CN113150867B - 一种富含灵芝三萜的灵芝萃取油的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含灵芝三萜的灵芝萃取油的制备方法，该方法是先将灵芝细粉和破壁灵芝孢子粉与分别制粒，得到灵芝子实体颗粒和灵芝孢子粉颗粒，再将得到的两种颗粒依次分别干燥，混合后进行二氧化碳超临界萃取，最终使制得的萃取油灵芝三萜含量高于灵芝孢子油中灵芝三萜含量，并具有显著的抗肿瘤的药理活性。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种富含灵芝三萜的灵芝萃取油的制备方法。
背景技术
灵芝又称瑞草、仙草，性平味甘，为我国名贵的传统中药，中华传统医学长期以来一直视为滋补强身、固本扶正的珍贵中草药。灵芝的成分非常丰富，包括灵芝多糖、三萜及甾醇类化合物、核苷、蛋白质以及微量元素等十几种有效成分，具有很好的应用价值。灵芝三萜具有抗肿瘤、提高免疫力、抗衰老、清除自由基、降血糖等功效，近年来一直是人们研究的重点。三萜是灵芝子实体和灵芝孢子粉中的主要有效成分之一，具有广泛的药理作用，由于它在灵芝中的含量低且不易分离，给三萜的深入研究和临床应用带来很大的限制。
目前，灵芝提取物多采用热水浸提或酒精提取的方式，为了能够更加有效地提高溶剂的提取效率，增加灵芝三萜和甾醇的含量，需要新技术的辅助，如超声波、微波、超临界CO2萃取技术等。
灵芝孢子粉是灵芝生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞。随着灵芝栽培技术的发展，灵芝孢子粉的产量越来越高，甚至超过子实体的产量。由于灵芝孢子中富含蛋白质、氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类、内酯和无机离子等营养活性成分，以灵芝孢子为原料制得的产品深受市场欢迎。
灵芝孢子油是以灵芝孢子为原料制备得到的黄色透明液体，主要成分为三萜类灵芝酸、不饱和脂肪酸和灵芝多糖等。灵芝孢子油具有止痛、消炎、解毒、保肝、增进消化器官机能及降低血中胆固醇、甘油三酯的药理功能，还能抑制血小板凝结，消除血栓，降低血液黏度，提供血红蛋白，提高血液对心脑供氧能力和加速血液循环，帮助血液流通，软化血管，净化血液，消除细胞自由基，调整血管压力，增强机体新陈代谢和免疫调节能力。另外，灵芝孢子油还能减少因放、化疗引起的精神不佳、食欲减退、呕吐、脱发等情况的发生。
超临界CO2萃取技术，经过50多年来的快速发展，现已在医药、食品、材料、化学化工、无水印染和环境保护等许多领域获得广泛应用。目前，超临界CO2萃取压力大都在300bar少数达到500bar，在这种压力下，CO2的密度比较低，通常只能萃取脂溶性成分。为了提高萃取率，增加萃取低极性成分，通常采用加入极性夹带剂—乙醇，以提高超临界CO2的极性达到萃取低极性成分的能力。
目前的天然灵芝虽具有较强的保健治疗作用，可有效提高人体的免疫力，但消费者无法有效利用其全部活性成分。市场上的灵芝子实体类产品主要以灵芝细粉或灵芝提取物为主成份(主要剂型是胶囊)，灵芝孢子粉主要以破壁灵芝孢子粉或灵芝孢子油为主成份(主要剂型是胶囊和软胶囊)。
灵芝子实体和灵芝孢子粉的混合组分深加工产品比较少，因为产品成分复杂，没有合适的剂型来包裹产品以防止其氧化，延长其保存期，所以无法真正高效利用天然灵芝的全部活性成分。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处提供一种富含灵芝三萜的灵芝萃取油制备方法。该方法是先将灵芝细粉和破壁灵芝孢子粉与分别制粒，得到灵芝子实体颗粒和灵芝孢子粉颗粒，再将得到的两种颗粒依次分别干燥，混合后进行二氧化碳超临界萃取，最终使制得的萃取油灵芝三萜含量高于灵芝孢子油中灵芝三萜含量，并具有显著的抗肿瘤的药理活性。
本发明的目的具体是通过以下方式实现的：
一种富含灵芝三萜的灵芝萃取油制备方法，该方法包括以下步骤：
将灵芝子实体颗粒与灵芝孢子粉颗粒混合，用质量浓度为95％乙醇浸泡1.5-2.5h，将浸泡后的混合物进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度38～42℃，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，收集萃取液；灵芝子实体颗粒与灵芝孢子粉颗粒混合比例范围1～2：1～2。优选灵芝子实体颗粒与灵芝孢子粉颗粒混合比例为1：1。
