CN101580805A - 布雷菲德菌素a产生菌及发酵法生产布雷菲德菌素a - Google Patents

Abstract

本发明涉及Brefeldin A产生菌及制备方法，以及Brefeldin A发酵生产方法与用途。Brefeldin A产生菌的菌种选育与保藏容易，成本低廉，工艺简单，生产周期短，产量高，不使用毒性原料，有机溶剂使用少，药源可以充分保障，具有大规模生产的潜力，并具有良好的经济效益与社会效益，有利于维持生态平衡和保护自然资源。本发明对以二苯乙烯苷为主要成分的发酵产物拓展了新的医药用途，Brefeldin A安全低毒，性质稳定，药理作用较强，制备工艺简单，得率高，使用范围特别广，一物多用，能够为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病提供了一种新的药物来源。

Description

布雷菲德菌素A产生菌及发酵法生产布雷菲德菌素A

技术领域

本发明涉及医药和食品技术领域，具体地说是涉及一种真菌及其发酵产物的制备方法即一种被孢霉属Mortierella Coemans内生真菌及其发酵产物的制备方法，更具体地说是涉及单孢被孢霉Mortierella monospora Linnemann及其发酵产物Brefeldin A的制备方法。

背景技术

(一)Brefeldin A的研究概况

1、概述

布雷菲德菌素A(英文名：BrefeldinA，简称：BFA，中文名称或为：布雷菲尔得菌素A，亦有写作：布雷非德菌素A，也称作斜卧菌素或蓝菌素或壳二孢素)，是一种大环内酯类抗生素，最早于1958年分离自Penicillium brefeldianum。

Brefeldin A具有多种生物活性，如抗真菌，抗病毒，抗肿瘤，抗线虫等。Brefeldin A是一种广泛应用的蛋白转运抑制剂，当细胞活化时用来阻断细胞内因子的分泌从而增强染色信号，染色细胞内因子时尤为有效，它可以使绝大多数细胞因子聚集于高尔基体/内质网状结构内。

Brefeldin A为真菌的代谢产物，显示多种抗生素活性：既能够阻断有蛋白G介导的细胞质包被蛋白b-COP和ARF与高尔基体的结合，也能够阻断蛋白向高尔基结构的转移，还能够活化神经鞘磷脂循环，在某些人类肿瘤细胞中还观察到Brefeldin A介导的凋亡。

2、Brefeldin A的化学结构与制备方法

Brefeldin A化学名：1，6，7，8，9，11a，12，13，14，14a-Decahydro-1，13-dihydroxy-6-methyl-4H-cyclopent[f]oxacyclotridecin-4-one；Ascotoxin；Cyanein，为无色晶体，分子结构如下：

物理化学性质

分子式        C₁₆H₂₄O₄

分子量        280.36

熔点          Mp 204-205℃

闪点          87℃

旋光度        [α]_D ²²+96(MeOH)

UV            λ_max ^EtOH 215(ε11200)

纯度          ≥99.0％(HPLC，TLC)

物理特征      棱晶(MeOH/Et₂O)

CAS登录号     20350-15-6

它的最佳使用方法依据细胞种类和孵育时间不同而改变。一般地抑制剂与活化剂在细胞收集前4～24小时内与细胞一起进行孵育。BrefeldinA溶液是1,000×浓缩液，使用前要将使用培养液稀释至1×溶液。

有研究报道，通过建立高效布雷菲德菌素A产生菌筛选模型，获得一株布雷菲德菌素A高产菌株A2702。经鉴定，该菌株属于Penicillium sp.；结合系统的菌种选育工作和培养条件优化，建立了Penicillium sp.A2702分批发酵生产布雷菲德菌素A工艺，目标产物累积浓度达到1000mg/l，远远高于能检索到的报道水平(约300mg/l)；后续的多因素优化控制和分批补料策略进一步提高了发酵液中布雷菲德菌素A的累积浓度；基于布雷菲德菌素A独特的理化性质，建立了从发酵液中提炼布雷菲德菌素A工艺和结晶工艺，提取收率在75％以上，产物纯度达到95％左右，技术指标达到国际先进水平。世界各国市场上对布雷菲德菌素A需求很大，布雷菲德菌素A作为医药中间体的销售价格约为1600万元/公斤，大规模生产抗肿瘤药物布雷菲德菌素A工艺具有良好的经济效益与社会效益。

而目前的化学合成方法制备Brefeldin A工艺复杂，周期长，成本高，毒性大，且合成过程中不可避免对操作人员健康的损害。Young-Ger Suh等关于Brefeldin A的化学全合成经过15个步骤，最终产量为7.9％。

3、Brefeldin A的药理研究进展

大环内酯类化合物(macrolides)是一类具有抗真菌、抗肿瘤活性的化合物，分子结构中含有内酯环，环的大小差别较大，从十元环到六十元环都有。大环内酯属于天然产物中的多烯酮类，大环内酯的副作用比较少，是一种较为安全的药物。

大环内酯类抗生素是一类毒性低微、口服方便且价格较廉的药，按其大环结构含碳母核的不同，可分为14、15和16元环大环内酯类抗生素，在治疗学上的重要性仅略次于β-内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类等)和氨基糖甙类。自1952年美国礼来公司推出第一代大环内酯类抗生素产品——红霉素后，该大类药物不断扩充，迅速成为全球抗感染用药中的一个十分重要的类别。

目前沿用的大环内酯类有红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、柱晶白霉素；大环内酯类新品种(新大环内酯类)有阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素等，它们对流感嗜血杆菌、肺炎支原体或肺炎衣原体等的抗微生物活性增强。

Brefeldin A是一种天然存在的大环内酯类抗生素，研究发现，Brefeldin A抑制蛋白质由内质网向高尔基体复合物转运过程，具有抗菌、抗病毒和抗癌活性。

Brefeldin A具有多种生物活性，如抗真菌、抗病毒(抗生、抗滤过性病原体、抗有丝分裂、抑制细胞生长)、抗肿瘤等。Brefeldin A的主要功能是能诱导高尔基体的分解，抑制蛋白从内质网(简称：ER)中转移为高尔基体的复合物(小分子Brefeldin A能非竞争性地抑制蛋白)，目前被作为一种重要的分子工具广泛用于研究哺乳动物的信号传导途径的研究。国际肿瘤协会在抗肿瘤体外筛选中发现Brefeldin A作为血疗法试剂有很大的应用前景。

Brefeldin A在抗肿瘤方面显示了显著的药理活性，其抗人胃癌细胞(MKN45)、人肝癌细胞(HepG2)及人白血病细胞(HL-60)的IC₅₀均＜0.001μg/ml，活性大于阳性对照阿霉素。

(二)有关Brefeldin A产生菌——单孢被孢霉的研究进展

Brefeldin A的产生菌，经鉴定为毛霉目(Mucorales)，被孢霉科(Mortierellaceae)，被孢霉属(Mortierella Coemans)的单孢被孢霉(Mortierella monospora Linnemann)。

该菌株在PDA培养基上培养3天以后，可见直径0.5～1.5cm菌丛，边缘不整齐，菌丝白色，低矮，绒状。孢囊梗直立，10～80μm不等，不分枝，顶生孢子囊，孢子囊单孢子，球形，无囊轴。接合孢子为一厚层的交织菌丝所包被。

毛霉目是接合菌纲中最大、最重要的1目。通常菌丝体发达、多核、无隔，少数比较高等的类型也可在一开始就形成隔膜。气生菌丝体往往生长繁茂，呈毛状，中文的目名即由此而来。其大多为腐生菌，很多种类可以从土壤、动物粪便、动植物、食品上分离出来。少数种类为其他真菌、动植物以及人的寄生菌。

分类地位：

真菌门[Fungi]

    藻菌纲[Phycomycetes]

        毛霉目[Mucorales]

            被孢霉科[Mortierellaceae]

                被孢霉属[Mortierella Coemans]

                    单孢被孢霉[Mortierella monospora Linnemann]

毛霉目下分为毛霉科、被孢霉科、枝霉科、辐枝霉科等九科；

其中，被孢霉科有不具囊轴或囊轴极端退化的大型孢子囊、小型孢子囊或单孢孢子囊，各种孢子囊不在同一孢囊梗上，接合孢子有包被，配囊柄钳状。

被孢霉科下分为被孢霉、拉曼被孢霉、多头被孢霉、小被孢霉、土生被孢霉、葡酒色被孢霉、肿基被孢霉、深黄被孢霉、顶毛被孢霉等属。

单孢被孢霉(Mortierella monospora Linnemann)属于被孢霉属(Mortierella Coemans)，是土壤真菌的一种，现研究发现从单孢被孢霉中能够分离得到抗生素类物质。

目前中国多采用被孢霉发酵生产花生四烯酸及γ-亚麻酸等。花生四烯酸属于ω-6系列的多不饱和脂肪酸，是人体前列腺素合成的重要前体物质，具有酯化胆固醇、抑制血小板聚集、增加血管弹性、降低血液黏度、调节白细胞功能、提高免疫力等一系列生理活性，已在保健食品、医药、化妆品等领域得到广泛应用。微生物发酵法为生产花生四烯酸开辟了新途径，它具有不受原材料及气候限制、生长周期短、培养工艺简单、花生四烯酸含量高等特点，近几年已成为世界各国研究的热点。由于被孢霉发酵具有生物量大和油脂含量丰富的特点，世界各国专家学者对此进行了大量的研究，并取得了显著的效果(刘洋，谢飞.被孢霉发酵生产花生四烯酸的研究进展.江苏食品与发酵.2007，2：13-16)。

(三)常用的有效成分提取分离方法

1、溶剂提取法

(1)原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。

当溶剂加到中草药等原料(需适当粉碎)中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。

中草药等成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。有机化合物分子结构中亲水性基团多，其极性大而疏于油；有的亲水性基团少，其极性小而疏于水。各类溶剂的性质，同样也与其分子结构有关。这样，发明人就可以通过对中草药成分结构分析，去估计它们的此类性质和选用的溶剂。总的说来，只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓“相似相溶”的规律。这是选择适当溶剂自中草药中提取所需要成分的依据之一。

(2)溶剂的选择：运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；②溶剂不能与中药的成分起化学变化；③溶剂要经济、易得、使用安全等。常见的提取溶剂可分为以下三类：

①水：水是一种强的极性溶剂。中草药中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及苷类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。

②亲水性的有机溶剂：也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇(又称：酒精)、甲醇(又称：木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取比用水量较少，提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因，用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一。甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低(64℃)，但有毒性，使用时应注意。

③亲脂性的有机溶剂：也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此，大量提取中草药原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。

(3)提取方法：用溶剂提取中草药成分，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑。

①浸渍提取法(简称：浸渍法)：浸渍法系将中草药粉末或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂(如乙醇、稀醇或水)，浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，且如用水为溶剂，其提取液易发霉变质，须注意加入适当的防腐剂。

②渗漉提取法(简称：渗漉法)：渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。当溶剂渗进药粉、溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀浸出液作为另一批新原料的溶剂之用。

③煎煮提取法(简称：煎煮法)：煎煮法是中国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。

④加热回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材约为容量的20％～60％，溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾3～6小时，放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。

⑤连续回流提取法：应用挥发性有机溶剂提取中草药有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。

2、分离和纯化方法：

上述提取法所得到的中草药提取液或提取物仍然是混合物，需进一步除去杂质，分离并进行精制。

(1)溶剂分离法：一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。水浸膏或乙醇浸膏常为胶状物，难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全，可拌入适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后低温或自然干燥，粉碎后，再以选用溶剂依次提取，使总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。利用中草药化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化，是最常用的方法。

(2)溶剂萃取法：

①萃取法：溶剂提取萃取法又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分在溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高；如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行萃取，如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时，多用乙酸乙脂和水萃取。提取亲水性强的皂苷则多选用正丁醇、异戊醇和水作萃取。不过，一般有机溶剂亲水性越大，与水作萃取的效果就越不好，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响很大。

②逆流连续萃取法：是一种连续的溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加溶剂萃取时的接触面。如果一种中草药的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取是否完全，可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉淀反应进行检查。

③逆流分配法：逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。

④液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的溶剂萃取法。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成，并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面，促进溶质在溶剂中的分配，故其分离效果往往比逆流分配法好。

(3)大孔吸附树脂法：大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有良好的吸附性能，近十余年来逐渐被应用于中草药化学成分的提取分离和中药新药的开发研制。

大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或生成氢键的结果。筛选原理是由于其本身多孔性结构所决定。由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开。这使得有机化合物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。大孔吸附树脂的骨架由苯乙烯和二乙烯苯缩聚而生成，由于改性剂的加入，大孔吸附树脂的极性发生改变，按照树脂的表面性质，吸附树脂一般分为非极性、中极性和极性三类。

非极性吸附树脂是由偶极矩很小的单体聚合物制得的不带任何功能基的吸附树脂。典型的例子是苯乙烯-二乙烯苯体系的吸附树脂，如D101、XAD-1、DiaionHP-10大孔吸附树脂。

中极性吸附树脂指含酯基的吸附树脂，如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯与双甲基丙烯酸酯等交联的一类共聚物。它是在非极性大孔吸附树脂的基础上，加入丙烯酸甲酯或丙烯腈缩聚而成，如中国国内经常使用的AB-8大孔吸附树脂。

极性吸附树脂是指含酰胺基、腈基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂。此外，有时把含氮、氧、硫等配体基团的离子交换树脂称作强极性吸附树脂，强极性吸附树脂与离子交换树脂的界限很难区别。极性大孔吸附树脂可以由甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺或亚砜类缩聚而成，如日本三菱化工的Diaion HP 2MG、美国Rohm-hass公司的XAD-10，XAD-9大孔吸附树脂。

与活性炭和其它吸附剂相比，大孔吸附树脂具有很多的优点，如对某种物质的吸附选择性较高；物理化学稳定性和机械强度较好；品种规格较多，可根据需要改变树脂物理或化学结构；吸附树脂一般为球状颗粒，流体阻力较小等等。因而被广泛应用于化工、医药等领域，近年来关于大孔吸附树脂在天然产物提取分离中的应用研究报道越来越多。大孔吸附树脂对中草药化学成分如生物碱、黄酮、皂苷、香豆素及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用。对糖的吸附能力很差，对色素的吸附能力较强。

(4)沉淀法：是在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。如铅盐沉淀法：铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。由于醋酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。然后将铅盐沉淀悬浮于新溶剂中，通以硫化氢气体，使分解并转为不溶性硫化铅而沉淀。

(5)盐析法：盐析法是在中草药的水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。

(6)透析法：透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制。

(7)结晶、重结晶和分步结晶法：鉴定中草药化学成分，研究其化学结构，必须首先将中草药成分制备成单体纯品。在常温下，物质本身性质是液体的化合物，可分别用分馏法或层析法进行分离精制。一般地说，中草药化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶体的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。

3、常用干燥方法

(1)真空干燥：是基于这样一基本原理：水的饱和蒸气压与温度紧密相关，在真空状态下，水的沸点降低，即在真空下操作也就是在低温下操作，可避免在高温下营养成分如维生素等的破坏，同时提高了干燥速度。真空干燥在食品、制药、化工等行业有广泛的应用，中国也开发和引进了各种真空干燥设备，其结构形式多种多样。常用的形式主要有箱式真空干燥器、双锥式真空干燥器、带式真空干燥器等。这些传统的真空干燥装置主要采用热风，蒸汽或电等加热，利用热传导、对流或辐射原理将热量从外部传到物料内部。真空干燥具有干燥温度低，干燥室内相对缺氧，可避免脂肪氧化，色素褐变等一系列优点，适合于热敏感性食品物料的干燥，此外设备成本、干燥费用也相对较低。

(2)喷雾干燥：是流化技术用于液态物料干燥的一种方法。因是瞬间干燥，特别适用于热敏性物料，故所得产品质量好，保持原来的色香味，且易溶解。利用喷雾干燥来制备微囊的研究正在进行，它是将心料混悬在衣料的溶液中，经离心喷雾器将其喷入热气流中，所得的产品是衣料包心料而成的微囊，这种微囊粉末可采用于直接压片，也可制备胶囊剂、糖浆剂或混悬剂。

(3)冷冻干燥：是将干燥液体物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用冰的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥的一种方法。由于物料在高度真空及低温条件下干燥，故对某些极不耐热物品的干燥很适合。王大林报道了一种喷雾通气冻干新技术，是利用冷的空气或氮气作为介质，迅速流经冻结物使水升华，喷雾冻干制得的产品微粒小、干燥快、时间短、均匀、流动性好，并具良好的速溶性。近年来，对膏状物料和粘稠物料干燥的研究取得了较大进展，流态化技术、喷射技术、惰性载体技术，则是在此研究基础上发展起来的。旋转闪蒸干燥机、热喷射气流干燥机、惰性载体干燥机均适合热敏性物料和膏状物料的干燥。这些新的研究成果用于中药制剂生产，将大大改善中药加工的技术水平，提高生产效率。

(4)远红外加热干燥法：是一项新的干燥技术，其干燥原理是将电能转变为远红外辐射，从而被药材的分子吸收，产生共振，引起分子和原子的振动和转动，导致物体变热，经过热扩散、蒸发和化学变化，最终达到干燥的目的。远红外干燥可节省电能20％～50％，效果较好。

(5)微波干燥法：是一项20世纪60年代迅速发展起来的新技术，微波干燥实际上是通过感应加热和介质加热，使被干燥物中的水分和脂肪不同程度地吸收微波能量，并把它转变为热量从而达到干燥的目的。微波干燥可杀灭微生物和霉菌，并具有消毒作用。目前中国生产的微波加热成套设备有915mhz和2450mhz两个频率。

(四)抗真菌、抗病毒(抗生、抗滤过性病原体、抗有丝分裂、抑制细胞生长)、抗肿瘤的研究概况

抗生素是由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类代谢物，以及甚至用化学方法合成或半合成的化合物。1981年中国第四次全国抗生素学术会议指出：近些年来在抗生素的作用对象方面，除了抗菌以外，在抗肿瘤，抗病毒，抗原虫、寄生虫和昆虫等领域也有较快发展。有些抗生素具有抑制某些特异酶的功能，另外一些抗生素则具有其他的生物活性或生理活性的作用。鉴于“抗菌素”早已越出了抗菌范围，继续使用抗菌素这一名词已不能适应专业的进一步发展，也不符合实际情况了。因此，会议决定将抗菌素正式更名为抗生素。

能抑制或杀灭真菌的药物，除一些古老的抗真菌外用药如水杨酸、碘剂、硫黄等外，抗真菌作用显著的新药有抗生素和合成药两大类。

①抗生素。主要有灰黄霉素、制霉菌素和二性霉素B等。灰黄霉素只对皮肤癣菌病有效，主要是头癣、体癣、股癣、手足甲癣等，口服时，20～30天为一个疗程，需合并外用治癣药物。长期使用有少数浅部真菌产生耐药菌株，可换用酮康唑。制霉菌素治疗胃肠道念珠菌病，外用治疗皮肤粘膜念珠菌感染，也可制成坐药。二性霉素B主要治疗深部真菌病，如系统性念珠菌病、隐球菌病、曲霉病、结合菌病、芽生菌病、巴西副球孢子菌病、球孢子菌病和组织胞浆菌病等。将此药加入5％葡萄糖溶液中，缓慢静脉滴注。

②合成药。包括：咪唑类药物(如克霉唑、益康唑、咪康唑和酮康唑等)、氟胞嘧啶等。

抗生素抗真菌机理：包括①对真菌细胞壁、细胞膜的损害作用；②对真菌细胞核酸、蛋白质的作用；③对细胞能量代谢的影响等(谢小梅，许杨.抗真菌中药的作用机理研究进展.中国中药杂志.2004，3：200-202)。

抗肿瘤药物，简单说来有化疗药物、生物制剂。化疗药物根据作用分为：

①干扰核酸生物合成的药物，如二氢叶酸还原酶抑制药甲氨蝶呤；

②直接影响DNA结构和功能的药物，如破坏DNA的铂类化合物；

③干扰转录过程和阻止RNA合成的药物，如放线菌素D；

④抑制蛋白质合成与功能的药物，如微管蛋白活性抑制剂紫杉醇；

⑤调节体内激素平衡的药物等几类。

真菌、病毒和肿瘤，时刻威胁着人类的生命健康，而抗生素是针对所有能够医治杀灭的生命体，包括细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞等，使用率非常高。抗生素的不规范使用，是目前世界的一大难题，一个方面是引起细菌耐药，细菌耐药产生的速度远远快于社会新药开发的速度，长此以往，人类可能会退回到二十世纪七、八十年代以前的状态，没有抗生素使用，人类将再一次面临很多感染性疾病的威胁；另一方面，抗生素进入人体后发挥治疗效果的同时会引起很多的不良反应，用的药物越多，引起不良反应的机会越高，中国药物不良反应监测中心的记录显示，中国的药物不良反应三分之一是由抗生素引起的，这个比例和抗生素的使用比例是一致的。

研究开发出疗效好、副作用小的抗生素迫在眉睫。结合中国丰富的医药资源，从中发掘有效、低毒、价廉的抗真菌、抗病毒(抗生、抗滤过性病原体、抗有丝分裂、抑制细胞生长)、抗肿瘤的药物来源及其制备方法与新的用途，都具有非常重要的意义。

经文献检索等，到目前为止，尚未发现有Brefeldin A新的产生菌单孢被孢霉以及该产生菌发酵法制备Brefeldin A的方法方面的报道。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是公开了一种真菌及其制备方法与用途：制备发酵产物Brefeldin A，以及发酵产物Brefeldin A的制备方法以及该发酵产物的用途，即该发酵产物用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明的一个目的是通过技术实验等研究和理论探索，意在明确一种真菌及其制备方法和用途，即单孢被孢霉Mortierella monospora Linnemann及其制备方法和其用途：发酵法制备其发酵产物Brefeldin A。

本发明的另一个目的是提供发酵产物Brefeldin A及其制备方法与用途——在抗真菌、抗病毒、抗肿瘤应用方面的活性：发酵产物Brefeldin A及其药物组合物作为制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品的应用。在该组合物中，本发明所述的发酵产物占10％～90％(重量百分比)，优选占50％～99％(重量百分比)，最优选占85％(重量百分比)。

(一)本发明所采用的定义

本发明所述的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品是包括抗真菌产品、抗病毒产品和抗肿瘤产品；

本发明所述的抗真菌产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究由真菌引起的疾病及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的真菌优选白色念珠菌(Candida albicans)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)或薰烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)等中的一种或多种。

本发明所述的抗病毒产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究由病毒引起的疾病及其直接相关疾病的产品中的一种或多种。

本发明所述的抗肿瘤产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究肿瘤及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的肿瘤优选胃癌细胞(MKN45)、肠癌细胞(LOVO)、肝癌细胞(HepG2)或白血病细胞(HL-60)等中的一种或多种所导致的肿瘤，进一步优选胃癌细胞(MKN45)或肝癌细胞(HepG2)等中的一种或多种所导致的肿瘤。

本发明所述的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品均是包括医药和食品等领域产品中的一种，是包括药物、试剂或食品等中的一种或多种，优选药物。

本发明所述的发酵产物是指Brefeldin A(布雷菲尔得菌素A)，供试样品均是采取常规的制备方法或是本发明所述的制备方法获得，所得到的发酵产物中的Brefeldin A含量一般＜60％；但是通过对发酵产物进行纯化，得到纯化后的发酵产物的纯度能够在95％以上，即本发明所定义的发酵产物。

也就是说，采用发酵产物的主要成分Brefeldin A为原料，或者是直接采用含有BrefeldinA的药材如Brefeldin A产生菌等为原料，或者直接采用含有Brefeldin A的发酵产物为原料，都能够直接或间接用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品。

Brefeldin A优选以基本纯的形式使用即本发明所定义的发酵产物，如Brefeldin A的纯度≥95％。

本发明所述的Brefeldin A产生菌是指被孢霉属Mortierella Coemans内生真菌——单孢被孢霉Mortierella monospora Linnemann。

Brefeldin A是预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤的活性成分，其使用方式是包括单独使用或与其他化学物质联合使用等中的一种，优选单独使用，均能够用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品。

(二)技术构思

自主开发创新药物是中国目前的一项紧迫任务，中国医药学具有悠久的历史，在疾病预防和治疗方面也积累了丰富的经验，因此积极寻找有效的活性成分来源和制备方法或发现其新的用途均是有效的快捷途径，也是中国快捷创新药物研制的优势之所在。

鉴于Brefeldin A具有多种生物活性及潜在的药用价值，故开发和研究Brefeldin A的工作已受到人们的广泛重视，是目前国际上抗癌药物研究的一个热点。世界各国市场上对Brefeldin A需求很大，Brefeldin A作为医药中间体的销售价格约为1000元/mg(纯度≥99.0％)。国际上在BFA的生物活性方面做了大量工作，但是中国对该化合物的研究甚少，特别在微生物发酵生产BFA方面尚属空白。

本发明涉及到从园参中分离得到的一种被孢霉属Mortierella Coemans内生真菌——单孢被孢霉Mortierella monospora Linnemann，是国际上新发现的布雷菲尔得菌素A(BrefeldinA)产生菌。发酵后的Brefeldin A产量可达到380mg/L以上。这是目前已有报道中BrefeldinA产量较高的菌种。

发明人经过研究的最新发现是：一种新的可生产Brefeldin A的菌种，扩大药用资源。并采用该产生菌发酵法生产Brefeldin A，将该发酵产物用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品。

涉及真菌、病毒、肿瘤等方面的疾病特别是肿瘤方面的疾病严重影响中国人口的健康和生存质量，研制预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等方面的产品，特别是药物、诊断试剂和保健品等，具有显著的社会效益、经济效益。

(三)真菌菌株及其制备方法与鉴定

本发明的目的是提供一种新的可生产Brefeldin A的菌种，扩大药用资源。由于BrefeldinA结构复杂，化学合成法很难实施，该菌种的制备方法为通过微生物发酵法生产Brefeldin A开辟了新途径。

本菌株制备方法是：

(1)挑选原药材，洗净晾干，消毒；

(2)干燥后，切块接种于培养基上，恒温培养箱培养；

(3)待菌丝长出时，把真菌转移到新的培养基上继续培养、转接；

(4)待纯化后，再转移到PDA培养基斜面试管中，即得到该真菌菌株，对其编号，备用。

所述的原药材优选人参等，进一步优选园参；

所述的消毒方法优选：在无菌操作台中用乙醇、NaClO溶液漂洗，无菌水冲洗；

其中所述的乙醇优选75％乙醇，所述的NaClO溶液优选5％NaClO溶液；

进一步优选的消毒方法的步骤是：

①在无菌操作台中用75％乙醇漂洗10～60秒；

②无菌水冲洗2～6次；

③5％NaClO溶液漂洗3～10分钟；

④无菌水冲洗2～6次；

⑤75％乙醇漂洗10～60秒；

⑥无菌水冲洗2～6次。

最优选的消毒方法的具体操作步骤是：

①在无菌操作台中用75％乙醇漂洗20～30秒；

②无菌水冲洗4次；

③5％NaClO溶液漂洗5分钟；

④无菌水冲洗4次；

⑤75％乙醇漂洗20～30秒；

⑥无菌水冲洗4次。

菌株鉴定：在PDA培养基上培养3天以后，可见直径0.5～1.5cm菌丛，边缘不整齐，菌丝白色，低矮，绒状。孢囊梗直立，10～80mm不等，不分枝，顶生孢子囊，孢子囊单孢子，球形，无囊轴。接合孢子为一厚层的交织菌丝所包被。经鉴定，确认为单孢被孢霉Mortierella monospora Linnemann。

本发明从园参制备得到的该Brefeldin A产生菌菌种Mortierella sp.Yuan-27保藏于第二军医大学药学院生药教研室，其菌种保藏号为Yuan-27，分类命名为Mortierella monospora。

(四)发酵产物的制备方法

本发明制备方法是以单孢被孢霉Mortierella sp.Yuan-27为发酵菌种，再先后采用液体发酵、溶剂萃取和有机溶剂重结晶方法，分离得到此种化合物。采用质谱、核磁共振氢谱和碳谱等方法，确定了该化合物的结构。

所述的发酵产物Brefeldin A的发酵法制备方法具体操作步骤如下：

(1)菌种的准备

使用PDA培养基，高温灭菌，制成斜面试管培养基，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种Mortierella monospora菌种Mortierella sp.Yuan-27菌丝体，于常温下培养，优选28℃培养，作为菌种。

(2)发酵种子液制备

在多个锥形瓶中分别装入PDA液体培养基；于高温灭菌后，进行接种Mortierellamonospora菌种Mortierella sp.Yuan-27，常温下振荡培养，优选28℃、180r·min^-1、培养48h，将该培养物作为发酵种子。

例如，于250ml的锥形瓶中加入80ml的PDA液体培养基，接种Mortierella monospora菌种Mortierella sp.Yuan-27菌丝体发酵培养48h，作为发酵种子。

(3)接种

准备发酵瓶，PDA发酵培养基装量适量，PDA培养基组成与种子培养基相同，高温灭菌，接种8％发酵种子液，常温下振荡培养，优选28℃、180r·min^-1，优选培养6～7天，真菌即可发酵成熟。

例如，于250ml的三角瓶中加入80ml的PDA液体培养基，接种8％发酵种子液进行发酵培养。

(4)制备结晶

待真菌发酵成熟后，分别收集发酵液和菌丝体：

①发酵液的处理方法：待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的滤液层进行乙酸乙酯部位的萃取，将乙酸乙酯部位合并、浓缩，用乙醇重结晶，即可得到Brefeldin A单体；

优选的方法是：滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并、浓缩，用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体纯品；

②菌丝体的处理方法：烘干菌丝体，用乙醇浸泡，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取多次，合并、浓缩乙醇，再用乙醇重结晶，即可得到Brefeldin A单体纯品。

优选的方法是：菌丝体30～70℃烘干，优选50℃，用乙醇浸泡12～48小时，优选24小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取1～5次，优选3次，每次10～50分钟，优选30分钟，合并、浓缩乙醇，再用乙醇重结晶1～5次，优选3次，即可得到Brefeldin A单体纯品。

上文所述的内生真菌的分离、纯化、发酵方法为本领域公知的常规使用的方法。

上文所述的Brefeldin A的重结晶制备方法是本领域的常规重结晶方法。

上述方法均是本领域的公知技术，在需要进一步确证的时候，很容易从有关的教材和相关的技术文献等查阅到包括技术细节在内的所有技术资料。

上文所述的有机溶剂重结晶法所使用的有机溶剂是本领域的常规有机溶剂，包括乙醇、乙醇水溶液、甲醇等中的一种或多种，优选乙醇或不同浓度的乙醇水溶液等中的一种或多种，进一步优选不同浓度的乙醇水溶液。

(五)发酵产物的药理活性

现有研究已经证明本发明的发酵产物Brefeldin A具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等方面的药理作用与用途，本发明对发酵产物Brefeldin A在抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等方面的活性也进行了多方面的试验。

除了现有文献对发酵产物Brefeldin A的药理作用与用途发明的报道以外，下面还将选择发明人的抗真菌、抗肿瘤等方面的部分实验研究实例，通过对本发明发酵产物BrefeldinA进行进一步的详细阐述，以突出和证明本发明的研究重点、意义与实用性。

一是选择部分抗真菌的实验研究结果进行举例。

通过Brefeldin A对白色念珠菌(Candida albicans)、新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、薰烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)的活性测试，发现其具有一定的抗真菌活性。

抗真菌活性实验结果如下所示(MIC₈₀mg·L^-1)：

二是选择部分抗肿瘤的实验研究结果进行举例。

选择胃癌细胞(MKN45)、肠癌细胞(LOVO)、肝癌细胞(HepG2)及白血病细胞(HL-60)作为检测细胞株，用MTT法测定Brefeldin A抗肿瘤活性。

抗肿瘤实验筛选结果如下所示(IC₅₀mg·L^-1)：

结果显示，Brefeldin A抗肿瘤活性显著，其对胃癌细胞(MKN45)及肝癌细胞(HepG2)的活性明显优于阳性对照阿霉素。

现有的研究文献(①李海燕，黄容，卿晨，沙涛，李凌飞，赵之伟.法夏内生菌株D126产细胞毒活性物质布雷菲德菌素A的研究.天然产物研究与开发.2008，20：24-27；②方美娟，王建锋，赵玉芬，张永杰，黄耀坚，宋思扬，苏金文.用HPLC-MS-MS快速分析和鉴定三尖杉植物内生真菌发酵液中的Brefeldin A.分析测试学报.2005，1：21-24；③F.W.Wang，R.H.Jiao，A.B.Cheng，.h.Tan，Y.C.Song.Antimicrobial potentials of endophytic fungiresising in Quercus variabilis and brefelsin A obtained from Cladosporium sp.World J MicrobiolBiotechnol，2007，23：79-83)和本发明的实验研究均表明，Brefeldin A及其组合物能够用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品。

(六)发酵产物的用途

1、概述

本发明的目的是提供一种用于临床和科研的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品，包括药物、试剂或食品等中的一种或多种，优选药物。

通过药理活性筛选证明，发酵产物为其产生菌抗真菌、抗病毒、抗肿瘤的活性部位。

发明人对真菌及其发酵产物进行了理论探索，并经过大量的实验研究特别是长期的药理学试验，发现所述及的发酵产物有显著的抗真菌、抗病毒(抗生、抗滤过性病原体、抗有丝分裂、抑制细胞生长)、抗肿瘤的活性，并且作为一种重要的分子工具(细胞因子分泌抑制剂，具有有效、经济、低毒的特点)，广泛用于研究哺乳动物的信号传导途径的研究；国际肿瘤协会在抗肿瘤体外筛选中还发现Brefeldin A作为血疗法试剂有很大的应用前景(方美娟，王建锋，赵玉芬，张永杰，黄耀坚，宋思扬，苏文金.用HPLC-MS-MS快速分析和鉴定三尖杉植物内生真菌发酵液中的Brefeldin A.分析测试学报.2005(1)：21-24.)。

因此，发酵产物及其组合物可用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品，优选以本发明发酵产物为原料制备而成的药物。

2、真菌及其发酵产物及其组合物的使用方法与要求

本发明发酵产物可以单独或与其它活性组分联合使用，包括用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品及科研相关试剂，包括药物、试剂或食品等，尤其是药物。

在具体使用方面，本发明所述的发酵产物能够单独使用，例如以单体化合物、其衍生物或药用盐的形式应用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解BrefeldinA的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体或者食品等中的一种或多种；进一步优选医药学上可接受的载体。

本文使用的“医药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了该发酵产物的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括润滑剂，如滑石粉、聚乙二醇或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如淀粉、糊精或乳糖等中的一种或多种；粘合剂，如预胶化淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或多种；渗透压调节剂，如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；pH调节剂，如盐酸、氢氧化钠等酸或碱中的一种或多种；溶剂，如水、缓冲液、乙醇或丙二醇等中的一种或多种等；抗氧剂和络合剂，如亚硫酸钠、EDTA等中的一种或多种；表面活性剂，如季铵化合物、十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；高分子骨架剂，如环糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一种或多种；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂、防腐剂或甜味剂等中的一种或多种。

例如，将活性组分Brefeldin A溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有增溶剂(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚维酮、环糊精、泊洛沙姆、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如稳定剂(例如，人血清白蛋白等)、止痛剂(例如，盐酸普鲁卡因或利多卡因等中的一种或多种)等。

本发明所述及的发酵产物还可以以组合物的形式联合使用，特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种，优选人、小鼠、大鼠、猴、猪、兔或犬等中的一种或多种，进一步优选人、大鼠或猴等中的一种或多种。例如，可以将本发明发酵产物加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明发酵产物和药学上可接受的载体。

发酵产物的组合物特别是药物组合物可以有各种形式，包括例如液体、半固体和固体等剂量形式中的一种或多种；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的发酵产物为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。

本发明所述的Brefeldin A或其药物组合物能够可以采用本领域公知的常规生产方法制成任何一种适合于实验、研究或临床上应用的剂型，包括固体制剂如胶囊、片剂、颗粒制剂等，液体制剂如口服液或者注射剂等。

例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。

药物组合物优选含有重量比为0.5％～99％的活性成分发酵产物，进一步优选含有重量比为50％～99％的活性成分发酵产物，最优选含有重量比为85％的活性成分发酵产物。

发酵产物的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该发酵产物与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该发酵产物加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。

该组合物中可包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐或明胶，以达到注射组合物的延长吸收；可包括高分子聚合物载体，如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯，以达到口服组合物的延长释放。

用于患者时，本发明所述的发酵产物剂量为5～30mg/kg·d，可以分一次或多次使用，该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。

本发明发酵产物及其药用组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明发酵产物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。发酵产物的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及该发酵产物在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指该发酵产物的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。

“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明发酵产物的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是5～30mg/kg，更优选为10～20mg/kg。应注意，剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的发酵产物剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。

另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。

也就是说，需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明发酵产物的每次和/或每日的剂量或用量。例如，经静脉给予哺乳动物，尤其是成年人(如体重60kg)，所述发酵产物的单剂量约为5～180mg，优选约10mg，优选每日给药1～3次。可以调整剂量单位，以提拱最佳所需反应(例如，治疗或预防应答)。

例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式，指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物发酵产物。本发明的剂量单位形式的规格，由以下确定并直接取决于以下(a)该发酵产物的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性发酵产物的技术中的内在限制。

3、发酵产物及其组合物的药物剂型和给药途径

本发明所述的发酵产物及其组合物制备的用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的产品，其中按照食品技术领域的要求制备的产品能够用于预防、保护和治疗抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗或保健，既能够单独直接用于制备治疗或保健的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗或保健的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用食品级或药用级的物料。

本发明所述的发酵产物及其组合物，可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是喷雾剂或口服给药。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如空释制剂，包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1978)。

本发明所述的Brefeldin A或其药物组合物中，可以含有本领域公知的医药学上可接受的载体和其它任选成分。载体包括羧甲基淀粉、淀粉、纤维素、明胶、碳酸氢钠、丙二醇或吐温80等。任选成分例如是着色剂、甜味剂、抗氧剂等。

本发明所述的发酵产物及其组合物，通常通过口服、直肠或肠胃外给药等中的一种或多种方式，施用于需要这种治疗的患者。

本发明所述的Brefeldin A、其衍生物或组合物特别是药物组合物可以制成任何一种适合于临床上应用的剂型，包括固体制剂，如胶囊、片剂、颗粒制剂等，半固体制剂如软膏等，液体制剂如口服液、混悬剂、乳剂等，或者注射剂。采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。

用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。在实施时，本发明发酵产物可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该发酵产物(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述发酵产物与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。

为了以非肠道给药之外给予本发明发酵产物，可能需要用防止其失活的材料对该发酵产物包衣或与该发酵产物一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明发酵产物与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。

制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种，如糖浆、酊剂或酏剂等中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。

以上药物或药物组合物能够使用各种途径，在所述的使用形式中，优选的形式是口服制剂(如片剂、包衣片剂、胶囊、溶液或混悬液等中的一种或多种)、非肠道给予剂型(如注射剂、软膏或贴剂等中的一种或多种)等中的一种或多种，进一步优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种，特别优选片剂或注射剂中的一种。

此外，发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等在某些情况下也能够单独直接用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的产品，也能够与许多化学物质进行混合或组合，以组合物的形式直接或间接用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的产品。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

例如，发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的粉末用于制备用于抗真菌、抗病毒、抗肿瘤的预防、诊断、保护和治疗产品特别是药物的各种剂型，或者是发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的粉末与有关的辅料用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的产品尤其是药物的各种剂型，或者是发酵产物所使用的药材原料包括BrefeldinA产生菌及其菌丝体等的粉末与有关的制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的产品如药物的各种剂型，如片剂、胶囊剂或混悬剂等中的一种或多种，优选胶囊剂。

所述的方法之一是将发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的粉末灌装为胶囊剂；

所述的方法之二是将发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的粉末与有关的制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的产品如药物一起灌装为胶囊剂；

所述的方法之三是将发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的粉末与有关的辅助药物一起灌装为胶囊剂；

所述的方法之四是将发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的粉末与有关的辅料一起按常规方法直接压为片剂；

所述的方法之五是将发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的粉末、有关的制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的产品如药物一起与有关的辅料按常规方法直接压为片剂；

所述的方法之六是将发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的粉末、有关的辅助药物一起与有关的辅料按常规方法直接压为片剂等。

除上述的六种基本方法外，还能够选择发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的其他形式或对发酵产物所使用的药材原料进行本领域公知的方法处理后，制备各种剂型的含有发酵产物所使用的药材原料的产品如药物。但是，需要注意的是，在上述直接使用发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的时候，应先根据所使用的发酵产物的剂量要求，换算得到所需要使用的发酵产物所使用的药材原料包括Brefeldin A产生菌及其菌丝体等的用量。

综上所述，本发明发酵产物及其组合物可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的产品，优选药物和食品，进一步优选药物。

(七)技术特长

本发明的优点是产生Brefeldin A的菌种选育与保藏容易，成本低廉，工艺简单，生产周期短，产量高，不使用毒性原料，有机溶剂使用少，药源可以充分保障，具有大规模生产的潜力，并具有良好的经济效益与社会效益，有利于维持生态平衡和保护自然资源。

本发明对以二苯乙烯苷为主要成分的发酵产物拓展了新的医药用途，也为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病提供了一种新的药物来源。本发明的发酵产物安全低毒，药理作用较强，其原料来源丰富、价廉，制备工艺简单，得率高，可用于制备预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及其直接相关疾病的产品。

本发明有针对性地研究Brefeldin A产生菌及其发酵产物，药理作用较强，性质稳定，使用制备的制剂质量稳定，且其使用安全，使用范围特别广，一物多用，效果明显，最大限度地发挥了作用；因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发新的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品提供了新的来源，对开发利用中国的药用资源具有重要价值，是用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品的安全原料。

具体实施方式

本发明研究了现有的真菌及其发酵产物以及其的药理作用和用途，提供了一种能够用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品的原料，便于医疗行业和相关行业如食品、饮料等领域的安全使用。

(一)真菌及其发酵产物的制备方法

为进一步阐述上述Brefeldin A产生菌菌株以及其发酵产物Brefeldin A的制备方法，下面通过举例来说明具体的操作步骤和方法。

以园参为例，Brefeldin A产生菌的菌株具体的制备方法如下：

(1)挑选新鲜、健康园参，去掉参须、芦头，将根的表面洗净、晾干水分，消毒；

所述的消毒方法的具体操作步骤是：

①在无菌操作台中用75％乙醇漂洗20～30秒；

②无菌水冲洗4次；

③5％NaClO溶液漂洗5分钟；

④无菌水冲洗4次；

⑤75％乙醇漂洗20～30秒；

⑥无菌水冲洗4次。

(2)无菌滤纸片吸干水分，分别切成5mm×5mm×1mm的小块接种于培养基上，每个培养皿中接4块，置28℃恒温培养箱中培养3～30天；

(3)观察到培养基上从各植物组织块内部向周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法把真菌转移到新的培养基上继续培养、转接；

(4)待纯化后，再转移到PDA培养基(最常用的真菌培养基，广泛用于保存菌种)斜面试管中，即得到该真菌菌株，对其编号，备用。

例如，本发明所述发酵产物的制备方法可以为：

本制备方法是先对单孢被孢霉Mortierella sp.Yuan-27进行发酵，再分别收集发酵液和菌丝体：

(1)菌种的准备

使用PDA培养基，高温灭菌，制成斜面试管培养基，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种Mortierella monospora菌种Mortierella sp.Yuan-27菌丝体，于28℃培养，作为菌种。

(2)发酵种子液制备

在250ml的锥形瓶中加入80ml的PDA液体培养基，于高温灭菌后，进行接种Mortierellamonospora菌种Mortierella sp.Yuan-27菌丝体，28℃、180r·min^-1振荡培养，发酵培养48h，将该培养物作为发酵种子。

(3)接种

准备发酵瓶，PDA发酵培养基装量适量，PDA培养基组成与种子培养基相同，接种8％发酵种子液，优选培养

在250ml的三角瓶中，加入80ml的PDA液体培养基，高温灭菌，接种8％发酵种子液，28℃、180r·min^-1振荡培养6～7天，真菌即可发酵成熟。

(4)制备结晶

待真菌发酵成熟后，分别收集发酵液和菌丝体：

①发酵液的处理方法：待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的滤液层进行乙酸乙酯部位的萃取1～5次，将乙酸乙酯部位合并、浓缩，用乙醇重结晶1～5次，即可得到Brefeldin A单体纯品；

②菌丝体的处理方法：30～70℃烘干菌丝体，用乙醇浸泡12～48小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取1～5次，每次10～50分钟，合并、浓缩乙醇，再用乙醇重结晶1～5次，即可得到Brefeldin A单体纯品。

(二)发酵产物的鉴定方法

本发明综合应用质谱(简称：MS)、核磁共振氢谱(简称：¹H-NMR)、核磁共振碳谱(简称：¹³C-NMR)以及核磁共振二维谱(简称：2D-NMR)等分析技术对发酵产物中的Brefeldin A进行结构鉴定。

Brefeldin A具有如下理化性质：

该化合物为无色结晶，分子式C₁₆H₂₄O₄，MW：280.363；易溶于甲醇、乙醇等极性较大的溶剂，微溶于水；mp.204～205℃；UV：λ_max ^EtOH 215(ε11200)；¹H NMR(500MHz，MeOD)δ(ppm)：7.38(1H dd，J＝15.6，3.0Hz，H-3)，5.76(1H dd，J＝15.6，1.8Hz，H-2)，4.10(1H dd，J＝5.4，5.4Hz，H-7)，5.66(1H ddd，J＝15.0，10.2，4.6Hz，H-11)，5.19(1H dd，J＝15.0，9.6Hz，H-10)，4.75(1H dd，J＝13.0，6.2Hz，H-15)，3.92(1H d，J＝2.0Hz，H-4)，2.30(1Hdd dd，J＝8.6，8.7Hz，H-9)，2.05(1H ddd，J＝13.6，8.7，5.4Hz，H-8′)，1.89-1.66(6H，H-12′，6′，13′，12″，14′，6″，5，8″，14″)，1.18(3H d，J＝6.24Hz，H-16)，0.80(1H，H-13″)，；¹³C NMR(500MHz，MeOD)δ(ppm)：168.66(C-1)，155.38(C-3)，138.41(C-10)，131.69(C-11)，118.10(C-2)，76.93(C-4)，73.49(C-15)，73.27(C-7)，53.48(C-5)，45.77(C-9)，44.42(C-8)，42.16(C-6)，35.31(C-14)，33.26(C-12)，28.28(C-13)，21.36(16)；光谱数据与文献数据一致(F.W.Wang，R.H.Jiao，A.B.Cheng，.h.Tan，Y.C.Song.Antimicrobial potentials of endophytic fungi resisingin Quercus variabilis and brefelsin A obtained from Cladosporium sp.World J MicrobiolBiotechnol，2007，23：79-83)。

(三)Brefeldin A及其组合物的常用药物制剂的制备方法

本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取发酵产物Brefeldin A，加入赋形剂，加水溶解，调节pH，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷、白蛋白、pH调节剂等中的一种或几种。每瓶含发酵产物1～100mg。

本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取发酵产物Brefeldin A，加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含发酵产物10～100mg。

本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、环糊精、抗氧剂、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。注射剂可以配制成溶液、微乳液、乳液、脂质体、微球、微囊或其它适合于高药物浓度的有序结构，其中可包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐、明胶、乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等，以达到注射组合物的延长吸收。每支含发酵产物1～100mg。

本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液，以注射用水作为溶媒，加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、抗氧剂、环糊精、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。每瓶含发酵产物1～100mg。

本发明制各片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等，按常规技术制备。可包括高分子聚合物载体，如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯等，以达到口服组合物的延长释放。

