CN105878327A - 小檗果α-糖苷酶抑制活性有效提取物及其组合物的医药用途和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属医药技术领域,具体涉及一种小檗果α-糖苷酶抑制活性提取物及其组合物的制备方法以及它在降血糖、减肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。所述的提取物通过如下方法获得:先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,继用甲醇溶剂洗脱,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收溶剂,干燥,即为α-糖苷酶抑制活性提取物。
Description
技术领域
本发明属医药技术领域,具体涉及一种小檗果α-糖苷酶抑制活性提取物及其组合物的制备方法以及它在降血糖、减肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。
背景技术
小檗果为小檗科植物红果小檗Berberis nummularia Bge.的干燥成熟果实。呈广卵形、椭圆形或近球形,长7-12 mm,宽5-8
mm。外表面光滑或微显皱缩,紫黑色,常被灰白色粉霜。果皮薄而脆,极易破碎,破碎面紫黑色。有时可见果柄,长约5 mm,果柄着生处可见种子3-6 粒,棕褐色,先端稍弯曲,底端钝圆,长约5 mm,光滑。气微,味微酸。具有健胃和中,生津止渴,清热解毒的功效。临床上用于治疗消化不良,痢疾泻下,口渴,口疮,咽炎。
本发明通过大规模、系统地活性筛选,意外地发现维吾尔药小檗果提取物及其部分化学组分,具有显著地α-糖苷酶抑制活性,该活性提取物及其组合物有望应用于降血糖、减肥、降血脂、糖尿病等方面。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种小檗果提取物。
本发明还提供了以小檗果提取物为主要活性成分的组合物。
本发明同时提供了小檗果提取物及其组合物的制备和在制备α-糖苷酶抑制活性药物中的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的:
维吾尔药小檗果经水煮沸提取,提取液浓缩后,用硅胶(SiO2)柱分离,上样后的硅胶柱,用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(氯仿-甲醇,比例见表1),各氯仿-甲醇比例混合溶剂洗脱液,浓缩,干燥后,利用体外筛选体系测试其α-糖苷酶抑制活性,意外地发现先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,继用甲醇溶剂洗脱,得到的甲醇溶剂洗脱液经回收有机溶剂,干燥,即为α-糖苷酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部位,没有α-糖苷酶抑制活性的作用。特别地,优选先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱10倍柱体积,继用甲醇溶剂洗脱20倍柱体积洗脱液即为本发明α-糖苷酶抑制活性的提取物,可以通过以上方法得到富集,从而与其他杂质类成分分离开。该小檗果α-糖苷酶抑制活性提取物从未见文献报道,其薄层谱色谱(TLC)分析表征如图1,TLC分析条件:GF254硅胶板,展开系统:氯仿:乙酸乙酯:甲醇(1:1:1),显色方法:香草醛-硫酸显色。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种提取物。
本发明还提供了以提取物为主要活性成分的组合物。
本发明同时提供了小檗果提取物及其组合物的制备和在制备α-糖苷酶抑制活性中的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的:
1、小檗果经水煮沸提取物的制备
取维吾尔药小檗果20 g,经200
ml水煮沸提取2 h,提取液浓缩后,得提取物SN0011B,样品1.3203 g,留样0.1092 g,上样量1.2111 g,拌样硅胶2 g,空白硅胶10 g,氯仿-甲醇系统洗脱。
2、氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱方法和结果
取维吾尔药小檗果20 g,经200
ml水煮沸提取2 h,提取液浓缩后,得提取物SN0011B, 1.3203 g,上柱,甲醇溶解,共用甲醇15 mL。上硅胶柱色谱,拌样硅胶2 g,空白硅胶10 g,玻璃柱内径2.4 cm,氯仿-甲醇系统梯度洗脱(条件见表1),柱体积22 mL,每个梯度洗脱200 mL,得到,各个浓度提取洗脱液的洗脱物,回收溶剂,即得,氯仿:甲醇梯度洗脱提取物,TLC分析结果见图2,图3,展开系统:氯仿:乙酸乙酯:甲醇(3:1:1),氯仿:乙酸乙酯:甲醇(1:1:1),显色方法:香草醛-硫酸显色。
表1
3、抑制α-糖苷酶活性筛选方法和结果
1) 实验条件
a、材料:DMSO(二甲基亚砜) (科密欧公司);KH2PO4、K2HPO4·3H2O(广东汕头市西陇化工厂);α-glucosidase酶(美国Sigma公司);PNPG(美国Sigma公司)
b、实验仪器:多功能酶标仪Bio-Rad
Model 680型(Bio-Rad
Laboratories Inc.)
