CN111840408B - 一种具有抗炎功效的酸浆提取物的质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法，包括粉碎过筛步骤、制备提取液步骤、浓缩步骤和冷冻干燥步骤，工艺简单，提取溶剂单一安全，可回收，无有毒试剂引入，对环境无污染，其工艺有利于大生产，无冗杂步骤，对环境无污染，并且所制备物质活性明显，可以作为功效性护肤品及医药辅助用品的活性成分，起到抗炎舒敏等作用。本发明还公开了一种具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法，建立了以木犀草苷含量为酸浆提取物的质量评价标准，具有合理性，方法可靠。

Description

一种具有抗炎功效的酸浆提取物的质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法及检测方法。
背景技术
酸浆(锦灯笼)为茄科植物酸浆(Ph.alkekengi L.var.franchetii(Mast.)Makino) 的干燥宿尊或带果实的宿萼。果实为圆球形浆果，成熟时呈橙红色，外有膨大的花萼如灯笼状疏松地包围在浆果之外，故又有红姑娘、挂金灯等美称。最早收录于《神农本草经》，被列为中品，具有除烦热，定志益气，利尿等功效，并且在《证类本草》、《新修本草》、《本草纲目拾遗》等多部古代本草学中对其性状、功效均有记录。酸浆果实具有丰富的营养成分，具备很好的食用价值，在北方民间百姓会在深秋或者初冬的时候，将酸浆果实穿成串挂在屋檐下，等到霜冻之后，食用其浆果。
化学成分研究：
近年来对酸浆的现代化研究报道较多，到目前为止，国内外的很多学者在该属植物的全草、果实、宿萼和茎叶等部分共分离得到了一百多个化合物，主要包括甾体类(主要为酸浆苦味素类和睡茄内酯类)、甾醇类、黄酮类、生物碱、有机酸、类胡萝卜素、色素类、氨基酸、三萜类、倍半萜类和多糖等多种类型的化合物。其中甾体类(酸浆苦味素类)和黄酮类(木犀草类)化合物是近年研究的热点。
药理作用研究：
酸浆是我国医书中记载的一种常用中药，本属植物在民间常被用来治疗类风湿性关节炎、皮炎、前列腺炎以及上呼吸道感染感染等疾病，具有清热解毒、利咽、化痰、利尿作用，对化脓扁桃体炎，疱疹性咽炎均有较好的疗效。临床上应用花萼和果实治疗咽炎、淋病、痢疾及高血压等并已有报道。现代药理研究表明，酸浆还具有扩张呼吸器官、抗乙肝病毒、抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂、抗寄生虫、抗氧化、抗菌、抗过敏以及强心等方面的诸多生物活性。
炎症的研究概述：
炎症，即具血管系统的活体组织对外源性以及内源性刺激所做的防御反应，NO 在炎症的发生及信号传导中起到了关键的调节作用，过量的NO会引起多种炎症的发生发展。目前较经典的方法是利用LPS诱导建立巨噬细胞(RAW264.7)的炎症模型来研究药物的抗炎作用和机制：巨噬细胞在炎性反应过程的中能够通过产生多种不同的细胞因子和炎症介质，直接或间接参与各种炎症性疾病的反应过程，当受到细胞外LPS等炎性刺激物刺激后，产生应答启动细胞内一系列信号蛋白的激活引起级联反应，调控炎症的发生发展。
目前对于酸浆活性成分提取分离手段主要通过醇提后，采用有机溶剂系统萃取的方式，再分别对不同部位进行柱层析分离，得到有效成分会将二氯甲烷、乙酸乙酯等有机试剂引入其中[季龙.两种酸浆属植物中活性迈克尔反应受体分子的发现及作用靶点[D].杭州:浙江大学,2013；张秀芝.锦灯笼有效成分抗炎作用实验研究[D].吉林:吉林大学,2008；张楠，储小琴.锦灯笼醋酸乙酯部位化学成分的研究[J].中草药,2015,46(8):1120-1124]。毒性较大，往往不利于大生产，在生产过程中会产生污染，并且之后亦需要除去所引入的有毒试剂，过程冗长，工艺复杂。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法，工艺简单，提取溶剂单一安全，可回收，无有毒试剂引入，对环境无污染。制备的酸浆提取物活性明显，可以作为功效性护肤品及医药辅助用品的活性成分，起到抗炎舒敏等作用。
本发明的另外一个目的是提供一种具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法，可以有效评价酸浆提取物的质量。
实现上述目的一种技术方案是：一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎过筛步骤：将酸浆宿萼干燥粉碎，过4～8号筛；
S2，制备提取液步骤：将粉碎后的酸浆宿萼用水或乙醇或乙醇水溶液作为提取溶剂进行提取，得提取液；
