不同浓度32个桑黄醇提物样品对MCF-7细胞抑制率；
图4为本发明提供的不同浓度32个桑黄醇提物样品对HepG2细胞抑制率；
图5为本发明提供的抗MCF-7细胞预测模型因变量(标准化实际值)与回归标准化预测值对比散点图；
图6为本发明提供的抗MCF-7细胞预测模型回归系数柱状图；
图7为本发明提供的抗HepG2细胞预测模型因变量(实际值)与预测值的散点图；
图8为本发明提供的抗HepG2细胞预测模型回归系数柱状图。
具体实施方式
本发明提供了一种桑黄指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
取桑黄醇提物制成检测样品，进行高效液相色谱分析，流动相A为体积百分含量为0.01％的乙酸-水溶液；流动相B为乙腈，检测波长为254nm，梯度洗脱程序为：
从0～5min，流动相A的体积百分含量为75％～75％；流动相B的体积百分含量为25％～25％；
从5～25min，流动相A的体积百分含量为75％～70％；流动相B的体积百分含量为25％～30％；
从25～60min，流动相A的体积百分含量为70％～60％；流动相B的体积百分含量为30％～40％；
从60～70min，流动相A的体积百分含量为60％～5％；流动相B的体积百分含量为40％～95％；
从70～80min，流动相A的体积百分含量为5％～5％；流动相B的体积百分含量为95％～95％；
从80～90min，流动相A的体积百分含量为5％～75％；流动相B的体积百分含量为95％～25％；
从90～100min，流动相A的体积百分含量为75％～75％；流动相B的体积百分含量为25％～25％；
根据高效液相色谱分析结果，构建指纹图谱。在本发明中，所述指纹图谱优选采用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行制作。本发明上述条件参数的提供能够是本发明构建方法稳定、分离得到的成分丰富且易于操作。
在本发明中，所述桑黄醇提物的制备方法优选包括以下步骤：
取桑黄子实体在48～52℃下烘干至水分含量低于10％，以1:20g/mL的料液比与体积百分含量为80％的乙醇水溶液混合，浸提24h，过滤，浓缩，干燥，得到桑黄醇提物。本发明对所述桑黄子实体进行处理前，优选对桑黄子实体进行粉碎。本发明在所述烘干后，优选将桑黄子实体剪成长宽高均为0.5cm左右大小的颗粒。在本发明中，所述浓缩的方法优选为旋转蒸发浓缩法。本发明所述干燥的方法优选为冷冻干燥法。本发明对上述方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的常规方法即可。
在本发明中，所述检测样品的制备方法包括以下步骤：将桑黄醇提物以20:1mg/mL的料液比与甲醇混合，过滤，得到检测样品。在本发明中，所述过滤优选为使用0.22μm微孔滤膜过滤。本发明所述混合优选进行涡旋溶解。
在本发明中，所述高效液相色谱分析中，色谱柱优选为YMC-PACK ODS-AQ；流速优选为1mL/min；柱温优选为25℃；进样量优选为10μL。
本发明还提供了基于上述技术方案所述构建方法构建得到的杨树桑黄的指纹图谱，所述指纹图谱共有27个指纹峰，其相对保留时间分别为0.063min、0.070min、0.081min、0.097min、0.105min、0.124min、0.134min、0.143min、0.157min、0.182min、0.204min、0.217min、0.229min、0.280min、0.312min、0.322min、0.352min、0.390min、0.467min、0.541min、0.592min、0.660min、0.721min、0.783min、0.879min、0.916min和1.000min。
本发明还提供了上述技术方案所述指纹图谱在筛选杨树桑黄中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的指纹图谱或上述技术方案所述指纹图谱在抗肿瘤预测模型构建中的应用。在本发明中，所述模型的构建优选通过结合多元线性回归分析方法进行建立。桑黄的成分复杂，目前从桑黄菌子实体中分离得到的活性成分主要包括多酚类(其中包括黄酮类)、萜类、甾体类等次级代谢产物，以及多糖、多肽等初级代谢产物。对于活性研究，研究人员通常将分离得到的代谢产物进行单一活性验证，忽略了多组分协同作用；或直接利用粗提物进行活性验证。本发明将多元线性回归分析方法应用于桑黄生物活性(抗肿瘤活性)研究中，可以对其药用活性价值进行评价，结合指纹图谱研究可以为桑黄产业相关质量标准的制定奠定科学基础。
本发明优选将HPLC指纹图谱中的色谱峰峰面积同时为自变量，以抗肿瘤细胞活性IC50作为因变量，利用SPSS16.0软件进行多元线性回归分析。
在本发明中，当所述肿瘤为乳腺癌时，所述抗肿瘤预测模型优选如式I所示：
