CN104825547A

CN104825547A - 睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物及其组合物的医药用途和制备方法

Info

Publication number: CN104825547A
Application number: CN201510058747.7A
Authority: CN
Inventors: 王金辉; 热娜·卡斯木; 黄健; 李国玉; 王雁丽; 王新玲; 马庆东; 张珂; 毛晓峰; 窦雪
Original assignee: Xinjiang Medical University
Current assignee: Xinjiang Medical University
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明属医药技术领域，具体涉及一种睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物及其组合物的制备方法以及它在降血糖、减肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。所述的提取物通过如下方法获得：先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，继用纯甲醇洗脱，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该α-糖苷酶抑制活性提取物。

Description

睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物及其组合物的医药用途和制备方法

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物及其组合物的制备方法以及它在降血糖、减肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。

背景技术

睡莲，（拉丁学名：Nymphaea tetragona Georgi），又称子午莲、水芹花，是毛茛目睡莲科植物。多年生水生草本；根状茎肥厚。叶二型：浮水叶圆形或卵形，基部具弯缺，心形或箭形，常无出水叶；沉水叶薄膜质，脆弱。花大形、美丽，浮在或高出水面；萼片近离生；花瓣白色、蓝色、黄色或粉红色，成多轮，有时内轮渐变成雄蕊；药隔有或无附属物；心皮环状，贴生且半沉没在肉质杯状花托，且在下部与其部分地愈合，上部延伸成花柱，柱头成凹入柱头盘，胚珠倒生，垂生在子房内壁。浆果海绵质，不规则开裂，在水面下成熟；种子坚硬，为胶质物包裹，有肉质杯状假种皮，胚小，有少量内胚乳及丰富外胚乳。从东北至云南，西至新疆皆有分布；朝鲜，日本，印度，苏联，北美也有。生于池沼中。根状茎食用或酿酒，又入药，能治小儿慢惊风；全草可作绿肥。

秦汉时代，先民们就将睡莲作为滋补药用，荷花药用在中国也有2 000年以上的历史。《本草纲目》中记载说荷花，莲子、莲衣、莲房、莲须、莲子心、荷叶、荷梗、藕节等均可药用。荷花能活血止血、去湿消风、清心凉血、解热解毒。莲子能养心、益肾、补脾、涩肠。莲须能清心、益肾、涩精、止血、解暑除烦，生津止渴。荷叶能清暑利湿、升阳止血，减肥瘦身，其中荷叶成分对于清洗肠胃，减脂排瘀有奇效。藕节能止血、散瘀、解热毒。荷梗能清热解暑、通气行水、泻火清心

本发明通过大规模、系统地活性筛选，意外地发现维吾尔药睡莲花提取物及其部分化学组分，具有显著地α-糖苷酶抑制活性，该活性提取物及其组合物有望应用于降血糖、减肥、降血脂、糖尿病等方面。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种睡莲花提取物。

本发明还提供了以睡莲花提取物为主要活性成分的组合物。

本发明同时提供了睡莲花提取物及其组合物的制备和应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

维吾尔药睡莲花经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（SiO₂）柱分离，上样后的硅胶柱，用石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱（石油醚-丙酮，比例见表1），各石油醚-丙酮比例混合溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其α-糖苷酶抑制活性，意外地发现先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，继用纯甲醇洗脱得到的纯甲醇洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为α-糖苷酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部位，没有α-糖苷酶抑制活性的作用。特别地，优选为先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱25倍柱体积，洗脱液干燥后所得提取物即为本发明α-糖苷酶抑制活性的提取物。α-糖苷酶抑制活性的提取物可以通过以上方法得到富集，从而与其他杂质类成分分离开。该睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物从未见文献报道，其薄层谱色谱（TLC）分析表征如图1，TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1）显色方法：香草醛-硫酸显色。

具体，发现过程如下：

1、睡莲花经甲醇超声提取物的制备

取维吾尔药睡莲花20g，经100 mL甲醇超声提取15 min，提取液浓缩后，得提取物SN0042A，样品1.4223g，留样：0.0707g，上样量1.3516g，拌样硅胶1.4 g，空白硅胶10 g，石油醚-丙酮系统洗脱。