在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。

下面通过实施例对本发明作详细描述。

实施例1、发酵产物Brefeldin A的制备方法一

使用PDA(葡萄糖1％、蔗糖1％、土豆20％、琼脂1％、pH自然)斜面培养基，120℃下灭菌30分钟，制成斜面，置于37℃常温状态下24小时，无杂菌生长时，接种Mortierellamonospora菌种菌丝体，于28℃培养7天。在多个250ml锥形瓶中分别装入80ml液体培养基(葡萄糖1％、蔗糖1％、土豆20％、pH自然)。于120℃灭菌30分钟后，进行接种，28℃震荡培养48小时，将该培养物作为种子。准备5000mL发酵瓶，发酵培养基装量为2000mL，培养基组成与种子培养基相同，120℃灭菌30分钟，接种量为8％，28℃、以及180转/分钟震荡培养7天。分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，合并、浓缩、用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体纯品；菌丝体50℃烘干，用乙酸乙酯浸泡24小时，再以乙酸乙酯为溶剂超声辅助萃取三次，每次30分钟，合并、浓缩乙酸乙酯，再用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体纯品。

实施例2、发酵产物Brefeldin A的制备方法二

使用PDA(葡萄糖1％、蔗糖2％、土豆20％、琼脂1％、pH自然)斜面培养基，120℃下灭菌30分钟，制成斜面，置于37℃常温状态下24小时，无杂菌生长时，接种Mortierellamonospora菌种菌丝体，于28℃培养7天。在多个250ml锥形瓶中分别装入80ml液体培养基(蔗糖2％、土豆20％、pH自然)。于120℃灭菌30分钟后，进行接种，28℃震荡培养48小时，将该培养物作为种子。准备5000mL发酵瓶，发酵培养基装量为2000mL，培养基组成与种子培养基相同，120℃灭菌30分钟，接种量为8％，28℃、以及180转/分钟震荡培养7天。分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，合并、浓缩、用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体纯品；菌丝体50℃烘干，用乙酸乙酯浸泡24小时，再以乙酸乙酯为溶剂超声辅助萃取三次，每次30分钟，合并、浓缩乙酸乙酯，再用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体纯品。

实施例3、发酵产物Brefeldin A的制备方法三

使用PDA(葡萄糖1％、蔗糖1％、土豆20％、琼脂1％、pH自然)斜面培养基，120℃下灭菌30分钟，制成斜面，置于37℃常温状态下24小时，无杂菌生长时，接种Mortierellamonospora菌种菌丝体，于28℃培养7天。在多个250ml锥形瓶中分别装入80ml液体培养基(蔗糖2％、蛋白胨0.2％、pH自然)。于120℃灭菌30分钟后，进行接种，28℃震荡培养48小时，将该培养物作为种子。准备5000mL发酵瓶，发酵培养基装量为2000mL，培养基组成与种子培养基相同，120℃灭菌30分钟，接种量为8％，28℃、以及180转/分钟震荡培养7天。分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，合并、浓缩、用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体纯品；菌丝体50℃烘干，用乙酸乙酯浸泡24小时，再以乙酸乙酯为溶剂超声辅助萃取三次，每次30分钟，合并、浓缩乙酸乙酯，再用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体纯品。

实施例4、发酵产物Brefeldin A的制备方法四

使用PDA(葡萄糖1％、蔗糖1％、土豆20％、琼脂1％、pH自然)斜面培养基，120℃下灭菌30分钟，制成斜面，置于37℃常温状态下24小时，无杂菌生长时，接种Mortierellamonospora菌种菌丝体，于28℃培养7天。在多个250ml锥形瓶中分别装入80ml液体培养基(葡萄糖1％、蔗糖1％、土豆20％、KH2PO41％、pH自然)。于120℃灭菌30分钟后，进行接种，28℃震荡培养48小时，将该培养物作为种子。准备5000mL发酵瓶，发酵培养基装量为2000mL，培养基组成与种子培养基相同，120℃灭菌30分钟，接种量为5％，28℃、以及180转/分钟震荡培养7天。分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，合并、浓缩、用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体纯品；菌丝体50℃烘干，用乙醇浸泡24小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取三次，每次30分钟，合并、浓缩乙醇，再用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体纯品。

实施例5、发酵产物Brefeldin A粉针剂的制备

取发酵产物10g，加入右旋糖苷30g，加1500ml注射用水，调节pH至9.0，搅拌使其溶解；加注射用水至2000ml，加3.0g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装，半轧塞；冷冻干燥，再压塞轧盖即可。

实施例6、发酵产物Brefeldin A粉针剂的制备

取发酵产物50g，加入甘露醇60g，加5000ml注射用水，调节pH至8.0，搅拌使其溶解；加注射用水至6000ml，加1g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装，半轧塞；冷冻干燥，再压塞轧盖即可。

实施例7、发酵产物Brefeldin A粉针剂的制备

取发酵产物1g，加入葡萄糖50g，加900ml注射用水，调节pH至8.5，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装，半轧塞；冷冻干燥，再压塞轧盖即可。

实施例8、发酵产物Brefeldin A小针剂的制备

取发酵产物5g，加900ml注射用水，调节pH至9.0，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.0g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶10ml。

实施例9、发酵产物Brefeldin A小针剂的制备

取发酵产物10g，加入乙醇600ml，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加0.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶5ml。

实施例10、发酵产物Brefeldin A葡萄糖输液的制备

取发酵产物2g，加入聚乙二醇10g，加入葡萄糖500g，加4500ml注射用水，搅拌使其溶解；加5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶500ml，热压灭菌。

实施例11、发酵产物Brefeldin A氯化钠输液的制备

取发酵产物1g，加入氯化钠90g，加9000ml注射用水，搅拌使其溶解；加10g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；加注射用水至10000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，热压灭菌即可。

实施例12、发酵产物Brefeldin A片剂的制备

(1)处方

Brefeldin A    1000.0g

微晶纤维素     1170.0g

预胶化淀粉     690.0g

乳糖           125.0g

5％PVP无水乙醇 适量

硬脂酸镁       15.0g

                               

共制成         10000片

包衣液处方：胃溶薄膜衣料：85G61235，上海卡乐康包衣技术有限公司

(2)制备工艺按以上处方分别称取处方量的主药与辅料，按等量递加法混合均匀，5％PVP无水乙醇制软材、干燥、整粒，加入硬脂酸镁混匀，测定含量，计算片重后压片，控制裸片硬度5～7kg，共制得片剂9698片，成品率为96.98％。

采用常规高效包衣锅包衣，工艺如下：将裸片(硬度5～7kg)放入包衣锅中，启动搅拌装置和鼓风加热装置，待裸片温度升至40℃时，开始打开喷枪对准片床的上1/3处喷入包衣液包衣，控制片床温度38～42℃，气磅压力6kg，包衣液流速为50mL/min，包衣膜重占包衣片重的3％。

实施例13、发酵产物Brefeldin A片剂的制备

(1)处方

Brefeldin A     100.0g

乳糖            80.0g

淀粉            60.0g

羧甲基淀粉钠    15.0g

10％PVP水溶液   适量

硬脂酸镁        3.0g

                                   

共制成          1000片

(2)制备工艺取原辅料分别过80目筛，混合均匀，用适量10％PVP溶液制软材，干燥，加入硬脂酸镁3g，整粒，压片，制成1000片。

实施例14、发酵产物Brefeldin A胶囊剂的制备

(1)处方

Brefeldin A    1000.0g

微晶纤维素     1000g

淀粉           140g

无水乙醇       适量

滑石粉         80g

                          

共制成         10000胶囊

(2)制备工艺分别取原料药Brefeldin A及处方中其它辅料分别过100目筛，置60℃烘干，称取处方量Brefeldin A与微晶纤维素、淀粉等量递加法混合均匀，用适量无水乙醇制软材，30目筛制粒，50～60℃干燥2小时，用30目筛整粒，加入处方量的滑石粉混合均匀，填充。

Claims (20)

1、一种Brefeldin A产生菌，其特征在于，所述的Brefeldin A产生菌是被孢霉属Mortierella Coemans内生真菌——单孢被孢霉Mortierella monospora Linnemann。

2、根据权利要求1所述的Brefeldin A产生菌，其特征在于，所述的Brefeldin A产生菌菌种是单孢被孢霉Mortierella sp.Yuan-27。