S3，浓缩步骤：合并提取液并减压浓缩至无醇味，得浓缩液；
S4，冷冻干燥步骤：使用冻干机将浓缩液进行低温干燥，得固体状酸浆提取物。
上述的一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法，步骤S2中，将粉碎后的酸浆宿萼用水或乙醇或乙醇水溶液作为提取溶剂进行加热回流提取。
上述的一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法，步骤S2中，粉碎后的酸浆宿萼与提取溶剂的料液比为1:5g/mL～1:15g/mL，提取温度为50℃～90℃，提取时间为1h～3h，提取次数为1～3次。
上述的一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法，所述酸浆提取物的得率≥14.11％，所述酸浆提取物中木犀草苷的含量≥0.83％。
本发明还提供了一种具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法，包括以下步骤：
SA，木犀草苷对照品溶液制备步骤：称取木犀草苷对照品，将其溶解于体积浓度为50～100％的甲醇水溶液制成木犀草苷对照品溶液；
SB，供试品溶液制备步骤：称取如权利要求1所述的具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法制得的酸浆提取物5mg～10mg，将其溶解于体积浓度为50～100％的甲醇水溶液制得供试品溶液；
SC，过滤步骤：将所述木犀草苷对照品溶液与供试品溶液分别用0.22μm的微孔滤膜过滤；
SD，线性相关性考察步骤：将所述木犀草苷对照品溶液倍比稀释，注入高效液相色谱仪进行分析，以每个对照品的进样浓度Y为纵坐标，峰面积值X为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程及线性范围；
SE，酸浆提取物中木犀草苷含量确定步骤：吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，通过木犀草苷对照品溶液的色谱峰和待检测的供试品溶液的色谱峰对比，以线性回归方程计算，得所述酸浆提取物中木犀草苷的含量，对酸浆提取物的质量进行控制。
上述的一种具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法，其中，所述木犀草苷对照品溶液的浓度为226μg/mL。
上述的一种具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法，步骤D和步骤E中，所述高效液相色谱仪的参数如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-AQ C18(4.6mm×250mm，5μm)；
检测波长：203nm；
柱温：30℃；
流速1.0mL·min-1；
流动相：A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，洗脱条件见表1：
表1.HPLC流动相洗脱条件
时间(min) 流动相B％
0 5
0-10 20
10-15 20
15-25 35
25-45 49
45-65 99
所述木犀草苷对照品溶液倍比稀释后，浓度在7.0mg/L～226.0mg/L呈线性，线性回归方程为：
Y＝0.0484X-2.4052，R2＝0.9999。
本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法的技术方案，工艺简单，提取溶剂单一安全，可回收，无有毒试剂引入，对环境无污染，其工艺有利于大生产，无冗杂步骤，对环境无污染，并且所制备物质活性明显，可以作为功效性护肤品及医药辅助用品的活性成分，起到抗炎舒敏等作用。
本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法的技术方案，由于木犀草苷具有多种药理活性，如消炎、抗过敏、抑菌等，这与酸浆的多种功效相关，为此建立了以木犀草苷含量为酸浆提取物的质量评价标准。
附图说明
图1为酸浆提取物指纹图谱与木犀草苷对照品的HPLC色谱图；
图2为木犀草苷线性关系图谱；
图3为多批酸浆提取物的指纹图谱；
图4A为酸浆提取物对细胞活性安全范围考察结果图；
图4B为不同浓度酸浆提取物抗炎作用图；
图5A为100μg/mL酸浆提取物对细胞活性影响图；
图5B为100μg/mL酸浆提取物与阳性对照相比抗炎作用图；