Y＝-0.201X1-1.299X2+0.577X3+1.762X4-1.172X5+0.705X6-1.110X7-3.099X8+6.361X9-1.278X10+1.870X11-0.726X12+0.037X13+1.604X14-1.884X15-2.384X16+2.465X17-1.536X18+2.192X19-2.245X20-0.545X21+1.625X22+0.405X23-0.111X24-1.505X25-0.386X26-0.897X27——式I；
当所述肿瘤为肝癌时，所述抗肿瘤预测模型如式II所示：
Y＝1.733X1+2.504X2-0.660X3-1.414X4-1.080X5+0.312X6+1.349X7+1.213X8-3.314X9+0.492X10-0.879X11+0.652X12-0.382X13-1.668X14+3.240X15+1.174X16-2.994X17+2.989X18-1.862X19+0.016X20+4.363X21–0.397X22-0.555X23-0.021X24-0.292X25-3.553X26+2.627X27——式II。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的指纹图谱或上述技术方案所述指纹图谱或上述技术方案所述应用构建得到的抗肿瘤预测模型在筛选抗肿瘤活性药物中的应用。
在本发明中，当所述肿瘤为乳腺癌时，上述技术方案所述指纹图谱中抗乳腺癌活性从高到低的峰对应的相对保留时间分别为：0.143min、0.322min、0.541min、0.312min、0.390min、0.879min、0.070min、0.182min、0.105min、0.134min、1.000min、0.217min、0.592min、0.916min、0.063min和0.783min(即peak8>peak16>peak20>peak15>peak18>peak25>peak2>peak10>peak5>peak7>peak27>peak12>peak21>peak26>peak01>peak24)。在本发明中，所述乳腺癌优选使用MCF-7细胞进行筛选实验。对于抗MCF-7细胞活性贡献较为突出的成分主要是peak8、peak16和peak20。
当所述肿瘤为肝癌时，上述技术方案所述指纹图谱中抗肝癌活性从高到低的峰对应的相对保留时间分别为：0.916min、0.157min、0.352min、0.467min、0.280min、0.097min、0.105min、0.204min、0.081min、0.721min、0.660min、0.229min、0.879min和0.783min(即peak26>peak9>peak17>peak19>peak14>peak4>peak5>peak11>peak3>peak23>peak22>peak13>peak25>peak24)。在本发明中，所述肝癌优选使用HepG2细胞进行筛选实验。起主要活性作用的成分分别为peak26、peak9和peak17。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种桑黄指纹图谱的构建方法、指纹图谱及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
本发明以32种不同批次、菌龄和产地的杨树桑黄(S.vaninii)子实体为研究对象，将样品粉碎后，通过乙醇水溶液浸提浓缩干燥得到醇提物，对醇提物进行高效液相色谱(HPLC)分析，将结果导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”建立HPLC指纹图谱；对32种桑黄醇提物样品进行谱效关系分析，基于样品的HPLC结果与活性数据，结合多元线性回归建立抗肿瘤活性预测模型。具体操作参见实施例。
实施例1
桑黄指纹图谱的构建
1样品的采集和桑黄醇提物制备
桑黄子实体(均为杨树桑黄)样品产地安徽金寨和江苏南京，分别有1年、2年、3年、4年四种菌龄(详见表1)。将收集到桑黄子实体50±2℃烘干至水分含量低于10％，剪成长宽高均约0.5cm大小颗粒，取10g于200mL80％乙醇溶液中浸提24小时，过滤得到醇提物溶液，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后备用。
表1桑黄子实体样品信息
Figure BDA0002629022380000081
Figure BDA0002629022380000091
2高效液相色谱(HPLC)分析方法
样品配制：准确称取20.0mg桑黄醇提物于1mL离心管中，加入1mL甲醇涡旋溶解，0.22μm微孔滤膜过滤后，进行HPLC分析。