2、石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱方法和结果

取维吾尔药睡莲花20g，经100 mL甲醇超声提取15 min，提取液浓缩后，得提取物SN0042A，1.4223g，上柱，甲醇溶解，共用甲醇15 mL。上硅胶柱色谱，拌样硅胶1.4g，空白硅胶10g，玻璃柱内径2cm，石油醚-丙酮系统梯度洗脱（条件见表1），柱体积25 mL，每个梯度洗脱200mL，得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，石油醚：丙酮梯度洗脱提取物，TLC分析结果见图2，TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1）显色方法：香草醛-硫酸显色。

表1

3、抑制α-糖苷酶活性筛选方法和结果

1) 实验条件

a、材料：DMSO(二甲基亚砜) (科密欧公司)；KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O(广东汕头市西陇化工厂)；α-glucosidase酶(美国Sigma公司)；PNPG(美国Sigma公司)

b、实验仪器：多功能酶标仪Bio-Rad Model 680型(Bio-Rad Laboratories Inc.)

2) 实验方法和过程

样品处理：将1 mg待测样品溶于20 μL二甲基亚砜(DMSO)作为母液，取1 μL母液加入99 μL缓冲盐配成500 μg·mL^-1的样品溶液。

在96孔板中依次加入α-glucosidase酶PBS溶液20 μL使其终浓度为0.07 u/mL，样品浓度为500 μg·mL^-1的PBS溶液10 μL。冰浴5分钟，加入底物PBS溶液20 μL使其终浓度为2.5 mmol/l，用浓度为0.1 M、pH 6.84的PBS溶液补足体积为100 μL。加过样的96孔板在37 ℃水浴30分钟。于405 nm处测定反应物的吸光度，并以阿卡波糖作为阳性对照。样品抑制α-glucosidase酶活性比率用加样品较空白对照的OD值的比值来表示。样品抑制百分率按以下公式计算:

酶活性抑制率% = [A_空白- (A_样品- A_背景)] / A_空白× 100

式中A_空白：不加样品反应后的吸收值；

A_样品：加入样品反应后的吸收值；

A_背景：只加样品的吸收值。

3) 实验结果

表2

结果发现：

本发明最优方案为：维吾尔药睡莲花经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，继用纯甲醇洗脱，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物，即为该α-糖苷酶抑制活性提取物。该α-糖苷酶抑制活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图1。

4、α-糖苷酶抑制活性有效提取物的提取方法研究

1）提取溶剂的种类研究

分别用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机溶剂提取，并测试提取物的α-糖苷酶抑制活性，实验结果如下：

表3

研究结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂。

2）提取溶剂的用量研究

分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/体积比）有机溶剂提取，并测试提取物的α-糖苷酶抑制活性，结果如下：

表4

活性提取物的提取所用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍（重量/体积比）。

3）干燥方法的研究

分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的抑制α-糖苷酶活性提取物进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对α-糖苷酶抑制活性提取物进行干燥，其中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。

表5

优选地，睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物的制备方法为：

维吾尔药睡莲花经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提取物。以上条件最优为先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:50，体积比）洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱25倍柱体积。其中，

提取物提取用溶剂可以为甲醇、石油醚、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇。活性提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍（重量/体积比）。

1) 提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。

5. 睡莲花抑制α-糖苷酶活性提取物（洗脱液为纯甲醇时干燥后所得的提取物）的医药用途研究

按优化的睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物制备方法制备的活性提取物，经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=19.7 μg/mL。

由于α-糖苷酶抑制剂具有降血糖、减肥、降血脂、糖尿病等方面的医药用途。因此，我们发现的睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物具有广泛的医药用途。

6、睡莲花抑制α-糖苷酶活性提取物的组合物及其制备方法研究

1）固体分散体

处方

睡莲花提取物 20

Vc 1

聚乙烯吡咯烷酮 79

固体分散100

制备方法：

称取睡莲花提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP）按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放入烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力搅拌器搅拌至睡莲花提取物和载体完全溶解，充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得睡莲花有效提取物PVP包合物。

2）环糊精包合物

处方：

睡莲花提取物 20

Vc 1

β-环糊精 79

包合物100

制备方法：

将β-环糊精与 1-5 倍水研匀,加睡莲花有效提取物( 水难溶性的应先溶于少量有机溶剂中) 继续充分研磨至成糊状物, 低温干燥即得环糊精包合物。

3）分散片处方:

睡莲花提取物 100

十二烷基硫酸钠 1

Vc 1

预胶化淀粉 10

可溶性淀粉 100

交联聚维酮 10

微晶纤维素 9

微分硅胶 0.3

滑石粉 1

100片

制备方法：

1. 睡莲花有效提取物分散体的制备，精密称取睡莲花提取物、Vc，加入处方量的十二烷基硫酸钠，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70℃的温度下蒸干，粉碎，过100目筛；

2. 将第一步中的睡莲花有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉，用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min 后， 60℃烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片即得。

7、睡莲花抑制α-糖苷酶活性提取物的检测方法研究

我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物的特征。见图1

具体条件为：GF₂₅₄硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1）显色方法：香草醛-硫酸显色。

附图说明：

图1 睡莲花α-糖苷酶抑制活性提取物的TLC色谱图；

图2 睡莲花溶剂提取物的TLC色谱图。

具体实施方式:

以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。

实施例 1：

取取维吾尔药睡莲花20 g，经100 mL甲醇超声提取15 min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm 内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱25倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=82.0 μg/mL。

实施例 2：

取维吾尔药睡莲花20 g，经100 mL乙醇超声提取15 min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm 内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱25倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=88.0 μg/mL。

实施例 3：

取维吾尔药睡莲花20 g，经100 mL石油醚超声提取15 min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm 内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱25倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，旋蒸干燥法，即为该活性提取物。经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=83.0 μg/mL。

实施例 4：

取维吾尔药睡莲花20 g，经100 mL丙酮超声提取15 min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm 内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱25倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，鼓风干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=80.0 μg/mL。

实施例 5：

取维吾尔药睡莲花20 g，经100 mL氯仿超声提取15 min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm 内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱25倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，离心干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=77.0 μg/mL。

实施例 6：

取维吾尔药睡莲花20 g，经100 mL乙酸乙酯超声提取15 min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm 内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱25倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=67.0 μg/mL。

实施例 7：

取维吾尔药睡莲花20 g，经100 mL甲醇水混合溶剂（甲醇：水=1：1）超声提取15 min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm 内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱25倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=88.0 μg/mL。

实施例 8：

取维吾尔药睡莲花20 g，经100 mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=1：1）超声提取15 min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm 内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱25倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=57.0 μg/mL。

实施例 9：

取维吾尔药睡莲花20 g，经100 mL乙醇-水混合溶剂（乙醇：水=90：10）超声提取15 min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm 内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱25倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖苷酶抑制活性为IC₅₀=73.0 μg/mL。

实施例 10：固体分散体

实施例 11：环糊精包合物

实施例12：分散片

将第一步中的睡莲花有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉，用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min 后，60℃烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片即得。

Claims

1.一种睡莲花提取物，其特征为睡莲花经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用体积比为100:50的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱，继用纯甲醇洗脱，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该提取物。

2.如权利要求1所述睡莲花提取物，其特征为，提取所用溶剂可以为甲醇、石油醚、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇或95%乙醇。

3.如权利要求1所述睡莲花提取物，其特征为睡莲花经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱，继用纯甲醇洗脱，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物。

4.如权利要求1-3任何一项所述的一种维吾尔药睡莲花提取物，其特征为，用于洗脱的石油醚-丙酮混合溶剂、甲醇的洗脱体积为2-50倍柱体积。

5.如权利要求1所述提取物的制备方法，其特征为：睡莲花经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱2-50倍柱体积，继用纯甲醇洗脱2-50倍柱体积，用纯甲醇洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该有效部位；以上条件最优为先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:50，体积比）洗脱15倍柱体积，继用纯甲醇洗脱25倍柱体积。

6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的维吾尔药睡莲花提取物和药学上可接受的载体。

7.一种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的睡莲花提取物或权利要求6所述的药物组合物。

8.如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述的制剂为固体分散体、环糊精包合物、分散片。

9.如权利要求1-5任何一项所述提取物或权利要求6所述的组合物或权利要求7所述的药物制剂在制备α-葡萄糖苷酶抑制活性药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可用于降血糖、减肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。

11.如权利要求1-5任何一项所述的睡莲花提取物，其特征在于，用TLC法检测，其色谱条件为：GF₂₅₄硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮=6:1:1；显色方法：香草醛浓硫酸显色。