3、根据权利要求1或2所述的Brefeldin A产生菌，其特征在于，所述的Brefeldin A产生菌菌种的制备方法具体步骤如下：

(1)挑选原药材，洗净晾干，消毒；

(2)干燥后，切块接种于培养基上，恒温培养箱培养；

(3)待菌丝长出时，把真菌转移到新的培养基上继续培养、转接；

(4)待纯化后，再转移到PDA培养基斜面试管中，即得到该真菌菌株，对其编号，备用。

4、根据权利要求3所述的Brefeldin A产生菌，其特征在于，所述的原药材是人参，所述的消毒方法是：在无菌操作台中用乙醇、NaClO溶液漂洗，无菌水冲洗。

5、根据权利要求4所述的Brefeldin A产生菌，其特征在于，所述的原药材是园参，所述的乙醇是75％乙醇，所述的NaClO溶液是5％NaClO溶液；

所述的消毒方法具体操作步骤如下：

①在无菌操作台中用75％乙醇漂洗10～60秒；

②无菌水冲洗2～6次；

③5％NaClO溶液漂洗3～10分钟；

④无菌水冲洗2～6次；

⑤75％乙醇漂洗10～60秒；

⑥无菌水冲洗2～6次。

6、根据权利要求3所述的Brefeldin A产生菌，其特征在于，所述的Brefeldin A产生菌菌种的制备方法的具体步骤如下：

(1)挑选新鲜、健康园参，去掉参须、芦头，将根的表面洗净、晾干水分，消毒；

所述的消毒方法的具体操作步骤是：

①在无菌操作台中用75％乙醇漂洗20～30秒；

②无菌水冲洗4次；

③5％NaClO溶液漂洗5分钟；

④无菌水冲洗4次；

⑤75％乙醇漂洗20～30秒；

⑥无菌水冲洗4次；

(2)无菌滤纸片吸干水分，分别切成5mm×5mm×1mm的小块接种于培养基上，每个培养皿中接4块，置28℃恒温培养箱中培养3～30天；

(3)观察到培养基上从各植物组织块内部向周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法把真菌转移到新的培养基上继续培养、转接；

(4)待纯化后，再转移到PDA培养基斜面试管中，即得到该真菌菌株，对其编号，备用。

7、根据权利要求1或2所述的Brefeldin A产生菌的发酵产物，其特征在于，所述的发酵产物Brefeldin A的发酵法制备方法如下：

以单孢被孢霉Mortierella sp.Yuan-27为发酵菌种，再先后采用液体发酵、溶剂萃取和有机溶剂重结晶方法，分离得到此种化合物。

8、根据权利要求7所述的Brefeldin A产生菌的发酵产物，其特征在于，所述的发酵产物Brefeldin A的发酵法制备方法具体操作步骤如下：

(1)菌种的准备

使用PDA培养基，高温灭菌，制成斜面试管培养基，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种Mortierella monospora菌种Mortierella sp.Yuan-27菌丝体，常温下培养，作为菌种；

(2)发酵种子液制备

在多个锥形瓶中分别装入PDA液体培养基；于高温灭菌后，进行接种Mortierellamonospora菌种Mortierella sp.Yuan-27，常温下振荡培养，将该培养物作为发酵种子；

(3)接种

准备发酵瓶，PDA发酵培养基装量适量，PDA培养基组成与种子培养基相同，高温灭菌，接种8％发酵种子液，常温下振荡培养，真菌即可发酵成熟；

(4)制备结晶

待真菌发酵成熟后，分别收集发酵液和菌丝体：

①发酵液的处理方法：待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的滤液层进行乙酸乙酯部位的萃取，将乙酸乙酯部位合并、浓缩，用乙醇重结晶，即可得到Brefeldin A单体；

②菌丝体的处理方法：烘干菌丝体，用乙醇浸泡，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取多次，合并、浓缩乙醇，再用乙醇重结晶，即可得到BrefeldinA单体纯品。

9、根据权利要求8所述的BrefeldinA产生菌的发酵产物，其特征在于，所述的发酵种子液制备中的常温下振荡培养条件是：28℃、180r·min^-1、培养48h；

所述的接种中的常温下振荡培养条件是：28℃、180r·min^-1，培养6～7天；

所述的发酵液的处理方法是：待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的滤液层进行乙酸乙酯部位的萃取1～5次，将乙酸乙酯部位合并、浓缩，用乙醇重结晶1～5次，即可得到Brefeldin A单体；

所述的菌丝体的处理方法是：30～70℃烘干菌丝体，用乙醇浸泡12～48小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取1～5次，每次10～50分钟，合并、浓缩乙醇，再用乙醇重结晶1～5次，即可得到Brefeldin A单体纯品。

10、根据权利要求8所述的Brefeldin A产生菌的发酵产物，其特征在于，所述的发酵产物Brefeldin A的发酵法制备方法具体操作步骤如下：

(1)菌种的准备

使用PDA培养基，高温灭菌，制成斜面试管培养基，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种Mortierella monospora菌种Mortierella sp.Yuan-27菌丝体，于28℃培养，作为菌种；

(2)发酵种子液制备

在多个250ml锥形瓶中分别加入80ml的PDA液体培养基；于高温灭菌后，进行接种Mortierella monospora菌种Mortierella sp.Yuan-27，28℃、180r·min^-1振荡培养48h，将该培养物作为发酵种子；

(3)接种

在250ml的三角瓶中加入80ml的PDA液体培养基，PDA培养基组成与种子培养基相同，高温灭菌，接种8％发酵种子液，28℃、180r·min^-1下振荡培养6～7天，真菌即可发酵成熟；

(4)制备结晶

待真菌发酵成熟后，分别收集发酵液和菌丝体：

①发酵液的处理方法：待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的滤液层进行乙酸乙酯部位的萃取3次，将乙酸乙酯部位合并、浓缩，用乙醇重结晶3次，即可得到Brefeldin A单体；

②菌丝体的处理方法：50℃烘干菌丝体，用乙醇浸泡24小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取3次，每次30分钟，合并、浓缩乙醇，再用乙醇重结晶3次，即可得到BrefeldinA单体纯品。

11、根据权利要求1或2所述的Brefeldin A产生菌在制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品中的应用。

12、根据权利要求11所述的Brefeldin A产生菌在制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品是包括抗真菌产品、抗病毒产品和抗肿瘤产品；

所述的抗真菌产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究由真菌引起的疾病及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的真菌是包括白色念珠菌、新生隐球菌、红色毛癣菌或薰烟曲霉菌中的一种或多种；

所述的抗病毒产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究由病毒引起的疾病及其直接相关疾病的产品中的一种或多种；

所述的抗肿瘤产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究肿瘤及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的肿瘤是包括胃癌细胞、肠癌细胞、肝癌细胞或白血病细胞中的一种或多种所导致的肿瘤。

13、根据权利要求11所述的Brefeldin A产生菌在制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品是包括药物、试剂或食品中的一种。

14.根据权利要求13所述的Brefeldin A产生菌在制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品是药物。

15、根据权利要求1或2所述的Brefeldin A产生菌的发酵产物在制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品中的应用。

16、根据权利要求15所述的Brefeldin A产生菌的发酵产物在制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品是包括抗真菌产品、抗病毒产品和抗肿瘤产品；

所述的抗真菌产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究由真菌引起的疾病及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的真菌是包括白色念珠菌、新生隐球菌、红色毛癣菌或薰烟曲霉菌中的一种或多种；

所述的抗病毒产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究由病毒引起的疾病及其直接相关疾病的产品中的一种或多种；

所述的抗肿瘤产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究肿瘤及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的肿瘤是包括胃癌细胞、肠癌细胞、肝癌细胞或白血病细胞中的一种或多种所导致的肿瘤。

17、根据权利要求15所述的Brefeldin A产生菌在制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品是包括药物、试剂或食品中的一种。

18.根据权利要求17所述的Brefeldin A产生菌在制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品是药物。

19.根据权利要求7所述的Brefeldin A产生菌的发酵产物，其特征在于，所述的发酵产物Brefeldin A的纯度≥95％。

20.根据权利要求19所述的Brefeldin A产生菌的发酵产物，其特征在于，所述的发酵产物Brefeldin A的使用方式是包括单独使用或与其他化学物质联合使用中的一种。