色谱柱：YMC-PACKODS-AQ；
流动相A：0.01％乙酸-水溶液；流动相B：乙腈；
流速：1mL/min；
柱温：25℃；
进样量：10μL；
检测波长：254nm；
洗脱程序：采用梯度洗脱模式，程序如表2所示。
表2梯度洗脱程序
Figure BDA0002629022380000092
3HPLC指纹图谱建立
利用高效液相色谱分析软件提取32个桑黄醇提物样品在254nm处色谱分析结果(如图1所示)，导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”软件(下称“指纹图谱软件”)中，从图1可知色谱峰主要集中在前40min，因此在指纹图谱软件中进行数据剪切，截取0～40min做构建指纹图谱；“设参照谱”选取时间窗框度为0.20min，以中位数生成，经过多点校正后自动匹配，最终生成对照指纹图谱，结果如图2中的A所示。
通过指纹图谱软件读取匹配数据，可以得到桑黄醇提物共有指纹峰27个，将其绘制于“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”生成的对照指纹图谱(R)，结果如图2中的B所示，他们的出峰时间如表3所示；计算32个桑黄醇提物样品的HPLC测定结果与共有模式的相似度，结果如表4所示，相似度均在0.906以上，表明个批次桑黄醇提物质量稳定，所建指纹图谱可信。
表3桑黄醇提物共有指纹峰出峰时间和相对保留时间(单位：min)
Figure BDA0002629022380000101
Figure BDA0002629022380000111
表4 32个桑黄醇提物样品HPLC结果与对照指纹图谱(R)相似度结果
Figure BDA0002629022380000112
实施例2
抗肿瘤预测模型构建
1抑制肿瘤细胞生长试验
选择人乳腺癌细胞(MCF-7)和人肝癌细胞(HepG2)进行抑制肿瘤细胞生长试验研究。
将32个桑黄醇提物样品在无菌条件下用DMSO溶液分别配制成40mg/mL、20mg/mL、10mg/mL、2mg/mL、1mg/mL和0.4mg/mL的样品溶液，备用。
DMEM培养基的配制：每升MEM培养基中加入100mL胎牛血清，1％双抗10mL，青霉素3mg/mL，链霉素5mg/mL，0.22μm滤膜过滤分装，于4℃保存。
取对数期的MCF-7和HepG2细胞，用磷酸缓冲溶液(PBS)润洗后加入1mL胰酶，在37℃下消化2～3min，先加入2mLDMEM培养基终止消化，随后根据细胞的生长情况，用DMEM培养基将两种细胞稀释成2×105个/mL的细胞悬液。将两种细胞悬液分别加入96孔培养板中，每孔199μL，12小时后再分别加入1μL的DMSO溶液、阳性对照物(杨树桑黄Staurosporine)和试验样品溶液，此时试验样品溶液中桑黄醇提物的实际作用浓度分别为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、10μg/ml、5μg/ml和2μg/ml。反应48～72h后，加入20μLAlamar-Blue检测试剂和180μLDMEM培养基，5h后分别于570nm和600nm处测定吸光度。然后由测得的吸光度计算抑制率：
抑制率(％)＝(A实验组/A对照组)×100
通过测定不同样品浓度对MCF-7和HepG2细胞生长的抑制能力得到的数据绘制为柱状图(图3和图4)，从图中可以看出，活性大小依赖样品浓度，同时，较高浓度下的样品活性与阳性对照物的活性具有可比性，因此这批桑黄样品具有抑制MCF-7和HepG2细胞生长的能力。通过绘制浓度-抑制率曲线计算得到样品的半数杀伤浓度，即IC50值，结果如表5所示，抑制HepG2和MCF-7细胞的IC50值分别处于22.83～1839.28μg/mL和18.18～2016μg/mL，直观展示出，对于同一品种不同产地和菌龄，它们的抗肿瘤活性差异明显，这与其成分含量差异密切相关。
表5 32个样品抑制HepG2和MCF-7细胞的IC50值(单位：μg/mL)
Figure BDA0002629022380000121
Figure BDA0002629022380000131
2抗肿瘤多元线性回归预测模型建立
2.1抑制MCF-7肿瘤细胞增殖预测模型建立
将各桑黄醇提物HPLC指纹图谱中的27个色谱峰(peak1～peak27)峰面积同时为自变量，以抗MCF-7细胞活性IC50作为因变量，利用SPSS16.0软件进行多元线性回归分析。
先对数据进行标准化，去量纲化，然后进行多元线性回归分析，方法采用输入模式(Enter)，回归结果显示，模型的相关系数R＝0.941，决定系数R2＝0.886，标准估算误差为0.941，决定系数越高(趋近于1)，代表可以被解释的程度越高，回归模型的效果越好，因此可以判断该模型具有较强的预测能力。