本发明采用的CO2超临界萃取条件是在大量的预试验的基础上，对影响超临界萃取效果的萃取温度、萃取压力、萃取时间等因素采用单因素考察法，以灵芝萃取油得率为指标，进行萃取工艺条件优化，所得萃取液经减压蒸馏后，收集油样测得。
萃取油得率的计算：
1、萃取温度的考察
将灵芝子实体颗粒与灵芝孢子粉颗粒按照1:1的重量比例混合，用质量浓度为95％乙醇浸泡2h，将浸泡后的混合物进行CO2超临界萃取。在萃取时间4h条件下，选取10个不同梯度的温度(32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃46℃、48℃、50℃)进行考察，以萃取率为指标得出最优的萃取温度。
2、萃取压力的考察
将灵芝子实体颗粒与灵芝孢子粉颗粒按照1:1的重量比例混合，用质量浓度为95％乙醇浸泡2h，将浸泡后的混合物进行CO2超临界萃取。在萃取温度42℃，萃取时间4h的条件下选取8个不同梯度的压力(20MPa、25MPa、30MPa、35MPa、40MPa、45MPa、50MPa、55MPa)进行考察，以萃取率为指标得出最优的萃取压力。
3、萃取时间的考察
将灵芝子实体颗粒与灵芝孢子粉颗粒混合，用质量浓度为95％乙醇浸泡2h，将浸泡后的混合物进行CO2超临界萃取。在萃取温度42℃，萃取釜压力35MPa的条件下，选取8个不同梯度的时间(1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h)进行考察，以萃取率为指标得出最优的萃取时间。
4、结果
单因素试验表明，超临界CO2萃取灵芝孢子油的最佳艺条件是：萃取釜温度38～42℃，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，在此条件下的萃取率可达17％。
上述95％乙醇浸泡时料液比最优选为1:1。
上述灵芝子实体颗粒是通过以下方法制备得到的：用粉碎机将灵芝粉碎，过40～50目筛，得灵芝细粉；灵芝细粉中加入灵芝细粉质量20-30％的水，制粒，55-60℃烘干，得灵芝子实体颗粒。
上述灵芝孢子粉颗粒是通过以下方法制备得到的：将破壁率达70％以上的灵芝孢子粉加入灵芝孢子粉质量20-30％水，制粒，55-60℃烘干。
与现有技术比较本发明的有益效果：本发明将灵芝颗粒和灵芝孢子粉颗粒组合在一起进行CO2超临界萃取，一方面可以萃取出灵芝当中的三萜和甾醇类物质，一方面萃取出孢子粉当中的油类物质，两者相互结合，相互协调，相互作用，结合二者优势，显著的提高组合物利用率，增强抑制动物移植性肿瘤的作用。所得萃取油可以做成软胶囊，其灵芝三萜的含量高，会成为一种优异的新型保健食品或药品。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行解释说明：
实施例1
1)用粉碎机将灵芝粉碎，过40～50目筛，得灵芝细粉。
2)灵芝细粉加入灵芝细粉质量30％水，制粒机中制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得灵芝子实体颗粒。
3)原料灵芝孢子粉，破壁机中破壁，破壁率达70％。
4)将破壁好的灵芝孢子粉加入30％水，制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得孢子粉颗粒。
5)灵芝颗粒与孢子粉颗粒等重量比例混合，投入超临界萃取设备内，用料液比为1:1的95％乙醇进行浸泡2h，将浸泡后的混合物进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度38～42℃，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，收集萃取液，得到灵芝及孢子粉萃取物，萃取物为含有油状物质的深棕色的乙醇液体，除去乙醇，得深棕色的油状液体，过滤，得纯净的萃取油。
实施例2
1)用粉碎机将灵芝粉碎，过40～50目筛，得灵芝细粉。
2)灵芝细粉加入灵芝细粉质量30％水，制粒机中制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得灵芝子实体颗粒。
3)原料灵芝孢子粉，破壁机中破壁，破壁率达70％。
4)将破壁好的灵芝孢子粉加入30％水，制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得孢子粉颗粒。
5)灵芝子实体颗粒与灵芝孢子粉颗粒按照重量比例为1：2混合，投入超临界萃取设备内，用料液比为1:1的95％乙醇进行浸泡2h，将浸泡后的混合物进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度38～42℃，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，收集萃取液，得到灵芝及孢子粉萃取物，萃取物为含有油状物质的深棕色的乙醇液体，除去乙醇，得深棕色的油状液体，过滤，得纯净的萃取油。
对比原料：灵芝孢子油
取灵芝孢子粉，破壁机中破壁，破壁率达70％。将破壁好的灵芝孢子粉加入30％水，制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得孢子粉颗粒。将孢子粉颗粒投入超临界萃取设备内，进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度38～42℃，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，收集萃取液，得到灵芝孢子油。
含量测定
对萃取油的三萜成分进行紫外检测，检验方法如下：
精密称取在105℃干燥至恒重的齐墩果酸对照品10mg，置于50ml容量瓶中，加氯仿溶解稀释至刻度，得齐墩果酸标准对照品溶液。
对照品溶液
精密吸取标准齐墩果酸对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8ml，分别置于10ml比色管中，加热挥去溶剂后，加入80g/L香草醛溶液0.5ml，硫酸溶液5.0ml，混匀后，于60℃水浴中保温30min，取出后冷水浴放置15min。在1cm比色皿中，以试剂空白液为参比调零，于波长500nm处测定吸光度，以吸光度对浓度进行回归，绘制标准曲线。
2.样品溶液
称取萃取油与灵芝孢子油样品120～150mg，加氯仿溶解于100ml容量瓶中。
精密吸取样品溶液0.2ml至10ml比色管中，按对照品溶液项下“加热挥去溶剂后”进行操作，测定吸光度，计算含量。
3.计算
式中：
W-样品中总三萜的含量，％
C-从标准曲线中查得的齐墩果酸的含量，mg/ml
V-比色液体积，ml
F-稀释倍数
m-样品的质量，mg
4.结果：
注：萃取油按照实施例1方法制备得到
试验例1
以下通过对动物移植性肿瘤的抑制作用的药效对本发明进行进一步说明：
1试验材料
1.1受试药物：本发明低中高剂量组，简称1号，2号，3号、灵芝萃取物组(全部灵芝萃取物，简称4号)、灵芝孢子油组(全部灵芝孢子萃取物，简称5号)。
灵芝萃取物组：
用粉碎机将灵芝粉碎，得灵芝细粉，过40～50目筛。灵芝细粉加入30％水，制粒机中制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得灵芝颗粒。
灵芝颗粒投入超临界萃取设备内，用同比例的95％乙醇进行浸泡2h，将浸泡后的混合物进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度38～42℃，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，收集萃取液，除去乙醇，得灵芝萃取物。
灵芝孢子油组：
原料灵芝孢子粉，破壁机中破壁，破壁率达70％。将破壁好的灵芝孢子粉加入30％水，制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得孢子粉颗粒。
孢子粉颗粒投入超临界萃取设备内，进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度38～42℃，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，收集萃取液，得到灵芝孢子油。
1.2动物：ICR种小白鼠，18-22g，雌雄各半，由中国药科大学动物实验室提供，饲料为颗粒饲料，饲养条件：空调房间，温度18-24℃，相对湿度70％。
1.3阳性药：环磷酰胺(CTX)，江苏盛迪医药有限公司。规格：0.2g/瓶。
2实验的主要内容
2.1 1号，2号，3号，4号、5号尾静脉注射对小鼠移植瘤Heps的抑制作用。
2.2 1号，2号，3号，4号、5号尾静脉注射对小鼠移植瘤S180的抑制作用。
3实验方法和步骤
3.1 1号，2号，3号，4号、5号尾静脉注射对小鼠移植瘤Heps的抑制作用。