图6为酸浆提取物抗炎作用IC50值结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
实施例1：
本发明的实施例，一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎过筛步骤：将酸浆宿萼干燥粉碎，过4～8号筛；
S2，制备提取液步骤：精密称定粉碎后的酸浆宿萼100g，置于1000mL烧瓶中，精密加入体积浓度为50％的乙醇水溶液500mL，加热回流1h，提取3次，加热温度 80℃，合并滤液，趁热过滤，得到提取液；
S3，浓缩步骤：合并提取液并减压浓缩至无醇味，得浓缩液；
S4，冷冻干燥步骤：使用冻干机将浓缩液进行低温干燥，得固体状酸浆提取物，经测算其得率为16.36％。
请参阅图1、图2和图3，一种具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法，包括以下步骤：
A，木犀草苷对照品溶液制备步骤：称取木犀草苷对照品，将其溶解于体积浓度为80％甲醇水溶液制成木犀草苷对照品溶液；木犀草苷对照品溶液的浓度为 226μg/mL；
B，供试品溶液制备步骤：称取采用本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法制得的酸浆提取物适量，将其溶解于体积浓度为80％的甲醇水溶液制得供试品溶液；
C，过滤步骤：将所述木犀草苷对照品溶液与供试品溶液分别用0.22μm的微孔滤膜过滤；
D，线性相关性考察步骤：将所述木犀草苷对照品溶液倍比稀释，注入高效液相色谱仪进行分析，进样量10μL，以每个对照品的进样浓度Y为纵坐标，峰面积值X为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程及线性范围；高效液相色谱仪的参数如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-AQ C18(4.6mm×250mm，5μm)；
检测波长：203nm；
柱温：30℃；
流速1.0mL·min-1；
流动相：A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，HPLC流动相洗脱条件见表1：
时间(min) 流动相B％
0 5
0-10 20
10-15 20
15-25 35
25-45 49
45-65 99
表1
请参阅图2，木犀草苷对照品溶液倍比稀释后，浓度在7.0mg/L～226.0mg/L呈线性，线性回归方程为：
Y＝0.0484X-2.4052，R2＝0.9999。
E，酸浆提取物中木犀草苷含量确定步骤：吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，通过木犀草苷对照品溶液的色谱峰和待检测的供试品溶液的色谱峰对比 (见图1)，以线性回归方程计算，得所述酸浆提取物中木犀草苷的含量，对酸浆提取物的质量进行控制。
精密度试验
精密吸取木犀草苷对照品溶液，连续进样6次，进样量10μL。记录其峰面积，测得木犀草苷峰面积的RSD为0.98％，说明仪器的精密度良好，进样批次与峰面积结果如表2所示：
批号 1 2 3 4 5 6 RSD％
峰面积 2420.89 2391.95 2419.45 2426.23 2420.23 2366.30 0.98
表2
重复性试验：
取同一批号的酸浆提取物样品6份，每份约10g，精密称定，分别按供试品溶液制备步骤制备相应的供试品溶液，分别进样测定峰面积，计算木犀草苷含量。木犀草苷的平均含量为1.14％，RSD为2.7％。批次间重复性结果如表3所示，结果表明本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法的重复性良好。
批号 1 2 3 4 5 6 RSD％
含量 1.10 1.11 1.19 1.15 1.16 1.15 2.70％
表3
稳定性试验：
精密吸取供试品溶液，室温下分别在0、2、4、8、12、24h进样测定，进样量10μL。记录其峰面积，测得木犀草苷峰面积的RSD为0.98％，时间与峰面积的结果表4所示，说明本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法的稳定性良好。
时间h 0 2 4 8 12 24 RSD％
峰面积 1173.93 1170.36 1164.70 1178.44 1164.81 1178.59 1.07
表4
加样回收率试验：
精密称取已知含量样品6份，每份约20mg，置于10mL容量瓶中，分别加入木犀草苷对照品0.22mg，按供试品溶液制备步骤制备，按色谱条件进行测定，记录其峰面积。加样回收率实验结果如表5所示，木犀草苷的平均回收率为99.13％，RSD 为1.99％，说明本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法加样回收率结果良好，符合要求。
Figure GDA0003110665090000081
表5
含量测定：
采用本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法对任意一批次药材进行木犀草苷的含量测定，结果显示，通过多次进样得到木犀草苷的平均含量为0.98％。多批次的酸浆提取物的指纹图谱见图3。
实施例2：
一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎过筛步骤：将酸浆宿萼干燥粉碎，过4～8号筛；
S2，制备提取液步骤：精密称定粉碎后的酸浆宿萼50g，置于1000mL烧瓶中，精密加入体积浓度为80％的乙醇水溶液400mL，加热回流2h，提取1次，加热温度 60℃，趁热过滤，得到提取液；
S3，浓缩步骤：合并提取液并减压浓缩至无醇味，得浓缩液；
S4，冷冻干燥步骤：使用冻干机将浓缩液进行低温干燥，得固体状酸浆提取物，经测算其得率为18.44％；
取冻干制得的酸浆提取物适量于培养基中溶解，待用。
细胞活性测试：
请参阅图4，采用CCK-8法检测酸浆提取物对细胞活性影响：选择小鼠巨噬细胞RAW264.7，细胞铺于96孔板，接种初始细胞数目1×104～1×105个，待细胞长至实验需求数目后，与不同浓度酸浆提取物共孵育，样品与对照品浓度设置见表6，继续培养24h。收集上清，CCK-8检测试剂盒检测不同浓度的样品对细胞活性的影响，在450nm处运用酶标仪检测吸光值，测得其给药安全浓度范围。酸浆提取物对细胞活性安全范围考察结果图如图4A所示。
抗炎功效测试：
选择小鼠巨噬细胞RAW264.7，细胞铺于96孔板，接种初始细胞数目 1×104～1×105个，待细胞长至实验需求数目后，不同浓度酸浆提取物及阳性药干预 1h，药物干预1h后，加入LPS脂多糖，继续培养24h。收集上清，NO试剂盒检测样本抑制NO生成能力在540nm处检测其吸光值，进而取得抗炎实验数据。不同浓度酸浆提取物抗炎作用结果如图4B所示。
Figure GDA0003110665090000091
表6
通过对酸浆提取物浓度范围考察，确定了酸浆安全实施浓度范围，并且确定酸浆提取物最佳使用浓度，选取酸浆提取物100μg/mL，阳性药地塞米松磷酸钠 10μg/mL，分别设置空白组，阳性对照组，酸浆提取物样品组，实验方法与上述方法相同，分别用CCK-8检测试剂盒与NO试剂盒进行细胞活性测试与抗炎功效测试。 100μg/mL酸浆提取物对细胞活性影响图如图5A所示；100μg/mL酸浆提取物与阳性对照相比抗炎作用图如图5B所示；酸浆提取物抗炎作用IC50值结果图如图6所示。
从图5A、图5B和图6结果显示，本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的提取方法制备的酸浆提取物与阳性药对比，抗炎功效显著，效果明显。且通过CCK-8 结果显示在浓度250μg/mL范围内，对细胞生殖无影响。经过测算酸浆提取物对NO 生成的IC50值为22.37±1.31μg/mL。
实施例3：
一种具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎过筛步骤：将酸浆宿萼干燥粉碎，过4～8号筛；
S2，制备提取液步骤：精密称定粉碎后的酸浆宿萼10g，置于100mL烧瓶中，精密加入体积浓度为60％的乙醇水溶液60mL，加热回流3h，提取3次，加热温度 70℃，合并滤液，趁热过滤，得到提取液；
S3，浓缩步骤：合并提取液并减压浓缩至无醇味，得浓缩液；
S4，冷冻干燥步骤：使用冻干机将浓缩液进行低温干燥，得固体状酸浆提取物，经测算其得率为15.62％。
一种具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法，步骤与实施例1中的相同，区别在于：
A，木犀草苷对照品溶液制备步骤：称取木犀草苷对照品，将其溶解于甲醇中制成木犀草苷对照品溶液；木犀草苷对照品溶液的浓度为226μg/mL；
B，供试品溶液制备步骤：称取采用本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法制得的酸浆提取物适量，将其溶解于体积浓度为70％的甲醇水溶液制得供试品溶液。
采用本发明的一种具有抗炎活性的酸浆提取物的制备方法，将收集到的7批酸浆宿萼药材进行制备制得酸浆提取物，再根据本发明的一种具有抗炎活性的酸浆提取物的检测方法中关于木犀草苷的含量测定方法，测定每批次酸浆提取物中木犀草苷的峰面积，计算其含量，并对其质量进行控制，结果如表7所示。
批次 木犀草苷含量％
1 0.98
2 0.99
3 1.05
4 1.44
5 1.39
6 0.77
7 0.68
表7
《中国药典》规定，锦灯笼以木犀草苷含量计算不得少于0.1％。本发明所使用制备方法和检测方法测得7批酸浆提取物样品含量值范围为0.679％～1.441％，平均值为1.04％，按照国家药典会下发的“《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求”，含量测定限度按其平均值下浮20％，暂订限度为“本品按干燥品计算，含木犀草苷(C21H20O11)不得少于0.83％”，按照拟定限度，有2批样品含量测定结果不符合本方法规定。以木犀草苷作为酸浆提取物的定量指标用来评价酸浆质量的优劣具有合理性，测定了不同批次的酸浆药材，方法可靠。
综上所述，本发明的具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法及检测方法，工艺简单，提取溶剂单一安全，可回收，无有毒试剂引入，对环境无污染，其工艺有利于大生产，无冗杂步骤，对环境无污染，并且所制备物质活性明显，可以作为功效性护肤品及医药辅助用品的活性成分，起到抗炎舒敏等作用；建立了以木犀草苷含量为酸浆提取物的质量评价标准，具有合理性，方法可靠。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。

Claims (1)

1.一种具有抗炎功效的酸浆提取物的检测方法，所述酸浆提取物采用包括以下步骤的制备方法制备：
S1，粉碎过筛步骤：将酸浆宿萼干燥粉碎，过4～8号筛；
S2，制备提取液步骤：将粉碎后的酸浆宿萼用水或乙醇或乙醇水溶液作为提取溶剂进行加热回流提取，得提取液；粉碎后的酸浆宿萼与提取溶剂的料液比为1:5g/mL～1:15g/mL，提取温度为50℃～90℃，提取时间为1h～3h，提取次数为1～3次；
S3，浓缩步骤：合并提取液并减压浓缩至无醇味，得浓缩液；
S4，冷冻干燥步骤：使用冻干机将浓缩液进行低温干燥，得固体状酸浆提取物；所述酸浆提取物的得率≥14.11％，所述酸浆提取物中木犀草苷的含量≥0.83％；
其特征在于，所述酸浆提取物的检测方法包括以下步骤：
A，木犀草苷对照品溶液制备步骤：称取木犀草苷对照品，将其溶解于体积浓度为50～100％的甲醇水溶液制成木犀草苷对照品溶液；所述木犀草苷对照品溶液的浓度为226μg/mL；
B，供试品溶液制备步骤：称取所述的具有抗炎功效的酸浆提取物的制备方法制得的酸浆提取物5mg～10mg，将其溶解于体积浓度为50～100％的甲醇水溶液制得供试品溶液；
C，过滤步骤：将所述木犀草苷对照品溶液与供试品溶液分别用0.22μm的微孔滤膜过滤；
D，线性相关性考察步骤：将所述木犀草苷对照品溶液倍比稀释，注入高效液相色谱仪进行分析，以每个对照品的进样浓度Y为纵坐标，峰面积值X为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程及线性范围；
E，酸浆提取物中木犀草苷含量确定步骤：吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，通过木犀草苷对照品溶液的色谱峰和待检测的供试品溶液的色谱峰对比，以线性回归方程计算，得所述酸浆提取物中木犀草苷的含量，对酸浆提取物的质量进行控制；
步骤D和步骤E中，所述高效液相色谱仪的参数如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-AQ C18，色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm；
检测波长：203nm；
柱温：30℃；
流速1.0mL·min-1；
流动相：A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，洗脱条件见表1：
表1.HPLC流动相洗脱条件
时间(min) 流动相B％ 0 5 0-10 20 10-15 20 15-25 35 25-45 49 45-65 99
所述木犀草苷对照品溶液倍比稀释后，浓度在7.0mg/L～226.0mg/L呈线性，线性回归方程为：
Y＝0.0484X-2.4052，R2＝0.9999。
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