通过回归分析模型的预测结果绘制了因变量(实际值)与预测值的散点图(图5)，可以发现，预测值和实际值呈线性关系，数据点分布与45度线附近，说明模型拥有很好的预测能力。通过回归得到的模型方程为：
Y＝-0.201X1-1.299X2+0.577X3+1.762X4-1.172X5+0.705X6-1.110X7-3.099X8+6.361X9-1.278X10+1.870X11-0.726X12+0.037X13+1.604X14-1.884X15-2.384X16+2.465X17-1.536X18+2.192X19-2.245X20-0.545X21+1.625X22+0.405X23-0.111X24-1.505X25-0.386X26-0.897X27——式I。
回归系数的绝对值是自变量对应变量所作贡献，即为一个权重值，是代表自变量与因变量相关程度的值。对回归系数绘制为柱状图(图6)则可以直观的看出在抑制MCF-7细胞生长的能力方面起主要活性作用的峰。模型的回归系数为正则该峰的峰面积与抑制MCF-7细胞生长能力的IC50值呈正相关，反之，则为负相关；模型的回归系数的大小决定该峰的峰面积与抑制MCF-7细胞生长能力的IC50值相关性的大小。IC50值越低，样品的抗MCF-7细胞活性越好，即同IC50值呈负相关的峰与抗MCF-7细胞活性成正相关，以此作为重要活性成分筛选依据。
对所有的负相关系数的峰依据负相关系数的大小进行排序(表6)，结果如下：peak8>peak16>peak20>peak15>peak18>peak25>peak2>peak10>peak5>peak7>peak27>peak12>peak21>peak26>peak01>peak24。因此，对于抗MCF-7细胞活性贡献较为突出的成分主要是peak8、peak16和peak20。
表6所有负相关系数的峰对应的显著性统计结果
Figure BDA0002629022380000141
2.2抗HepG2细胞预测模型建立
采用抗MCF-7细胞预测模型建立同样的方法，建立抗HepG2细胞预测模型，先对数据进行标准化，目的是去量纲，然后进行多元线性回归分析。回归的的结果如下所示：R＝0.940，R2＝0.884，标准估算的误差0.949，结果可以判断模型亦具有较强的预测能力。多元线性回归分析得到模型方程为：
Y＝1.733X1+2.504X2-0.660X3-1.414X4-1.080X5+0.312X6+1.349X7+1.213X8-3.314X9+0.492X10-0.879X11+0.652X12-0.382X13-1.668X14+3.240X15+1.174X16-2.994X17+2.989X18-1.862X19+0.016X20+4.363X21–0.397X22-0.555X23-0.021X24-0.292X25-3.553X26+2.627X27——式II。
通过回归分析模型的预测结果绘制了因变量(实际值)与预测值的散点图(图7)，预测值和实际值呈线性关系，数据点分布与45度线附近，说明模型拥有很好的预测能力。
将桑黄次级代谢产物指纹图谱中的27个峰与IC50值回归分析结果中的回归系数绘制为柱状图(图8)则可以直观的看出在抑制HepG2细胞生长的能力方面起主要活性作用的峰。模型的因变量是抑制HepG2细胞生长能力的IC50值，IC50值越低，样品的抗HepG2活性越好，即同IC50值呈负相关的峰与抗HepG2活性成正相关。
对所有的负相关系数的峰依据负相关系数的大小进行排序(表7)，结果如下：peak26>peak9>peak17>peak19>peak14>peak4>peak5>peak11>peak3>peak23>peak22>peak13>peak25>peak24；因此，通过回归系数可以推断，起主要活性作用的成分分别为peak26、peak9和peak17。
表7所有负相关系数的峰对应的显著性统计结果
Figure BDA0002629022380000151
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种桑黄指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
取桑黄醇提物制成检测样品，进行高效液相色谱分析，流动相A为体积百分含量为0.01％的乙酸-水溶液；流动相B为乙腈，检测波长为254nm，梯度洗脱程序为：
从0～5min，流动相A的体积百分含量为75％～75％；流动相B的体积百分含量为25％～25％；
从5～25min，流动相A的体积百分含量为75％～70％；流动相B的体积百分含量为25％～30％；
从25～60min，流动相A的体积百分含量为70％～60％；流动相B的体积百分含量为30％～40％；
从60～70min，流动相A的体积百分含量为60％～5％；流动相B的体积百分含量为40％～95％；
从70～80min，流动相A的体积百分含量为5％～5％；流动相B的体积百分含量为95％～95％；
从80～90min，流动相A的体积百分含量为5％～75％；流动相B的体积百分含量为95％～25％；
从90～100min，流动相A的体积百分含量为75％～75％；流动相B的体积百分含量为25％～25％；
根据高效液相色谱分析结果，构建指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述桑黄醇提物的制备方法包括以下步骤：
取桑黄子实体在48～52℃下烘干至水分含量低于10％，以1:20g/mL的料液比与体积百分含量为80％的乙醇水溶液混合，浸提24h，过滤，浓缩，干燥，得到桑黄醇提物。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述检测样品的制备方法包括以下步骤：将桑黄醇提物以20:1mg/mL的料液比与甲醇混合，过滤，得到检测样品。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱分析中，色谱柱为YMC-PACK ODS-AQ；流速为1mL/min；柱温为25℃；进样量为10μL。
5.基于权利要求1～4任一项所述构建方法构建得到的杨树桑黄的指纹图谱，其特征在于，所述指纹图谱共有27个指纹峰，其相对保留时间分别为0.063min、0.070min、0.081min、0.097min、0.105min、0.124min、0.134min、0.143min、0.157min、0.182min、0.204min、0.217min、0.229min、0.280min、0.312min、0.322min、0.352min、0.390min、0.467min、0.541min、0.592min、0.660min、0.721min、0.783min、0.879min、0.916min和1.000min。
6.权利要求5所述指纹图谱在筛选杨树桑黄中的应用。
7.权利要求1～4任一项所述构建方法构建得到的指纹图谱或权利要求5所述指纹图谱在抗肿瘤预测模型构建中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，当所述肿瘤为乳腺癌时，所述抗肿瘤预测模型如式I所示：
Y＝-0.201X1-1.299X2+0.577X3+1.762X4-1.172X5+0.705X6-1.110X7-3.099X8+6.361X9-1.278X10+1.870X11-0.726X12+0.037X13+1.604X14-1.884X15-2.384X16+2.465X17-1.536X18+2.192X19-2.245X20-0.545X21+1.625X22+0.405X23-0.111X24-1.505X25-0.386X26-0.897X27——式I；
当所述肿瘤为肝癌时，所述抗肿瘤预测模型如式II所示：
Y＝1.733X1+2.504X2-0.660X3-1.414X4-1.080X5+0.312X6+1.349X7+1.213X8-3.314X9+0.492X10-0.879X11+0.652X12-0.382X13-1.668X14+3.240X15+1.174X16-2.994X17+2.989X18-1.862X19+0.016X20+4.363X21–0.397X22-0.555X23-0.021X24-0.292X25-3.553X26+2.627X27——式II。
9.权利要求1～4任一项所述构建方法构建得到的指纹图谱或权利要求5所述指纹图谱或权利要求7所述应用构建得到的抗肿瘤预测模型在筛选抗肿瘤活性药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，当所述肿瘤为乳腺癌时，权利要求5所述指纹图谱中抗乳腺癌活性从高到低的峰对应的相对保留时间分别为：0.143min、0.322min、0.541min、0.312min、0.390min、0.879min、0.070min、0.182min、0.105min、0.134min、1.000min、0.217min、0.592min、0.916min、0.063min和0.783min；
当所述肿瘤为肝癌时，权利要求5所述指纹图谱中抗肝癌活性从高到低的峰对应的相对保留时间分别为：0.916min、0.157min、0.352min、0.467min、0.280min、0.097min、0.105min、0.204min、0.081min、0.721min、0.660min、0.229min、0.879min和0.783min。
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