3.1.1给药途径：1号，2号，3号，4号、5号尾静脉注射(iv)
3.1.2给药周期：按移植性肿瘤研究法接种Heps实体型，接种24小时后给药，iv给药，隔天一次，共给药4次，停药后第2天处死解剖小鼠。
3.1.3剂量设置7组，分别为：
空白对照组(生理盐水)
1号：1mg/kg
2号：3mg/kg
3号：6mg/kg
4号：3mg/kg
5号：3mg/kg
CTX：30mg/kg
3.1.4给药体积：0.4ml/20g
3.1.5实验方法：取上述规格小鼠70只按移植性肿瘤研究方法接种Heps实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为7组，每组10只，雌雄各半，空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药，iv给药，隔天一次，共给药4次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理(t检验)。
3.1.6实验结果
结果见表1，结果表明，与空白对照组相比，2号，3号组iv给药可显著地抑制Heps的肿瘤生长作用(P＜0.01，P＜0.01)，同时对实验小鼠的体重有减低作用，但与阳性药CTX组相比，影响很小，且效果优于1号、4号和5号。
表1 1号，2号，3号.4号，5号iv对小鼠移植瘤Heps的抑制作用(X±SD)(n＝10)
注：与空白对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01
3.2 1号，2号，3号，4号，5号尾静脉注射对小鼠移植瘤S180的抑制作用
3.2.1给药途径：1号，2号，3号，4号，5号尾静脉注射(iv)
3.2.2给药周期：按移植性肿瘤研究法接种S180实体型，接种24小时后给药，iv给药，隔天一次，共给药4次，停药后第2天处死解剖小鼠。
3.2.3剂量设置：共设7组，分别为：
空白对照组(生理盐水)
1号：1mg/kg
2号：3mg/kg
3号：6mg/kg
4号：3mg/kg
5号：3mg/kg
CTX：30mg/kg
3.2.4给药体积：0.4ml/20g
3.2.5实验方法：取上述规格小鼠70只按移植性肿瘤研究方法接种S180实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为7组，每组10只，雌雄各半，空白对照组与CTX组分别为阴、阳性对照组。接种24小时后给药，iv给药，隔天一次，共给药4次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理(t检验)。
3.2.6结果见表4，结果表明，与空白对照组相比，2、3号组iv给药均可显著地抑制S180的肿瘤生长作用(P＜0.05，P＜0.01)，同时对实验小鼠的体重有减低作用，但与阳性药CTX组相比，影响很小，且效果明显优于1-2、4-5号。
表2 1号，2号，3号iv对小鼠移植瘤S180的抑制作用(X±SD)(n＝10)
注：与空白对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01
Claims (2)
1.一种富含灵芝三萜的灵芝萃取油制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 将灵芝子实体颗粒与灵芝孢子粉颗粒混合，用质量浓度为 95％乙醇浸泡 1.5～2.5h，将浸泡后的混合物进行CO2 超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度38～42°C，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，收集萃取液；灵芝子实体颗粒与灵芝孢子粉颗粒混合比例为 1：1；所述的灵芝子实体颗粒是通过以下方法制备得到的：将灵芝粉碎，过 40～50 目筛，得灵芝细粉；灵芝细粉中加入灵芝细粉质量 20～30％的水，制粒，55～60°C烘干，得灵芝子实体颗粒；所述的灵芝孢子粉颗粒是通过以下方法制备得到的：将破壁率达 70％以上的灵芝孢子粉加入灵芝孢子粉质量20～30％水，制粒，55～60°C烘干。
2.根据权利要求1 所述的富含灵芝三萜的灵芝萃取油制备方法，其特征在于所述的95％乙醇浸泡时料液比为1:1。
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