CN103751224B - 从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法：蛹虫草子实体超低温粉碎；得到超微粉水煮提取，沉淀再丙酮提取；得到沉淀溶解后过液相色谱，洗脱试剂为100%正己烷、25%乙酸乙酯-正己烷、100%乙酸乙酯；选取活性最强组分过液相色谱，洗脱试剂为100%正己烷、10%乙酸乙酯-正己烷、15%乙酸乙酯-正己烷、30%乙酸乙酯-正己烷、60%乙酸乙酯-正己烷；选取活性最强组分过液相色谱，洗脱试剂为100%二氯甲烷、25%二氯甲烷-甲醇，选取活性最强组分过液相色谱，洗脱试剂为100%正己烷、5%乙醇-正己烷，选取活性最强组分即为本发明目的组分。该方法重复性好，得到的抗肿瘤活性组分可用于制备抗肿瘤药物中。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品加工技术领域，具体涉及一种从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，以及该活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是一种基因病，但并非是遗传的，它是指细胞在致癌因素作用下，基因发生了改变，失去对其生长的正常调控，导致单克隆性异常增生而形成的新生物。2008年，WHO发布的数据显示，中国已经成为世界第二大癌症高发国，中国每年新增220万名癌症患者，约占全球癌症病人总数的20%，尤其是肝癌、胃癌和肺癌成为主要的健康杀手。研究如何消灭癌症、让癌症病人能生活地更好，是医药领域中的研究重点，因此寻找高效、低毒、选择性强的有临床应用价值的理想的新型抗肿瘤药物是一项长期而艰巨的任务，从药食两用的无毒且原料廉价易得的中药里寻找抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物开发的重要方向与希望所在。
冬虫夏草是虫草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科幼虫中以其为载体的虫菌复合体，含有丰富的蛋白质、脂肪、虫草酸、核苷类物质和多种氨基酸等活性物质，味道清香，具有滋肺益气、增精补肾、止血化痰、抑制肿瘤、止咳镇静、驱风、散热、驻容美颜、延缓衰老、提高机体免疫力之功效。
蛹虫草(Cordycepsmilitaris)，在分类学上与冬虫夏草同归于虫草属,是一种珍贵的药用真菌，其化学成分和药理作用与冬虫夏草相似，在临床上常替代冬虫夏草入药。由于野生蛹虫草资源极为有限，不能满足日益增加的市场需求，人工栽培蛹虫草成为必需。目前，人工栽培蛹虫草已获成功，并实现了规模化生产。
蛹虫草具有多种与抗肿瘤作用相关的活性物质，有些活性物质如虫草素、虫草多糖等的抗肿瘤作用已研究得比较深入；而有些活性物质如类胡萝卜素、蛋白质等在抗肿瘤方面的研究则较少。蛹虫草活性物质未能最大程度地得到开发与利用，所以研究具有抗肿瘤作用的新的活性物质，不断开拓现有活性物质的新的生理活性和药理作用具有重要意义，能为进一步研究和开发蛹虫草在医药方面的应用提供理论基础和产业化背景。
传统的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，如杜秀菊等发表的“蛹虫草抗肿瘤和免疫活性部位的体外筛选”（食用菌学报.2011.18(1):41-45）中公开了一种蛹虫草子实体提取物制备方法：蛹虫草子实体粉过60目筛后，用氯仿提取2小时，过滤，滤渣风干后用乙酸乙酯提取2小时，过滤，滤渣风干后用95%乙醇提取2小时，过滤，滤渣风干后用30倍100℃蒸馏水提取2小时，400g离心20min后沉淀用15倍100℃3%草酸铵溶液提取2小时，400g离心20min后沉淀用10倍100℃5%NaOH溶液提取2小时，400g离心20min后上清液继续用1mol/L盐酸4℃中和，400g离心20min，对各步得到的滤液或上清液真空浓缩，冷冻干燥，得到各提取物组分。该蛹虫草子实体有效成分的提取分离方法步骤繁杂，而且提取出的活性成分少。另外，采用这种传统的溶剂萃取法进行有效活性组分的提取，批次之间不具有重复性，即无法保证第一批萃取得到的物质组分与第二批萃取得到的物质组分之间的一致性。
又如朱丽娜等发表的“蛹虫草子实体中N6-（2-羟乙基）-腺苷的分离纯化及抗肿瘤作用”（食用菌学报.2013.20(1):62-65）中公开了一种目标化合物的分离纯化方法，它将蛹虫草子实体粉末加入蒸馏水中100℃提取2小时，重复提取2次，合并提取液，然后以该提取液进行后续目标成分的提取。该方法属于传统的中药有效成分的提取方法，即以水提的上清进行有效成分的提取，而对水提的沉淀却没有进行深入的研究，这有可能导致大量活性组分的丢失，从而阻碍了蛹虫草在抗肿瘤药物开发方面的进展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，突破现有中药有效组分提取的限制，提供一种从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，该方法以在细胞水平上没有抗肿瘤活性的蛹虫草子实体水提沉淀为原料，经丙酮浸提后再用制备液相色谱技术活性导向分离出强活性抗肿瘤活性组分。
本发明所采用的技术方案为：