2) 实验方法和过程
样品处理:将1 mg待测样品溶于20 μL二甲基亚砜(DMSO)作为母液,取1 μL母液加入99 μL缓冲盐配成500 μg·mL-1的样品溶液。
在96孔板中依次加入α-glucosidase酶PBS溶液20 μL使其终浓度为0.07 u/mL,样品浓度为500 μg·mL-1的PBS溶液10 μL。冰浴5分钟,加入底物PBS溶液20 μL使其终浓度为2.5 mmol/L,用浓度为0.1 M、pH 6.84的PBS溶液补足体积为100 μL。加过样的96孔板在37 ℃水浴30分钟。于405 nm处测定反应物的吸光度,并以阿卡波糖作为阳性对照。样品抑制α-glucosidase酶活性比率用加样品较空白对照的OD值的比值来表示。样品抑制百分率按以下公式计算:
酶活性抑制率% = [A空白- (A样品- A背景)] / A空白× 100
式中A空白:不加样品反应后的吸收值;
A样品:加入样品反应后的吸收值;
A背景:只加样品的吸收值。
3)
实验结果
表2
结果发现:
本发明的最优方案为:维吾尔药小檗果经水煮沸提取,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱,先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,继用甲醇溶剂洗脱,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,干燥,即为该提取物,即为该α-糖苷酶抑制活性提取物。该α-糖苷酶抑制活性提取物从未见文献报道,其TLC分析表征如图1。
4、α-糖苷酶抑制活性有效提取物的提取方法研究
1)提取溶剂的种类研究
分别用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机溶剂提取,并测试提取物的α-糖苷酶抑制活性,实验结果如下:
表3
研究结果表明:提取用有机溶剂可以为甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂。
2)提取溶剂的用量研究
分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比)有机溶剂提取,并测试提取物的α-糖苷酶抑制活性,结果如下:
表4
活性提取物的提取所用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
3)干燥方法的研究
分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法,对得到的抑制α-糖苷酶活性提取物进行干燥,以含水量、TLC、活性测试为指标,发现真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对α-糖苷酶抑制活性提取物进行干燥,其中,最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
表5
优选地,小檗果α-糖苷酶抑制活性提取物的制备方法为:
维吾尔药小檗果经水煮沸提取,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱,先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱2-50倍柱体积,继用甲醇溶剂洗脱,洗脱2-50倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,干燥,即为该活性提取物。特别地,优先选先用氯仿:甲醇混合溶剂(氯仿:甲醇,100:100,体积比)洗脱10倍柱体积,继用甲醇溶剂洗脱20倍柱体积。其中,
1) 提取物提取用溶剂可以为甲醇、氯仿、水、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂,最优条件为甲醇和95%乙醇。活性提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
2)
提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等,最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
5. 小檗果抑制α-糖苷酶活性提取物(洗脱液为纯甲醇时干燥所得的提取物)的医药用途研究
按优化的小檗果α-糖苷酶抑制活性提取物制备方法制备的活性提取物,经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=19.5 μg/mL。
由于α-糖苷酶抑制剂具有降血糖、减肥、降血脂、糖尿病等方面的医药用途。因此,我们发现的小檗果α-糖苷酶抑制活性提取物具有广泛的医药用途。
6、小檗果抑制α-糖苷酶活性提取物的组合物及其制备方法研究
1)固体分散体
处方
小檗果提取物
20 g
Vc
1 g
聚乙烯吡咯烷酮
79 g
固体分散100g
制备方法:
称取小檗果提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮(PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放入烧杯中,加入适量的无水乙醇和Vc,用磁力搅拌器搅拌至小檗果提取物和载体完全溶解,充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂,干燥,粉碎过80目筛,即得小檗果有效提取物PVP包合物。
2)环糊精包合物
处方:
小檗果提取物
20 g
Vc
1 g
β-环糊精
79 g
包合物100g
制备方法:
将β-环糊精与 1-5 倍水研匀,加小檗果有效提取物( 水难溶性的应先溶于少量有机溶剂中) 继续充分研磨至成糊状物, 低温干燥即得环糊精包合物。
3)分散片处方:
小檗果提取物
100
十二烷基硫酸钠
1
Vc
1
预胶化淀粉
10
可溶性淀粉
100
交联聚维酮
10
微晶纤维素
9
微分硅胶
0.3
滑石粉
1
100片
制备方法:
1. 小檗果有效提取物分散体的制备,精密称取小檗果提取物、Vc,加入处方量的十二烷基硫酸钠,用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后,在70℃的温度下蒸干,粉碎,过100目筛;
2. 将第一步中的小檗果有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮,预胶化淀粉,用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂,边加入边搅拌,制成湿颗粒过14目筛,室温下放置15min
后, 60℃烘箱烘干45min,16目筛整粒,加入处方量的滑石粉和微分硅胶,混合均匀后,压片即得。
7、小檗果抑制α-糖苷酶活性提取物的检测方法研究
我们发现,可以用薄层色谱的方法,很好地检测和标示小檗果α-糖苷酶抑制活性提取物的特征,见图1。
具体条件为:GF254硅胶板,展开系统:氯仿:乙酸乙酯:甲醇(1:1:1),显色方法:香草醛-硫酸显色。
附图说明:
图1 小檗果α-糖苷酶抑制活性提取物的TLC色谱图;
图2 小檗果溶剂提取物的TLC色谱图;
图3 小檗果溶剂提取物的TLC色谱图。
具体实施方式:
以下实施例表示本发明的实用性,本发明不受此限制。
实施例 1:
取维吾尔小檗果20 g,经100 mL甲醇超声提取15 min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(2 cm 内径小柱),先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱10倍柱体积,继用纯甲醇洗脱,洗脱20倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,真空干燥,即为该活性提取物。经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=83.0 μg/mL。
实施例 2:
取维吾尔药小檗果20 g,经100 mL乙醇超声提取15 min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(2 cm 内径小柱),先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱10倍柱体积,继用纯甲醇洗脱,洗脱20倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,冷冻干燥,即为该活性提取物。经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=88.0 μg/mL。
实施例 3:
取维吾尔药小檗果20 g,经100 mL石油醚超声提取15 min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(2 cm 内径小柱),先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱10倍柱体积,继用纯甲醇洗脱,洗脱20倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,旋蒸干燥法,即为该活性提取物。经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=79.0 μg/mL。
实施例 4:
取维吾尔药小檗果20 g,经100 mL丙酮超声提取15 min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(2 cm 内径小柱),先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱10倍柱体积,继用纯甲醇洗脱,洗脱20倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,鼓风干燥,即为该活性提取物。经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=81.0 μg/mL。
实施例 5:
取维吾尔药小檗果20 g,经100 mL氯仿超声提取15 min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(2 cm 内径小柱),先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱10倍柱体积,继用纯甲醇洗脱,洗脱20倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,离心干燥,即为该活性提取物。经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=80.0 μg/mL。
实施例 6:
取维吾尔药小檗果20 g,经100 mL乙酸乙酯超声提取15 min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(2 cm 内径小柱),先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱10倍柱体积,继用纯甲醇洗脱,洗脱20倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,冷冻干燥,即为该活性提取物。经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=70.0 μg/mL。
实施例 7:
取维吾尔药小檗果20 g,经100 mL甲醇水混合溶剂(甲醇:水=1:1)超声提取15 min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(2 cm 内径小柱),先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱10倍柱体积,继用纯甲醇洗脱,洗脱20倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,冷冻干燥,即为该活性提取物。经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=88.0 μg/mL。
