CN107365284A

CN107365284A - 一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法

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Publication number: CN107365284A
Application number: CN201710702206.2A
Authority: CN
Inventors: 文继承
Original assignee: GUILIN MINGXING BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUILIN MINGXING BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2017-11-21

Abstract

本发明公开了一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，包括下述步骤:包括如下步骤：1)原料处理；2)提取；3)双水相萃取：对步骤2)得到浸膏进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、氯化钠和水构成，聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为15‑25％，氯化钠在所述双水相体系中的质量百分比为10‑15％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为6000‑8000；4)氧化铝柱层析：将步骤3)获得的萃取有机相，脱盐，加入0.5‑1.0倍重量10％v/v的甲醇，浓缩，通过氧化铝柱层析，10％v/v的甲醇和0.05‑0.1％v/v的甘露醇洗脱，得到洗脱液，浓缩至干，得到紫杉醇半成品；5)后处理，得到紫杉醇成品。

Description

一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域的提取方法，具体是一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法。

背景技术

紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是当今重要的抗痛新药。1963年，沃尔(M.E.Well)和瓦尼(M.C.Wani)首次从红豆杉树皮和木材中分离得到含有紫杉醇的粗提物。早在1971年，由美国的Wani等从红豆杉厲植物短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)的树皮中发现并分离出的二萜类成分，与杜克大学姆克法尔(Mcphail)协作，用X射线确定了紫杉醇的化学结构，化学式为C₄₇H₄₆O₁₄N。1979年美国Horwitz等发现其具有良好的抗癌活性和独特的抑制微管解聚、稳定微管等效果。可用于卵巢癌和乳腺癌及非小细胞肺庙(NSCLC)的一线和二线治疗，以及头颈部癌、食管癌，精原细胞癌，复发非何杰金氏淋巴瘤等治疗。由于它特异的临床抗庙疗效，1992年被美国FDA批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。

然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中。为了解决紫杉醇的有限药源，国内外学者围绕红豆杉的栽培、紫杉醇的化学合成(包括半合成和全合成)、红豆杉组织和细胞培养等诸多领域，进行了有益的探索，取得了一些令人瞩目的进展。目前市场出售的紫杉醇都是从天然和栽培红豆杉的树皮或枝叶中直接提取得到的。其次，由于天然植物中紫杉醇含量极低，大约为0.01-0.07％，平均0.015％(质量分数)，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。

目前，国内外以红豆杉属植物为原料提取紫杉醇基本上还是采用传统的萃取法，有机溶剂主要采用乙醇、甲醇或甲醇和二氯甲烷混合溶剂提取，这些方法能耗较少，紫杉醇的回收率高，易于操作。而近年来又有报道用超临界液相色谱法提取短叶红豆杉皮叶，提取溶剂为C0₂或C0₂/EtOH，温度为45℃，压力为18.0-25.5MPa,效果较传统的溶剂法要好。

张志强等研究硅胶、C₁₈硅胶和氧化铝3种固相柱的萃取效果，结果发现采用碱性氧化铝柱层析分离和回收紫杉醇效果显著，后又对紫杉醇转化和分离条件优化，再进一步氧化铝柱层析，可使紫杉醇的含量由小于1.0％提高到大于27％,紫杉醇的回收率大于170％。Mattina等人则用超容量C₁₈固相柱，高容量C₁₈固相柱和Empore固相萃取盘对甲醇粗提物进行提取，其中Empore固相萃取盘紫杉醇的回收率为115.8％，且成本较其他2种方法低。固相萃取法在萃取效率以及良好的选择性方面无疑得到了许多人的关注，并投入了很大精力去研究实践，但它对于从培养液中提取紫杉醇明显存在着不足，这也就限制了它的应用。

复旦大学的陈建民等人用甲醇作为修饰剂，利用超临界C0₂流体萃取法从欧洲短叶红豆杉枝叶中提取紫杉醇及其伴生物，发现在40℃，27.6MPa进行超临界体萃取，萃取率高达96.7％。李青松等人也采用相同的方法条件萃取2h，萃取率基本一样。而中南大学发现用乙醇作为夹带剂，确定最佳工艺条件为：萃取时间3.5h,压力30MPa，温度47℃，平均提取率为87.76％。超临界流体萃取收率高、生产周期短、提取物有效成分不易被破坏，但该方法对设备要求高，操作条件严格，且用于粗提阶段成本较高，这样就阻碍了它应用到大规模的工业生产中。

因此，更有效地分离紫杉醇，对基础研究和实际应用有着极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，具有工艺简单，适合生产，时间短等优点。

本发明通过以下技术方案实现。

一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，具体包括如下步骤：

1)原料处理：将红豆杉鲜全株或鲜枝叶清洗干净，晾干，用粉碎机粉碎，检测紫杉醇含量；

2)提取：将步骤1)得到的粉碎原料加入甲醇加热提取，过滤，提取液浓缩得浸膏，检测紫杉醇含量；

3)双水相萃取：对步骤2)得到浸膏进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、氯化钠和水构成，聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为15-25％，氯化钠在所述双水相体系中的质量百分比为10-15％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为6000-8000；

4)氧化铝柱层析：将步骤3)获得的萃取有机相，脱盐，加入0.5-1.0倍重量10％(v/v)的甲醇，浓缩，通过氧化铝柱层析，10％(v/v)的甲醇和0.05-0.1％(v/v)的甘露醇洗脱，得到洗脱液，浓缩至干，得到紫杉醇半成品；

5)后处理：将步骤4)得到的紫杉醇半成品，溶解结晶，重结晶，干燥，得到紫杉醇成品。

本发明步骤1)所述的用粉碎机粉碎，优选用10mm网孔粉碎机粉碎，粉碎粒度为2-10mm。

步骤2)所述的将步骤1)得到的粉碎原料加入甲醇加热提取，提取液浓缩，优选将步骤1)得到的粉碎原料加入2-3倍重量的甲醇加热提取，45-50℃提取3-4次，每次2-3h，过滤，合并浓缩液，浓缩，温度控制≤50℃，真空控制在-0.08±0.01MPa，浓缩至0.95-1.05g/ml，得到浓缩提取液，检测紫杉醇含量。

步骤3)所述的对步骤2)得到浸膏进行双水相萃取，优选浸膏和双水相萃取液按照1:1-1.25的体积比。

步骤4)所述的脱盐，优选采用超滤法或透析法脱盐，超滤法采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，透析法采用截留分子量为1000-100000的透析袋脱盐；所述的浓缩，优选浓缩至0.95-1.05g/ml。

步骤5)所述的后处理，优选将步骤4)得到的紫杉醇半成品，用10％(v/v)甲醇溶解过滤结晶，再用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥，50-55℃干燥8-12h，得到紫杉醇成品，结晶母液重结晶。

双水相萃取工艺参数的研究：

1、考查PEG平均分子量(1000-8000)对双水相体系分配平衡的影响，显示PEG的平均分子量愈大，紫杉醇愈趋向于上相分配，因为随着PEG的平均分子量的增加，聚合物分子中亲水基的数目减少，疏水基的数目增大。因此两相中亲水性差距增大，紫杉醇在上相中的分配率增大，因此确定PEG平均分子量(6000-8000)为工艺参数。

2、考查PEG 6000与氯化钠质量分数对双水相体系分配平衡的影响，显示选取PEG6000的质量分数为15％，考查氯化钠质量分数(8-20％)的变化对紫杉醇在双水相中分配系数的影响，结果表明：实验条件下，氯化钠的浓度低时，提取率比较高是由于相比双水相体系上下相的体积比大，氯化钠的浓度高时，紫杉醇双水相体系的分配系数减少，因此，在氯化钠的质量分数为10-15％时，紫杉醇双水相体系最大，萃取率最高。

3、考查FEG 6000质量分数的变化对紫杉醇在双水相中分配平衡的影响，结果表明，随着PEG质量分数的增大，PEG 6000的质量分数15-25％时有数值较大，紫杉醇的萃取率也最高，从分配理论上解释，随着PEG质量分数的增大，黏度增大，阻止相分子转移的能力增大，使得紫杉醇大部分分布在上相。

本发明得到的紫杉醇，经HPLC检测，含量在99.8％以上。

与现有技术相比，本发明的优点：

1、现有技术中，工业上粗提紫杉醇多采用粉碎的红豆杉枝叶经甲醇反复提取后，浓缩成浸膏，以二氯甲烷、三氯甲烷、醋酸乙酯、石油醚、乙酸乙酯等萃取，但这种方法消耗有机溶剂量大，效率较低，不能有效地脱除浸膏中的色素，样品也容易被乳化，且要反复萃取多次，生产耗时。而本发明采用双水相萃取，通过大量的实验，考察双水相体系的研究，使得紫杉醇和其他成分完全分离。

2、现有技术中，一般是经过甲醇提取和二氯甲烷等萃取后得到粗品，HPLC分析表明，粗品经过氧化铝柱层析处理后，极性比紫杉醇弱的物质基本被除去，而极性比紫杉醇稍强的杂质用正相柱已很难分离，仅经一步正相柱层析，样品中的成分还较复杂，若直接上HPLC制备柱，必将影响HPLC柱的使用寿命、进料量等，在经过氧化铝正相柱层析处理后再采用一步反相层析，即采用一次C18固相萃取，以除去极性比紫杉醇稍强的杂质，但这样的操作，一个是增加工艺时长，也就增加了成本，另一个是，两个柱层析会影响到紫杉醇的收率。而本发明通过甲醇提取后结合双水相萃取，然后可以直接采用一次氧化铝柱层析，取得很好的效果。

3、本发明在实验中发现，氧化铝柱层析，用10％(v/v)的甲醇洗脱时，添加0.05-01％(v/v)的甘露醇，分离得到的紫杉醇纯度相比直接使用10％(v/v)的甲醇洗脱会明显提高，分离速度也能显著加快。

4、现有技术得到的紫杉醇含量一般不超过99.0％，本发明采用双水相萃取和柱层析技术的结合，可以极大的提高生产效率，现有技术柱层析一般为氧化铝柱层析或者大孔树脂柱层析，但是柱层析还是会用到大量的三氯甲烷等，易产生环保问题，同时增加了工艺时间和成本。双水相萃取技术作为一种新型的分离技术，具有条件温和、操作简便、易于放大、分离能力强等一系列优点，而采用本发明的技术结合，出现质的提高，可以增加紫杉醇的含量和提取效率，相比醇提后萃取，本发明时间短，紫杉醇含量高。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：

一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，具体包括如下步骤：

1)原料处理：将红豆杉鲜全株或鲜枝叶清洗干净，晾干，用粉碎机粉碎，用10mm网孔粉碎机粉碎，粉碎粒度为2-10mm，检测紫杉醇含量；

2)提取：将步骤1)得到的粉碎原料加入2倍重量的甲醇加热提取，45℃提取3次，每次2h，过滤，合并浓缩液，浓缩，温度控制≤50℃，真空控制在-0.08±0.01MPa，浓缩至0.95-1.05g/ml，得到浓缩提取液，检测紫杉醇含量；

3)双水相萃取：对步骤2)得到浸膏进行双水相萃取，浸膏和双水相萃取液按照1:1.25的体积比，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、氯化钠和水构成，聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为15％，氯化钠在所述双水相体系中的质量百分比为10％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为6000；

4)氧化铝柱层析：将步骤3)获得的萃取有机相，采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，加入0.5倍重量10％(v/v)的甲醇，浓缩至0.95-1.05g/ml，通过氧化铝柱层析，10％(v/v)的甲醇和0.05％(v/v)的甘露醇洗脱，得到洗脱液，浓缩至干，得到紫杉醇半成品；

5)后处理：将步骤4)得到的紫杉醇半成品，用10％(v/v)甲醇溶解过滤结晶，再用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥，50℃干燥12h，得到紫杉醇成品，结晶母液重结晶。

实施例2：

一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，具体包括如下步骤：

2)提取：将步骤1)得到的粉碎原料加入3倍重量的甲醇加热提取，50℃提取3次，每次3h，过滤，合并浓缩液，浓缩，温度控制≤50℃，真空控制在-0.08±0.01MPa，浓缩至0.95-1.05g/ml，得到浓缩提取液，检测紫杉醇含量；

3)双水相萃取：对步骤2)得到浸膏进行双水相萃取，浸膏和双水相萃取液按照1:1的体积比，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、氯化钠和水构成，聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为20％，氯化钠在所述双水相体系中的质量百分比为15％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为7000；

4)氧化铝柱层析：将步骤3)获得的萃取有机相，采用截留分子量为1000-100000的透析袋脱盐，加入1.0倍重量10％(v/v)的甲醇，浓缩至0.95-1.05g/ml，通过氧化铝柱层析，10％(v/v)的甲醇和0.1％(v/v)的甘露醇洗脱，得到洗脱液，浓缩至干，得到紫杉醇半成品；

实施例3：

一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，具体包括如下步骤：

3)双水相萃取：对步骤2)得到浸膏进行双水相萃取，浸膏和双水相萃取液按照1:1.25的体积比，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、氯化钠和水构成，聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为15％，氯化钠在所述双水相体系中的质量百分比为15％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为8000；

5)后处理：将步骤4)得到的紫杉醇半成品，用10％(v/v)甲醇溶解过滤结晶，再用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥，55℃干燥8h，得到紫杉醇成品，结晶母液重结晶。

紫杉醇的检测：

将红豆杉鲜全株或鲜枝叶清洗干净，晾干，用粉碎机粉碎，用10mm网孔粉碎机粉碎，粉碎粒度为2-10mm，检测紫杉醇含量。取适量样品，精密称定，用甲醇(色谱纯)溶解于10ml或25ml容量瓶中，于超声波超声3-5min完全溶解，定容至刻度。取一定量溶解后的样品，于高速离心机10000rpm离心5min。取离心后的上清液适量，用注射器通过0.45μm滤膜滤过，注入样品瓶中，待检测。利用高效液相色谱仪对待检测样品进行测定。检测条件：进样量为5μl，C18柱(250X4.6mm)，柱温25℃，乙腈－水(34：69)等度洗脱10min，再以每分钟1.75％的速度提高乙腈比例至乙腈－水(45：55)，洗脱至目标物质完全出峰，得峰面积。利用外标法进行定量，按干燥品计，紫杉醇含量不得小于0.3％。

结果：

对比例1

方法同实施例，区别在于，氧化铝柱层析时，洗脱时没有添加甘露醇，得到紫杉醇成品含量99.1％。

对比例2：

3)三氯甲烷萃取：对步骤2)得到浸膏进行萃取，浓缩提取液和三氯甲烷萃取液按照1:1.25的体积比，开动搅拌，搅拌时要变频正反转，搅拌15-30min，静置1h后分层分离，将分层的有机相打到浓缩罐，浓缩液萃取3次；

4)氧化铝柱层析：将步骤3)获得的萃取有机相，采用超滤法超滤法采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，加入0.5倍重量10％(v/v)的甲醇，浓缩至0.95-1.05g/ml，通过氧化铝柱层析，10％(v/v)的甲醇和0.05％(v/v)的甘露醇洗脱，得到洗脱液，浓缩至干，得到紫杉醇半成品；

5)后处理：将步骤4)得到的紫杉醇半成品，用10％(v/v)甲醇溶解过滤结晶，再用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥，50℃干燥12h，得到紫杉醇成品，结晶母液重结晶，得到紫杉醇成品含量98.4％。

Claims

1.一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

4)氧化铝柱层析：将步骤3)获得的萃取有机相，脱盐，加入0.5-1.0倍重量10％v/v的甲醇，浓缩，通过氧化铝柱层析，10％v/v的甲醇和0.05-0.1％v/v的甘露醇洗脱，得到洗脱液，浓缩至干，得到紫杉醇半成品；

2.根据权利要求1所述的一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征在于：步骤1)所述的用粉碎机粉碎，是用10mm网孔粉碎机粉碎，粉碎粒度为2-10mm。

3.根据权利要求1所述的一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征在于：步骤2)所述的将步骤1)得到的粉碎原料加入甲醇加热提取，提取液浓缩，是将步骤1)得到的粉碎原料加入2-3倍重量的甲醇加热提取，45-50℃提取3-4次，每次2-3h，过滤，合并浓缩液，浓缩，温度控制≤50℃，真空控制在-0.08±0.01MPa，浓缩至0.95-1.05g/ml，得到浓缩提取液，检测紫杉醇含量。

4.根据权利要求1所述的一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征在于：步骤3)所述的对步骤2)得到浸膏进行双水相萃取，浸膏和双水相萃取液按照1:1-1.25的体积比。

5.根据权利要求1所述的一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征在于：步骤4)所述的脱盐，是采用超滤法或透析法脱盐，超滤法采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，透析法采用截留分子量为1000-100000的透析袋脱盐。

6.根据权利要求1所述的一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征在于：步骤5)所述的后处理，将步骤4)得到的紫杉醇半成品，用10％v/v甲醇溶解过滤结晶，再用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥，50-55℃干燥8-12h，得到紫杉醇成品，结晶母液重结晶。