一种从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，该方法包括以下步骤：
1、超低温粉碎：
取烘干的蛹虫草子实体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用2～10℃的水作为超微破碎机内部冷却液，超微粉碎时间为5-20min，得到超微粉。
上述粉碎时间优选为12min。
2、溶剂提取：
2.1水煮：在超微粉中加入超纯水，超纯水的加入量为超微粉质量的8～10倍，100℃加热3～10小时进行提取，离心取沉淀，然后重复1～3次，将得到的沉淀合并，干燥，得到粗品A。
该步是与目前传统的中药有效组分或有效成分提取的最大不同。传统的中药中活性组分或活性成分的提取方法都是以水提的上清为中间原料进行有效成分的提取，中医学上中药饮用也是如此，水煮后取上清液为患者饮用，因为按常规理解，沸水煎煮后药材中的有效成分便溶于液体中，故上清液中包含了所需的有效组分。而恰恰是这种认识的局限性，限制了目前物种中活性组分或活性成分的开发，使得很多有效组分或有效成分被当做废渣倒掉、没有进一步被发现和开发利用。这也并非是因为大多数研究者忽视了废渣中有效组分或有效成分存在的可能性，而是因为废渣在体外可能不具有抗肿瘤活性或活性很弱，如该步得到的粗品A经检测在细胞水平上是没有抗肿瘤活性的，这样的检测结果使得大多数研究者放弃了对其进行进一步分析和研究，从而导致了大量活性组分的丢失。本发明通过申请人的深入研究、分析和实验，发现在细胞水平上没有抗肿瘤活性的水提沉淀具有目的有效组分存在的可能性，从而从水提沉淀、出发，通过大量的实验探索和工艺优化，最后总结出一套即本发明所述的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，最终成功提取到目的有效活性组分。
2.2丙酮沉淀：在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量为粗品A质量的2～4倍，室温下浸提12～36小时，离心后取沉淀，然后重复1～3次，将得到的沉淀合并，干燥，得到粗品B。
上述离心的转速优选为6000rpm。
上述干燥优选为在60℃鼓风干燥箱内进行。
3、色谱分离：
3.1取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液（即乙酸乙酯与正己烷以1：1的体积比配比而成）溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱，25%乙酸乙酯-正己烷溶液（即乙酸乙酯与正己烷以1：3的体积比配比而成）等度洗脱，100%乙酸乙酯等度洗脱，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分A。
具体地，使用的色谱柱填料为粒径10μm的硅胶（Silica）、大小为150×250mm，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱25min，100%乙酸乙酯等度洗脱15min，上样量为200ml，流速为700ml/min。
该步溶剂的选择非常重要，经过试验，50%乙酸乙酯-正己烷溶液中乙酸乙酯对粗品B能全部溶解，正己烷对粗品B为部分溶解，而选用50%乙酸乙酯-正己烷溶液可以做到使粗品B溶解至50mg/ml，洗脱时采用100%正己烷、25%乙酸乙酯-正己烷溶液、100%乙酸乙酯的洗脱顺序，使粗品B中物质组分被尽量分开，有利于目的有效组分的提取，提高提取率。
3.2取组分A用100%乙酸乙酯溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱，10%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱，15%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱，30%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱，60%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分B。
具体地，使用的色谱柱填料为粒径10μm的硅胶（Silica）、大小为150×250mm，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，10%乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱20min，30%乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱15min，60%乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱20min，上样量为400ml，流速为700ml/min。
该步洗脱采用的洗脱剂（10%乙酸乙酯-正己烷溶液、15%乙酸乙酯-正己烷溶液）不同于3.1中，通过洗脱率的不同，将原本被一个浓度洗脱下来的组分进行分开洗脱，有利于后续有效组分的获得。
3.3取组分B用100%二氯甲烷溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%二氯甲烷等度洗脱，25%二氯甲烷-甲醇溶液等度洗脱，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分C。
具体地，使用的色谱柱填料为粒径10μm的硅胶（Silica）、大小为150×250mm，洗脱方式为100%二氯甲烷等度洗脱10min，25%二氯甲烷-甲醇溶液等度洗脱20min，上样量为400ml，流速为700ml/min。
3.4取组分C用正己烷︰二氯甲烷︰乙醇=4︰6︰1的溶液溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱，5%乙醇-正己烷溶液等度洗脱，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分，旋蒸浓缩后真空干燥，即为本发明目的抗肿瘤活性组分。
具体地，使用的色谱柱填料为粒径5μm的硅胶（Hilica）、大小为10×250mm，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱5min，5%乙醇-正己烷溶液等度洗脱47min，上样量为1.5ml，流速为5ml/min。
上述提取方法的关键在于色谱分离，而色谱分离的关键在于流动相，通过流动相种类的选择、同一次色谱分离过程中不同流动相配比的选择、多次色谱分离之间不同流动相种类和不同配比的选择，使蛹虫草中组分被充分分离开，从而使成功从蛹虫草中提取到目的抗肿瘤活性组分，使提取得到的抗肿瘤活性组分纯度高。
所述步骤（3）中体外抗肿瘤活性筛选是指进行抑制人肺癌A549细胞生长试验和抑制人肝癌Hep-G2细胞生长试验，具体地，是指采用实时无标记动态细胞分析技术实时检测加药后人肺癌A549细胞和人肝癌Hep-G2细胞的生长情况，同时可获得药物介导的细胞效应曲线，通过该曲线判断该药物是否抑制癌细胞的生长。与传统方法（MTT）对比优势在于，实验操作简单，步骤少，人为误差小。采用无标记方法，不存在标记效率问题，并且对细胞无损伤，细胞在最接近生理状态下进行检测，结果准确度高。实验结果客观，重复性好，不需设置重复孔。该方法可以很好地判断待测组分的抗肿瘤活性，因为在实验中我们发现，各待测组分对这两种细胞的抑制基本是同步的，即不存在第1号组分对人肺癌A549细胞抑制作用最好而第2组分对人肝癌Hep-G2细胞抑制作用最好的情况，基本上选取的目的组分要么对两种细胞的抑制作用都是最好的，要么对其中一种细胞抑制作用最好、而另一种细胞所有的组分抑制效果都比较差。
本发明还进一步提供上述从蛹虫草中提取得到的抗肿瘤活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
1、本发明采用超微粉碎机进行低温超微粉碎，以破除蛹虫草子实体坚硬的细胞壁，有利于内容物的溶出，有效提高了蛹虫草子实体中抗肿瘤活性组分的提取率；
2、本发明采用制备液相色谱进行物质组分的分离纯化，运用先进的技术对细胞水平上是没有抗肿瘤活性的水提沉淀进行分离纯化，通过对各个分离步骤的试剂选择、工艺条件和工艺参数的优化，以及各个分离步骤之间良好的协同作用，最终成功提取到抗肿瘤活性组分，相对于传统的溶剂萃取法，该抗肿瘤活性组分的提取方法不但稳定性好，重复性好，得到的物质组分批次之间一致性高，而且提取率高，得到的活性组分具有强抗肿瘤活性；
3、本发明通过人肺癌A549细胞生长抑制试验和人肝癌Hep-G2细胞生长抑制试验来判定蛹虫草抗肿瘤活性组分的体外抗肿瘤能力，并设阳性对照，结果直观、易判断；
4、本发明蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法工艺简单，易于实施，具有快速、高效、重复性好、稳定可控、分离纯化制备量大、适用于工业化大规模生产等特点，所得的蛹虫草抗肿瘤活性组分可用于研发制备抗肿瘤药物，而由于该活性组分抗肿瘤有效成分含量高，使用该活性组分进行制备抗肿瘤药物时有效成分含量高，可以满足不同制剂载体形式对有效成分含量的需求；
5、本发明拓展了抗肿瘤药物或保健食品的原料来源，扩大了蛹虫草子实体的应用范围，使蛹虫草子实体成为抗肿瘤药物的有效组分原料，显著提高了蛹虫草子实体的附加值。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1（3）（a）步骤得到的色谱分离图；
图2所示的是本发明实施例1（3）（b）步骤得到的色谱分离图；
图3所示的是本发明实施例1（3）（c）步骤得到的色谱分离图；
图4所示的是本发明实施例1（3）（d）步骤得到的色谱分离图；
图5所示的是本发明实施例1制备的蛹虫草抗肿瘤活性组分抑制人肺癌A549细胞生长的细胞实时检测图，其中C310-10-8-14为目的组分（中间曲线），hlxa为环磷酰胺（下面曲线）；
图6所示的是本发明实施例1制备的蛹虫草抗肿瘤活性组分抑制人肝癌Hep-G2细胞生长的细胞实时检测图，其中C310-10-8-14为目的组分（中间曲线），hlxa为环磷酰胺（下面曲线）；
图7所示的是2,6-二甲基3-羟基癸烷的分子结构式。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1：蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取
1、原料、材料：
蛹虫草子实体为本实验室生产。
2、试剂：
超纯水由密立博纯水仪生产；丙酮购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、乙醇购自Honeywell公司。
3、仪器设备：
超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；旋转蒸发仪购自上海亚容生化仪器厂；10μmsilicaDAC150购自江苏迪沃特仪器设备科技有限公司；5μmHilica（10×250mm）购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。
蛹虫草子实体抗肿瘤活性组分的提取步骤如下：
（1）超低温粉碎：
取烘干的蛹虫草子实体为原料，称取150g烘干的蛹虫草子实体，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用2～10℃的水作为超微破碎机内部冷却液，以降低粉碎温度，确保有效成分的释放和生物活性的稳定，超微粉碎时间为5-20min，经过实践摸索12min为最宜，得到超微粉。
（2）溶剂提取：
（a）水煮：在超微粉中加入超纯水，超纯水的加入量为超微粉质量的8～10倍，100℃加热3～10小时进行提取，6000rpm离心取沉淀，然后重复两次，将三次得到的沉淀合并，在60℃鼓风干燥箱内干燥，得到粗品A。
（b）丙酮沉淀：在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量为粗品A质量的3倍，室温下浸提12～36小时，6000rpm离心后取沉淀，然后重复两次，将三次得到的沉淀合并，在60℃鼓风干燥箱内干燥，得到粗品B。
（3）色谱分离：
（a）取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离。色谱柱填料为粒径10μm的silica、大小为150×250mm，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱25min，100%乙酸乙酯等度洗脱15min，上样量为200ml，流速为700ml/min，检测波长为260nm，色谱图如图1所示，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分C3-10。
（b）取组分C3-10用100%乙酸乙酯50度超声至刚好溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离。色谱柱填料为粒径10μm的silica、大小为150×250mm，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，10%乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱20min，30%乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱15min，60%乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱20min，上样量为400ml，流速为700ml/min，检测波长为260nm，色谱图如图2所示，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分C310-10。
（c）取组分C310-10用100%二氯甲烷50度超声至刚好溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离。色谱柱填料为粒径10μm的silica、大小为150×250mm，洗脱方式为100%二氯甲烷等度洗脱10min，25%二氯甲烷-甲醇溶液等度洗脱20min，上样量为400ml，流速为700ml/min，检测波长为260nm，色谱图如图3所示，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分C310-10-8。
（d）取组分C310-10-8用正己烷︰二氯甲烷︰乙醇=4︰6︰1的溶液溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离。色谱柱填料为粒径5μm的Hilica、大小为10×250mm，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱5min，5%乙醇-正己烷溶液等度洗脱47min，上样量为1.5ml，流速为5ml/min，检测波长为260nm，色谱图如图4所示，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分，旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分C310-10-8-14，共0.2g，即为本发明目的抗肿瘤活性组分。
上述得到的抗肿瘤活性组分C310-10-8-14经过制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，初步判定主要含有2,6-二甲基3-羟基癸烷（分子结构式如图7所示）及其他未知物。
实施例2：抑制人肺癌A549细胞生长试验
主要材料与试剂：
人肺癌A549细胞由艾森生物（杭州）有限公司赠送；F-12K培养基由Gibco公司赠送；环磷酰胺购自天津金世制药有限公司。
空白对照孔：不加药物；
阳性对照孔：加环磷酰胺；
实验孔：加实施例1所得的抗肿瘤活性组分C310-10-8-14。
细胞培养：
在5%C02，37℃，饱和湿度下，用F-12K（10%FBS+1%PS）培养基培养人肺癌A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为约5.7万/mL的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入5%C02，37℃饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150μLF-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的A549细胞悬液345μL，至每孔细胞数约2万，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物（C310-10-8-14）至终浓度为所需药物浓度（6.3μg/ml），用相同浓度的环磷酰胺作为阳性对照组，含0.1%DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。实验结果如图5所示，结果表明：本发明提取得到的蛹虫草抗肿瘤活性组分C310-10-8-14在6.3μg/ml时能达到基本抑制人肺癌细胞A549的生长。
实施例3：抑制人肝癌Hep-G2细胞生长试验
主要材料与试剂：
人肝癌Hep-G2细胞由天大科技园赠送；MEM培养基由Gibco公司赠送；环磷酰胺购自天津金世制药有限公司。
空白对照孔：不加药物；
阳性对照孔：加环磷酰胺；
实验孔：加实施例1所得的抗肿瘤活性组分C310-10-8-14。
细胞培养：
在5%C02，37℃，饱和湿度下，用MEM（10%FBS、1%PS）培养基人肺癌Hep-G2细胞，选取生长状态良好的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为约5.7万/mL的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入5%C02，37℃饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150μLMEM培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Hep-G2细胞悬液345μL，至每孔细胞数约4万，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物（C310-10-8-14）至终浓度为所需要药物浓度（6.3μg/ml），用相同浓度的环磷酰胺作为阳性对照组，含0.1%DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。实验结果如图6所示，结果表明：本发明提取得到的蛹虫草抗肿瘤活性组分C310-10-8-14在6.3μg/ml时能达到近100%抑制人肝癌细胞Hep-G2生长。
由于蛹虫草本身就可食用，所以其具有无毒、安全等特点，由本发明蛹虫草抗肿瘤活性组分可以得到有效的抗肿瘤新药和/或抗肿瘤保健品，具有高效、无毒且原料相对冬虫夏草廉价易得的特点。由于C310-10-8-14主要含有2,6-二甲基3-羟基癸烷，在浓度为6.3μg/ml时能达到100%抑制人肺癌细胞A549和人肝癌细胞Hep-G2的生长，这显示了C310-10-8-14在进一步开发有效的抗肿瘤单体药物方面的潜力。接下来我们将进行对活性组分C310-10-8-14大规模制备，争取获得抗肿瘤强活性单体化合物，开发出强活性抗肿瘤单体药物，为人类的健康奉献我们微薄的力量。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物制品加工的普通市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (8)
1.一种从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)超低温粉碎：
取烘干的蛹虫草子实体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用2～10℃的水作为超微破碎机内部冷却液，超微粉碎时间为5-20min，得到超微粉；
(2)溶剂提取：
水煮：在超微粉中加入超纯水，超纯水的加入量为超微粉质量的8～10倍，100℃加热3～10小时进行提取，离心取沉淀，然后重复1～3次，将得到的沉淀合并，干燥，得到粗品A；
丙酮沉淀：在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量为粗品A质量的2～4倍，室温下浸提12～36小时，离心后取沉淀，然后重复1～3次，将得到的沉淀合并，干燥，得到粗品B；
(3)色谱分离：
(a)取粗品B用50％乙酸乙酯-正己烷溶液溶解至浓度为50mg/ml，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100％正己烷等度洗脱，25％乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱，100％乙酸乙酯等度洗脱，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分A；
(b)取组分A用100％乙酸乙酯溶解至浓度为50mg/ml，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100％正己烷等度洗脱，10％乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱，15％乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱，30％乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱，60％乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分B；
(c)取组分B用100％二氯甲烷溶解至浓度为50mg/ml，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100％二氯甲烷等度洗脱，25％二氯甲烷-甲醇溶液等度洗脱，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分C；
(d)取组分C用正己烷：二氯甲烷：乙醇＝4：6：1的溶液溶解至浓度为50mg/ml，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100％正己烷等度洗脱，5％乙醇-正己烷溶液等度洗脱，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分，旋蒸浓缩后真空干燥，即为目的抗肿瘤活性组分。
2.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，其特征在于：所述步骤(1)中粉碎时间为12min。
3.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，其特征在于：所述步骤(2)中离心的转速为6000rpm。
4.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，其特征在于：所述步骤(2)中干燥在60℃鼓风干燥箱内进行。
5.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，其特征在于：
所述步骤(3)(a)中制备液相色谱使用的色谱柱填料为粒径10μm的硅胶、大小为150×250mm，洗脱方式为100％正己烷等度洗脱10min，25％乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱25min，100％乙酸乙酯等度洗脱15min，上样量为200ml，流速为700ml/min；
所述步骤(3)(b)中制备液相色谱使用的色谱柱填料为粒径10μm的硅胶、大小为150×250mm，洗脱方式为100％正己烷等度洗脱10min，10％乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱50min，15％乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱20min，30％乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱15min，60％乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱20min，上样量为400ml，流速为700ml/min；
所述步骤(3)(c)中制备液相色谱使用的色谱柱填料为粒径10μm的硅胶、大小为150×250mm，洗脱方式为100％二氯甲烷等度洗脱10min，25％二氯甲烷-甲醇溶液等度洗脱20min，上样量为400ml，流速为700ml/min；
所述步骤(3)(d)中制备液相色谱使用的色谱柱填料为粒径5μm的硅胶、大小为10×250mm，洗脱方式为100％正己烷等度洗脱5min，5％乙醇-正己烷溶液等度洗脱47min，上样量为1.5ml，流速为5ml/min。
6.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，其特征在于：所述步骤(3)中溶解液在进行制备液相色谱之前先用0.45μm有机膜抽滤。
7.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法，其特征在于：所述步骤(3)中体外抗肿瘤活性筛选是指进行抑制人肺癌A549细胞生长试验和抑制人肝癌Hep-G2细胞生长试验。
8.权利要求1所述的从蛹虫草中提取得到的抗肿瘤活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。
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