实施例 8:
取维吾尔药小檗果20 g,经100 mL乙醇水混合溶剂(乙醇:水=1:1)超声提取15 min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(2 cm 内径小柱),先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱10倍柱体积,继用纯甲醇洗脱,洗脱20倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,冷冻干燥,即为该活性提取物。经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=60.0 μg/mL。
实施例 9:
取维吾尔药小檗果20 g,经100 mL乙醇-水混合溶剂(乙醇:水=90:10)超声提取15 min,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱(2 cm 内径小柱),先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱10倍柱体积,继用纯甲醇洗脱,洗脱20倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,冷冻干燥,即为该活性提取物。经测试,其α-糖苷酶抑制活性为IC50=73.0 μg/mL。
实施例 10:固体分散体
称取小檗果提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮(PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放入烧杯中,加入适量的无水乙醇和Vc,用磁力搅拌器搅拌至小檗果提取物和载体完全溶解,充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂,干燥,粉碎过80目筛,即得小檗果有效提取物PVP包合物。
实施例 11:环糊精包合物
将β-环糊精与 1-5 倍水研匀,加小檗果有效提取物( 水难溶性的应先溶于少量有机溶剂中) 继续充分研磨至成糊状物, 低温干燥即得环糊精包合物。
实施例12:分散片
1. 小檗果有效提取物分散体的制备,精密称取小檗果提取物、Vc,加入处方量的十二烷基硫酸钠,用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后,在70℃的温度下蒸干,粉碎,过100目筛;
2. 将第一步中的小檗果有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮,预胶化淀粉,用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂,边加入边搅拌,制成湿颗粒过14目筛,室温下放置15min
后,60℃烘箱烘干45min,16目筛整粒,加入处方量的滑石粉和微分硅胶,混合均匀后,压片即得。
Claims (10)
1.一种小檗果提取物,其特征为小檗果经水煮沸提取,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱,先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,继用甲醇溶剂洗脱,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收溶剂,干燥,即为该提取物。
2.如权利要求1所述小檗果提取物,其特征为提取溶剂可以为甲醇、氯仿、水、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂,优选甲醇或95%乙醇,提取物提取用溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
3.如权利要求1所述小檗果提取物,其特征为小檗果经水煮沸提取,提取液浓缩后,用硅胶柱分离,上样后的硅胶柱,先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱,洗脱2-50倍柱体积,继用甲醇溶剂洗脱,洗脱2-50倍柱体积,用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂,干燥,即为该提取物。
4.如权利要求1所述的维吾尔药小檗果提取物,其特征为,先用体积比为100:100的氯仿-甲醇混合溶剂2-50倍洗脱,继用甲醇2-50倍洗脱。
5.如权利要求1-4所述的维吾尔药小檗果提取物,其特征为:最优为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇,100:100,体积比)洗脱10倍柱体积,继用甲醇溶剂洗脱20倍柱体积。
6.一种药物组合物,其特征在于,包含权利要求1-5任何一项所述的提取物和药学上可接受的载体。
7.一种药物制剂,其特征在于,包含权利要求1-5任何一项所述的提取物或权利要求6所述的药物组合物。
8.如权利要求1-5任何一项所述的小檗果提取物或权利要求6所述的组合物或权利要求7所述的药物制剂在α-糖苷酶抑制活性药物中的应用。
9.如权利要求8所述维吾尔药小檗果提取物,其特征为,所述活性可用于降血糖、减肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。
10.如权利要求1-5任何一项所述的小檗果提取物,其特征在于,用TLC检测法,其色谱条件为:GF254硅胶板,展开系统:氯仿:乙酸乙酯:甲醇=1:1:1,显色方法:香草醛浓硫酸显色。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160824 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |