CN1944609A - 一种复合灵芝孢子油及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合灵芝孢子油及其制备方法。本发明以破壁的灵芝孢子粉复合粉碎的灵芝菌丝体或灵芝子实体组成的复合灵芝孢子粉为原料，干压一步制粒后，置于萃取釜，通入处于超临界状态的CO₂进行萃取或超声萃取，获得浅黄色呈油状的复合灵芝孢子油。孢子油中含有90％以上的总有机酸，0.1％～2.5％的总灵芝酸，酸价25以下。采用上述方法，不仅可扩大灵芝孢子粉的应用资源，而且提高了孢子油中总灵芝酸的含量。本发明所提供的方法工艺流程简单，操作方便，适合于工业生产；产品的质量稳定，质量控制方便，可用于药物和食品。

Description

一种复合灵芝孢子油及其制备方法

技术领域

本发明涉及灵芝孢子油技术领域，特别是涉及一种复合灵芝孢子油及其制备方法。

背景技术

灵芝是担子菌纲多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)真菌赤芝G.lucidum.karst和紫芝G.japonicum Lloyd的总称，被《本经》称为上品，民间视为“灵药仙丹”，是我国传统扶正固本、滋补强壮的名贵中药，在我国已有几千年的药用、食用历史。文献报导的灵芝主要成分包括：三萜类、多糖类、核苷、甾醇类、氨基酸类、维生素类、生物碱类和无机离子等，其中灵芝三萜酸类为灵芝中具有很强生理活性的成分。

灵芝孢子是灵芝在成熟时期不断从菌盖下喷射出的生殖细胞，是繁殖下一代灵芝的种子，具有灵芝的全部遗传活性物质。其主要成分包括：脂肪酸类、甾醇类、三萜类、维生素类、胡萝卜素、内酯、蛋白质和氨基酸类、糖肽类、生物碱类和无机离子等。八十年代开始，有较多的对灵芝及其孢子粉抗肿瘤方面的基础研究；到九十年代，美国、日本等国将灵芝应用至临床，用于癌症及AIDS(艾滋病)治疗方面，得到了国际研究学者的广泛注意。近年来研究和应用更多的是人工培育的灵芝孢子粉及其提取物。据文献[江苏药学与临床研究，2001，9(2)：55]报导，我国科学家研究发现脂质是灵芝孢子的抗病“主力”。破壁灵芝孢子用超临界二氧化碳萃取的脂质活性物质为灵芝孢子油。为充分利用灵芝孢子这一资源，现采用超临界CO₂萃取法从灵芝孢子萃取灵芝孢子油发明专利众多，如CN1723958A、CN1239100C、CN1563335A、CN1631431A、CN1255519C、CN1194079C、CN1114446C、CN1094766C等。此外，还有用溶剂浸出法、压榨法、溶剂超声提取法从灵芝孢子中提取灵芝孢子油的方法，如发明专利CN1099455C、CN1116393C、CN1099455C。这些方法都是单纯地从灵芝孢子中获取灵芝孢子油，由于灵芝孢子的资源有限，而灵芝孢子具有灵芝的全部遗传活性物质，也就是说灵芝中含有与灵芝孢子基本相同的活性物质，而且实际上具有很强生理活性的灵芝酸类成分在灵芝中的含量高于灵芝孢子中的含量。因此，将灵芝(灵芝茵丝体或灵芝子实体)与灵芝孢子混合组成灵芝孢子复合物提取复合灵芝孢子油，不仅扩大了灵芝孢子油的获取资源，而且获得的复合灵芝孢子油中灵芝酸类成分的含量比单纯的灵芝孢子油中的含量更高，临床应用效果更好。中国专利CN1273147C公开了一种全灵芝孢子中有效成分的超临界CO₂萃取方法，虽然该方法也用粉碎为颗粒的灵芝子实体与灵芝孢子为原料，但在超临界CO₂进行萃取时使用了食用乙醇作为提取剂参与萃取，获得的提取物呈油膏状，其提取物虽含有脂质性成分但也含有水溶性多糖，与灵芝孢子油的成分组成有较大差别，且油膏状物给后续的制剂工作造成较大的困难。中国专利CN1607001A公开了一种灵芝菌丝体萃取灵芝油的方法。该方法用粉碎为颗粒的灵芝菌丝体为原料，用超临界CO₂萃取法萃取灵芝油，萃取过程中萃取温度较高，易造成活性成分损失，且未公开所获灵芝油的成分组成。本发明充分利用灵芝菌丝体与灵芝孢子含有基本相同的脂质成分的特点，选用一定比例的灵芝菌丝体(或灵芝子实体)细粉与破壁灵芝孢子混合组成复合灵芝孢子粉，再加入少量的粘合物混均后干压制粒，用超临界CO₂萃取或超声超临界CO₂萃取法萃取，获取有一定明确化学组成的脂质透明油状液体→复合灵芝孢子油。

发明内容

本发明的目的是克服现有灵芝孢子油生产上存在的问题，提供一种以非灵芝孢子为主要原料，而得到的复合灵芝孢子油用途效果不次于纯灵芝孢子油的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述制备方法所得到的复合灵芝孢子油。

为了实现上述目的，本发明以复合灵芝孢子粉为原料，即以灵芝菌丝体粉或灵芝子实体粉与灵芝孢子粉组成的复合灵芝孢子粉为原料。所述的灵芝菌丝体粉或灵芝子实体粉是指将灵芝菌丝体粉碎至大于或等于120目的细粉，以200目为佳；所述灵芝孢子粉是指将灵芝孢子破壁至破壁率≥95％的灵芝孢子粉。灵芝菌丝体粉或灵芝子实体粉与灵芝孢子粉的重量比为：灵芝菌丝体粉或灵芝子实体粉∶灵芝孢子粉＝0.5～3∶1。由于灵芝中含有与灵芝孢子基本相同的活性物质，而且实际上具有很强生理活性的灵芝酸类成分在灵芝中的含量高于灵芝孢子中的含量。因此，将灵芝(灵芝茵丝体或灵芝子实体)与灵芝孢子复合组成复合灵芝孢子粉，不仅扩大了灵芝孢子油的获取资源，而且提高了复合灵芝孢子油中灵芝酸类成分的含量，使灵芝孢子粉与灵芝菌丝体得到了更好的应用。

本发明的复合灵芝孢子油的制备方法，是以灵芝菌丝体粉或灵芝子实体粉与灵芝孢子粉组成的复合灵芝孢子粉为原料，采用超临界流体萃取或超声强化超临界流体萃取其油状复合脂质物质，即为复合灵芝孢子油。

上述超临界流体萃取的流体为CO₂，萃取温度为21～42℃，萃取压力为10～34Mpa，萃取时间为1～5小时，萃取流量为32～58kg/h；采用二级分离，分离的工艺条件是：一级解析器压力为9～13MPa分离温度38～42℃；二级解析器压力为4～6MPa，分离温度为28～32℃。采用超声强化超临界流体萃取时，除包括上述条件外，其超声的频率为25～60kHz，功率为60～800W。超声强化超临界流体萃取是加装了超声提取装置的超临界流体设备，该方法将超声提取方法与超临界流体提取方法相结合提取孢子油，达到提高出油率、降低萃取温度和压力，缩短提取时间的目的。

在上述提取方法中，由于直接采用复合灵芝孢子粉进行超临界二氧化碳萃取，细微粉状物易冲料，细微粉状物易进入孢子油中，使孢子油的颜色变深、变浑浊；同时，工业生产时，会带来操作的危险。为切实解决生产的安全操作问题，确保孢子油萃取过程质量的稳定，本发明采取了将复合灵芝孢子粉原料中加入0.2％～1.2％的的淀粉或糊精，混合均匀后，采用制粒机用干压法一步制成粒径大小为0.1～0.3cm的颗粒，制粒时，优选制粒机主压力为5～8MPa，侧压力为0.5～1Mpa；制粒后再投料于超临界二氧化碳萃取釜中或超声强化超临界二氧化碳萃取釜中，采用超临界流体萃取或超声强化超临界流体萃取、二级分离的方法，提取得到淡黄色油状物。

本发明制备方法所得到的复合灵芝孢子油，含有脂肪酸与甘油结合组成的灵芝孢子脂肪酸甘油三酯类、脂肪酸类、灵芝三萜酸类(灵芝酸类)等成分，其中灵芝孢子脂肪酸甘油三酯类中的结合有机酸与游离脂肪酸类、灵芝酸类组成的总有机酸的重量含量以油酸计为复合灵芝孢子油的90％以上；灵芝酸类的重量含量以灵芝酸E计为复合灵芝孢子油的0.1％～2.5％；其酸值按《中华人民共和国药典》2005年版一部附录IXP酸败度测定法中的酸值测定法测定小于或等于25。

灵芝孢子脂肪酸甘油三酯类是由脂肪酸与甘油结合构成，为复合灵芝孢子油的主成分；脂肪酸类为复合灵芝孢子油中游离脂肪酸；复合灵芝孢子油中的结合脂肪酸与游离脂肪酸及灵芝酸之和为总有机酸，其中含量最高者为油酸，灵芝孢子脂肪酸甘油三酯类通过水解，得到的有机酸，与游离脂肪酸及灵芝酸一起，采用滴定法测定，以油酸为标准计算其总有机酸的含量，本发明所提供的复合灵芝孢子油中总有机酸的重量含量为复合灵芝孢子油的90％以上。

复合灵芝孢子油中总有机酸含量测定方法：将复合灵芝孢子油样品溶于中性乙醇(对酚酞指示液显中性)中，精密加入过量的氢氧化钾乙醇溶液，置水浴中加热回流1.5小时，让复合灵芝孢子油中的三酸甘油酯类充分水解，并中和复合灵芝孢子油中的游离脂肪酸、灵芝酸和水解脂肪酸，再用盐酸液滴定中和过量的氢氧化钾，通过消耗的氢氧化钾的量计测定样品中的总有机酸的含量。

精密称取本品0.8g，加中性乙醇(对酚酞指示液显中性)10ml，精密加入氢氧化钾乙醇溶液(0.5mol/L)25ml，置水浴中加热回流1.5小时，放冷，用中性乙醇10ml冲洗冷凝器，合并溶液，加酚酞指示液3滴，用盐酸液(0.5mol/L)滴定至粉红色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的盐酸液(0.5mol/L)相当于282.47mg的油酸(C18H34O2，分子量282.47)。

式中    A-供试晶消耗盐酸液(0.5mol/L)的毫升数

        B-空白试验消耗盐酸液(0.5mol/L)的毫升数

        C-盐酸液的摩尔浓度(0.5mol/L)

        G-供试品的重量(g)

灵芝酸类为灵芝、灵芝孢子中活性很强的一类成分，在复合灵芝孢子油中灵芝酸类成分有灵芝酸C、灵芝酸E、灵芝酸B等，灵芝酸类的重量含量以灵芝酸E计为复合灵芝孢子油的0.1％～2.5％。

复合灵芝孢子油中总灵芝酸的含量测定：对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥过夜的灵芝酸E对照品2.5～7.5mg，置于25ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液溶解，并稀释至刻度，摇匀，每1ml中含灵芝酸E为0.1～0.3mg。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分别置10ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液至刻度，摇匀；以相应的饱和NaHCO₃溶液为空白，照紫外-分光光度法，在262nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：取灵芝孢子油制剂1～5g，精密称定，加石油醚10～50ml溶解，加入已处理好的硅胶柱(8g，18mm×400mm)上，加入100～150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝25∶75的混合溶液洗脱，弃去洗脱液，硅胶柱继续加入100～150ml乙酸乙酯∶甲醇＝80∶20的混合溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加氯仿20ml，超声2min溶解，转移置分液漏斗中，用饱和NaHCO₃萃取4次，每次20ml，合并萃取液，置100ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。照分光光度法，在262nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中灵芝酸E的重量，计算，即得。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的复合灵芝孢子油的提取是以灵芝孢子与灵芝菌丝体或灵芝子实体为原料，灵芝菌丝体和灵芝子实体的成本远低于灵芝孢子，因此扩大了灵芝孢子的应用资源，节约了生产成本。

2、本发明的复合灵芝孢子油主要化学组成清楚，易控制产品的质量，产品纯度高。

3、本发明的复合灵芝孢子油不仅具有和纯灵芝孢子油相同的效果，而且比纯灵芝孢子油作用强度更大。生理活性很强的灵芝酸类成分的含量复合灵芝孢子油明显高于纯灵芝孢子油。

4、本发明采用超临界CO₂流体萃取法制备复合灵芝孢子油，干压一步制粒法将复合灵芝孢子粉制成颗粒后提取，解决了超临界CO₂提取时的冲料的安全性和提取不完全的问题，制粒方法简单，不需要经过加热和干燥的过程，避免了因加热而造成成分破坏的可能。采用超声超临界CO₂流体萃取时，将超声提取和超临界流体萃取技术相结合，在相同的萃取时的温度和压力下又能缩短提取时间。与传统方法相比，本发明的提取方法生产周期短、有效成分不易破坏，无溶剂残留、不污染环境等优点。

具体实施方式

实施例1

取破壁率在95％以上的赤芝的灵芝孢子粉3kg、粉碎为200目的灵芝菌丝体粉2kg，加入淀粉50g，混合均匀，用干压制粒机直接干压制粒，主压力5MPa，侧压力0.5MPa，制成0.2～0.3cm的颗粒，过筛，筛去60目以上的细粉，细粉再同法制粒。制得的孢子粉颗粒，置于超临界二氧化碳萃取釜中，CO₂经高压泵加压，循环萃取。萃取釜的压力为25MPa，温度40℃，一级分离10MPa、42℃，二级分离5MPa、32℃。连续萃取3小时后，于分离器中收集孢子油，得淡黄色具有孢子粉特殊气味的复合灵芝孢子油764.8g，收率15.30％。其中：总有机酸的含量为97.36％，总灵芝酸的含量为1.67％，酸值为8.7。

实施例2

取破壁率在95％以上的赤芝的灵芝孢子粉5kg，加入淀粉50g，用与实施例1相同的实验条件与方法萃取，得淡黄色具有孢子粉特殊气味的纯灵芝孢子油905.1g，收率18.21％。其中：总有机酸的含量为93.73％，总灵芝酸的含量为0.42％，酸值为13.9。得到的纯灵芝孢子油与实施例1的复合灵芝孢子油比较，复合灵芝孢子油中总灵芝酸的含量明显较高。

实施例3

取破壁的灵芝孢子粉6kg、粉碎为180目的灵芝菌丝体粉3kg，加入糊精45g，混合均匀，用干压制粒机直接干压制粒，主压力8MPa，侧压力0.8MPa，制成0.1～0.2cm的颗粒，过筛，筛去60目以上的细粉，细粉再同法制粒。制得的复合孢子粉颗粒，置于超临界二氧化碳萃取釜中，CO₂经高压泵加压，循环萃取。萃取釜的压力为34MPa，温度30℃，一级分离9MPa、38℃，二级分离4MPa、28℃。连续萃取2.5小时后，于分离器中收集孢子油，得淡黄色具有孢子粉特殊气味的复合灵芝孢子油1482.3g，收率16.47％。其中：总有机酸的含量为98.55％，总灵芝酸的含量为1.32％，酸值为10.5。

实施例4

取破壁的灵芝孢子粉3kg、粉碎为250目的灵芝菌丝体粉6kg，加入淀粉108g，混合均匀，用干压制粒机直接干压制粒，主压力6MPa，侧压力0.6MPa，制成0.2～0.3cm的颗粒，过筛，筛去60目以上的细粉，细粉再同法制粒。制得的复合孢子粉颗粒，置于超临界二氧化碳萃取釜中，CO₂经高压泵加压，循环萃取。萃取釜的压力为15MPa，温度38℃，一级分离12MPa、40℃，二级分离5MPa、30℃。连续萃取4小时后，于分离器中收集孢子油，得淡黄色具有孢子粉特殊气味的复合灵芝孢子油1092.6g，收率12.14％。其中：总有机酸的含量为96.93％，总灵芝酸的含量为1.94％，酸值为15.7。

实施例5

取破壁的灵芝孢子粉6kg、粉碎为200目的灵芝子实体粉3kg，加入淀粉80g，混合均匀，用干压制粒机直接干压制粒，主压力6MPa，侧压力0.7MPa，制成0.1～0.2cm的颗粒，过筛，筛去60目以上的细粉，细粉再同法制粒。制得的复合孢子粉颗粒，置于加装了超声提取装置的超临界流体萃取釜中提取，CO₂经高压泵加压，循环萃取。萃取釜的压力为26MPa，温度35℃，当达到指示的温度和压力时，开启超声设备，超声波的频率为35kHz，功率为100W；一级分离9MPa、40℃，二级分离4MPa、34℃。连续萃取1.5小时后，于分离器中收集孢子油，得淡黄色具有孢子粉特殊气味的复合灵芝孢子油1515.7g，收率16.84％。其中：总有机酸的含量为98.31％，总灵芝酸的含量为1.58％，酸值为11.3。

实施例6复合灵芝孢子油的药效学实验

试验条件：

样品：按上述工艺分别以复合灵芝孢子粉(灵芝菌丝体粉∶灵芝孢子粉＝1∶1)、纯灵芝孢子粉获得的复合灵芝孢子油、纯灵芝孢子油作为供试样品。

实验动物与环境条件：清洁级昆明种雌性小鼠96只，体重为18g～22g，由南方医科大学动物养殖场提供。每48只分为1组，共二组。I组进行迟发型变态反应实验、半数溶血值(HC₅₀)的测定和抗体生成细胞数的测定；II组进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验测定。实验温度23℃～24℃，湿度58％～60％。

剂量选择及样品处理：据人体口服推荐量，按60公斤成人为0.04g/kg·bw设计，设纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油剂量分别为0.80g/kg·bw(分别相当于人体推荐剂量的20倍)。分别取样品4.50g加豆油定容配成所需浓度受试液，对照组予以等体积的豆油，分别给予受试动物灌胃，每天一次，灌胃体积为0.2ml/10g·bw，连续30d。

实验方法：根据国家《保健食品功能学评价程序和检验方法》(2003版)进行。实验数据统计所得数据采用SAS软件进行分析。

1.纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油对小鼠的迟发型变态反应的影响见表1。

表1、对小鼠迟发型变态反应的影响

组别	动物只数(只)	注射后24小时跖肿胀度(mm)	P值(与对照组比较)
				对照组纯孢子油组复合孢子油组	161616	0.38±0.180.57±0.140.71±0.16	＜0.05＜0.01

由表1可知，经口给予小鼠纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油30d，剂量组小鼠足跖肿胀度与对照组比较，差异具有显著性，且复合灵芝孢子油组差异更显著。

2.纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油对小鼠ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力实验的影响，见表2。

表2、对小鼠ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力实验的影响

组别	动物只数(只)	淋巴细胞增殖能力(OD差值)	P值(与对照组比较)
				对照组纯孢子油组复合孢子油组	161616	0.042±0.0230.076±0.0320.089±0.037	＜0.05＜0.01

由表2可知，经口给予纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油30d，剂量组小鼠淋巴细胞转化能力与对照组比较，差异具有显著性，且复合灵芝孢子油组差异更显著。

3.纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油对小鼠抗体生成细胞数的影响，见表3。

表3、对小鼠抗体生成细胞数的影响

组别	动物只数(只)	溶血空斑数(×103/全脾)	P值(与对照组比较)
				对照组纯孢子油组复合孢子油组	161616	22.31±17.1342.15±16.5147.32±18.25	＜0.05＜0.05

由表3可知，经口给予小鼠纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油30d，剂量组小鼠抗体生成细胞数与对照组比较，差异具有显著性。

4.纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油对小鼠半数溶血值(HC₅₀)的影响，见表4。

表4、对小鼠半数溶血值(HC₅₀)的影响

组别	动物只数(只)	半数溶血值	P值(与对照组比较)
				对照组纯孢子油组复合孢子油组	161616	170.7±20.8196.6±27.4218.9±28.7	＜0.05＜0.01

由表4可知，经口给予小鼠纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油30d，剂量组小鼠半数溶血值与对照组比较，差异具有显著性，且复合灵芝孢子油组差异更显著。

5.结论：纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油经口给予小鼠0.80g/kg·bw剂量，均能提高小鼠的半数溶血值、小鼠迟发型变态反应(DTH)能力、ConA诱导的淋巴细胞转化能力、增加抗体生成细胞数，且复合灵芝孢子油比纯灵芝孢子油作用更强。依据《保健食品功能学评价程序和检验方法》中免疫调节作用的判定标准，可以认为纯灵芝孢子油、复合灵芝孢子油均具有增强免疫力功能。

Claims (7)

1、一种复合灵芝孢子油，其特征在于含有甘油三酯类、脂肪酸类和灵芝酸类，其总有机酸含量以油酸计大于或等于90％，总灵芝酸0.1～2.5％，酸价小于或等于25。

2、权利要求1所述复合灵芝孢子油的制备方法，其特征是以灵芝菌丝体粉或灵芝子实体粉与灵芝孢子粉组成的复合灵芝孢子粉为原料，采用超临界流体萃取或超声强化超临界流体萃取其油状复合脂质物质，即为复合灵芝孢子油。

3、如权利要求2所述的复合灵芝孢子油的制备方法，其特征在于所述超临界流体萃取的流体为CO₂，萃取温度为21～42℃，萃取压力为10～34Mpa，萃取时间为1～5小时，萃取流量为32～58kg/h；采用二级分离，分离的条件是：一级解析器压力为9～13Mpa，二级解析器压力为4～6MPa。

4、如权利要求2所述的复合灵芝孢子油的制备方法，其特征在于所述超声强化超临界流体萃取的流体为CO₂，萃取温度为21～42℃，萃取压力为10～34Mpa，萃取时间为1～5小时，萃取流量为32～58kg/h；采用二级分离，分离的条件是：一级解析器压力为9～13Mpa，二级解析器压力为4～6Mpa；超声频率为25～60kHz，功率为60～800W。

5、如权利要求2所述的复合灵芝孢子油的制备方法，其特征在于所述的灵芝菌丝体粉或灵芝子实体粉与灵芝孢子粉的重量比为：灵芝菌丝体粉或灵芝子实体粉∶灵芝孢子粉＝0.5～3∶1。

6、如权利要求2所述的复合灵芝孢子油的制备方法，其特征在于所述的灵芝菌丝体粉或灵芝子实体粉是指将灵芝菌丝体粉碎至大于或等于120目的细粉，所述灵芝孢子粉是指将灵芝孢子破壁至破壁率≥95％的灵芝孢子粉。

7、如权利要求2所述的复合灵芝孢子油的制备方法，其特征在于：先往复合灵芝孢子粉原料中加入0.2％～1.2％的淀粉或糊精，混合均匀，采用制粒机干压制成粒径大小为0.1～0.3cm的颗粒，再进行超临界萃取或超声强化超临界萃取。