CN102140101B - 一种制备Herpetrione的方法及其应用、其胶囊剂及胶囊剂的制备方法和应用 - Google Patents
一种制备Herpetrione的方法及其应用、其胶囊剂及胶囊剂的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种制备Herperione的方法及其应用、其胶囊剂及胶囊剂的制备方法和应用，属于中药制剂技术领域。所述制备Herperione的方法包括：(1)对波棱瓜子粗粉进行醇提，得到煎煮液；(2)对煎煮液进行抽滤浓缩，脱去脂肪油至石油醚无色；常温挥至无石油醚味，加入10％的乙醇溶液洗涤；取沉淀用乙酸乙酯反复溶解，回收乙酸乙酯干燥得粗品；(3)粗品上硅胶中压制备，收集馏分，回收干燥得Herperione。其胶囊剂是通过探头超声、高压乳匀，得混悬液后，干燥制粒灌装所得。其中Herperione及其胶囊剂均用于治疗乙肝。本发明具有提取及制剂工艺稳定、质量可控、处方量用量小、疗效高、释药快、口服易吸收等优点。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂发明技术领域，具体涉及一种制备Herpetrione的方法及其应用、其胶囊剂及胶囊剂的制备方法和应用。
背景技术
我国是病毒性肝炎高发区，其中的慢性乙型肝炎因其病情逐渐发展、不易控制、预后差、发病机理复杂而尤为引起关注。目前全国有近1.3亿人是乙型肝炎病毒携带者，5000万人患有慢性肝炎，每年死于肝炎的患者约23万人(2002年12月国家卫生部的一项调查统计数据表明：肝炎依然是我国发病率和死亡率均居首位之传染病种),加上其它已知和未知的因病毒异化引发的病毒性肝炎病种，导致我国人群的发病率更高,危害性更大。据不完全统计，我国每年直接用于肝炎防治的医疗费用超过1000亿元人民币,因此,慢性乙型肝炎的治疗仍为当前肝病领域中的难题之一,国内外盛行的干扰素、核苷类药物治疗虽然具有一定疗效,但前景不容乐观。目前,病毒性肝炎治疗尚无根本性突破,其总体患病人数仍有不断上升趋势,而肝炎慢性化的问题仍未解决。由于国内围产期及幼年感染比例高、乙肝疫苗在部分地区普及程度较低,原有HBV携带人群基数巨大等原因,在目前乃至未来数十年内，乙肝病毒等引起的慢性肝炎仍将是严重危害我国人民健康的疾病之一。
波棱瓜子是藏药中治疗肝病的首选药物之一，在用于治疗肝病的藏药成方制剂中，有一半以上入药。但是，由于其有效成分为难溶性木脂素类成分，大大影响药物的溶出和吸收。在CN1857367的专利公开文件中，发明人公开了从波棱瓜子中提取出包含PED I、PED II、herpetal、herpetin、herpetrione和herpetetrone的波棱瓜子提取物，由于提取工艺的限制不能将其中的有效成分单独分开，因此造成了在治疗乙肝时用药质量不好控制，针对性不强的缺点。
发明内容
为了解决上面提到的现有技术所存在的问题，本发明的一个目的是公开了一种制备Herpetrione的方法。
本发明的第二个目的在于公开了Herpetrione在制备治疗乙肝药物中的应用。
本发明的第三个目的在于公开了由Herpetrione制备所得的胶囊剂及其制备方法和应用。
本发明的技术方案如下：
一种制备Herpetrione的方法，包括以下步骤：
(1)、对波棱瓜子粗粉进行醇提，得到煎煮液；
(2)、对步骤(1)获得的煎煮液采用板框抽滤法进行抽滤，滤液于60℃减压浓缩至2g生药/ml，放冷,高速离心,分去油层和水层,沉淀加入石油醚,脱去残留的脂肪油,静置,倾去上清液，重复操作至石油醚无色；沉淀物常温挥至无石油醚味，加入生药量1/16～1/4的浓度为10%的乙醇溶液持续搅拌10min，离心，弃上清液，重复操作2次；取沉淀，加入生药量1/5的乙酸乙酯，持续搅拌10min，离心，取上清液，沉淀重复洗涤4次；合并乙酸乙酯溶液，于50℃减压浓缩，干燥，得Herpetrione的含量达到15%以上的粗品；
(3)粗品以8倍量溶剂溶解，其中所述溶剂由石油醚和丙酮组成，石油醚和丙酮之间的质量比为2:3，上中压硅胶柱，其中所述中压硅胶柱由三支粒度为200～300目的120g硅胶柱串联组成，流动相由石油醚:乙酸乙酯:丙酮按2:7:1的质量比组成，检测波长240nm，流速120ml/min,收集馏分，回收干燥，即得目标产物Herpetrione。
上述技术方案中所述的制备Herpetrione的方法，其中，所述步骤(1)的醇提过程是将波棱瓜子粗粉用6～10倍粗粉量的80%乙醇进行煎煮提取，提取2次，每次2小时，合并煎煮液。
上述技术方案中所述的制备Herpetrione的方法，其中，所述步骤(2)中在沉淀中加入的石油醚的量为生药量的1/4，10%的乙醇的加入量为生药量的1/8。
上述技术方案中所述的制备Herpetrione的方法，其中，所述步骤(3)中上中压硅胶柱的上样量为硅胶填料的1/5到1/20，优选上样量为35g。
用上述技术方案中任一技术方案所述的制备Herpetrione的方法制备所得的Herpetrione在制备治疗乙肝药物中的应用。
一种胶囊剂，包括活性成分和药学上可接收的辅料，其中，所述活性成分为用上述技术方案中任一技术方案所述的方法制备所得的Herpetrione。
上述技术方案中所述的胶囊剂,其中,所述胶囊剂中各成分的重量比为Herpetrione:十二烷基硫酸钠：poloxamer：微晶纤维素：羧甲淀粉钠100：2：8：30：3。
上述技术方案中所述的胶囊剂的制备方法，包括下述步骤：称取所述重量配比的Herpetrione、十二烷基硫酸钠、poloxamer、微晶纤维素、羧甲淀粉钠和硬脂酸镁，将Herpetrione、十二烷基硫酸钠、poloxamer、微晶纤维素和羧甲淀粉钠，加入蒸馏水，充分搅拌混匀，4000r/m的探头超声5分钟后，在压力为1000bar条件下高压乳匀10圈，得混悬液；真空干燥，过80目筛，70%乙醇制粒，干燥，制粒，分装胶囊，即得胶囊剂。
上述技术方案中所述的胶囊剂在制备治疗乙肝药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、在本发明Herpetrione的制备工艺中采用了三个硅胶柱串联的形式，能够使Herpetrione的提纯比例达到90%以上，满足了用药上的要求；
2、由于采用了上述技术方案,获得了Herpetrione及其成药Herpetrione胶囊，且具有提取及制剂工艺稳定、质量可控、处方量用量小、疗效高、释药快、口服易吸收等优点；
3、用本发明所述的提取工艺将对乙肝具有针对性治疗效果的Herpetrione单独提取，纯度高，达到国家食品药品监督管理局的1类中药注册要求，同时采用先进的纳米混悬技术给药，因此具有药物用量小、疗效高、释药快、口服易吸收等优点。
附图说明：
图1为试验例三Herpetrione对照品的高效液相色谱图；
图2为试验例四中试验1的色谱图；
图3为试验例四中试验2的色谱图；
图4为试验例四中试验1、2接收液的HPLC分析图谱；
图5为试验例四中空白样品检测的HPLC分析图谱；
图6为试验例四中试验3的色谱图；
图7为两种不同溶出介质下的Herpetrione胶囊累积溶出曲线；
图8为Herpetrione胶囊累积溶出速率曲线，其中红色代表Herpetrione纳米混悬剂胶囊，蓝色代表普通胶囊；
图9为本发明的制备工艺流程图。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明
实施例一：Herpetrione的制备：
实施例1-1、Herpetrione的制备：
(1)、对波棱瓜子干燥品进行粉碎后获得波棱瓜子粗粉，粗粉按照《中华人民共和国药典》（一部，2005年版）的定义为粗粉是指全部通过标准二号筛，但混有能通过标准四号筛的粉末不超过40％的粉末。；
(2)、对波棱瓜子粗粉用6～10倍粗粉量的80%乙醇进行煎煮提取，提取2次，每次2小时，合并得到煎煮液；
(3)、对步骤(1)获得的煎煮液采用板框抽滤法进行抽滤，滤液于60℃减压浓缩至2g生药/ml，放冷，高速离心，分去油层和水层，沉淀加入生药量1/4的石油醚，脱去残留的脂肪油，静置，倾去上清液，重复操作至石油醚无色；沉淀物常温挥至无石油醚味，加入生药量1/8的浓度为10%的乙醇溶液持续搅拌10min，离心（3000r/min，5min），弃上清液，重复操作2次；取沉淀，加入生药量1/5的乙酸乙酯，持续搅拌10min，离心，取上清液，沉淀重复洗涤4次；合并乙酸乙酯溶液，于50℃减压浓缩，干燥，得粗品；
(4)粗品以8倍量溶剂溶解，其中所述溶剂由石油醚和丙酮组成，石油醚和丙酮之间的质量比为2:3，上中压硅胶柱，其中所述中压硅胶柱由三支粒度为200～300目的120g硅胶柱串联组成，流动相由石油醚:乙酸乙酯:丙酮按2:7:1的质量比组成，检测波长240nm，流速120ml/min,收集馏分，回收干燥，即得目的产物。
实施例1-2、Herpetrione的制备：
本实施例步骤与实施例1-1相同，区别在于：步骤（2）中加入的乙醇为8倍粗粉量；步骤（3）中10%乙醇的加入量为生药量的1/16。
实施例1-3、
Herpetrione的制备：
本实施例步骤与实施例1-1相同，区别在于：步骤（2）中加入的乙醇为9倍粗粉量；步骤（3）中10%乙醇的加入量为生药量的1/4。
对实施例1-1、1-2和1-2所获得的目的产物进行质谱分析，其结果如下：
质谱分析[M+H]+=553,得到分子量为552。
峰位归属：13C中化学位移δ=198.423呈现一羰基不饱和碳的响应信号，151.641、147.969、147.694、147.322、145.887、142.999显示为六个连接有氧原子的芳香羰，132.731、132.002、128.785、123.258表明分子中存在四个非氧取代芳香碳质子。123.079、118.660、117.216、114.680、114.389、111.406、109.579、108.024表明分子中有六个未取代芳香碳。13C谱在85.984、85.841、71.204、71.162、54.979、54.637位移表明四氢呋喃并四氢呋喃环的存在，此外，化学位移在53.972、53.841、53.739的相应信号提示分子结构中包含三个甲氧基团。13C NMR谱与已知文献（Kaouadji M,FavreBJ.Herpetrione,a trimeric lignoide isolated from Herpetospermum caudigerum Wall[J].Tetrahedron Lett,1983,24(52):5881-5884）中报道的herpetrione结构相应，同时，1H NMR的峰位归属能够印证上述推断。
经质谱分析，本发明的目的产物为herpetrione，结构式为：
实施例二：Herpetrione纳米混悬剂胶囊的制备：
按照重量比为Herpetrione:十二烷基硫酸钠:poloxamer：微晶纤维素：羧甲淀粉钠100：2：8：30：3，称取Herpetrione、十二烷基硫酸钠、poloxamer、微晶纤维素、羧甲淀粉钠，然后将Herpetrione、十二烷基硫酸钠、poloxamer、微晶纤维素和羧甲淀粉钠，加入蒸馏水,充分搅拌混匀,4000r/m的探头超声5分钟后,在压力为1000bar条件下高压乳匀10圈,得混悬液；真空干燥,过80目筛，70%乙醇制粒,干燥,制粒，分装胶囊，即得。
实施例三：采用Rp-HPLC法对原料药中herpetrione的含量进行测定：
1仪器与材料
1.1仪器：高效液相色谱仪(配有DAD检测器，Agilent-1100型 美国)；色谱柱（Alltima C18 2504.6mm 5μm瑞典)；微量进样器(25μl，Hamilton美国)；微量分析天平(Mettler AE163瑞士)等。
1.2材料：Herpetrione对照品(供含量测定用，实验室自制，纯度超过98%)；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
上述Herpetrione对照品10g进样，经高效液相色谱测定，并用归一化法计算，含量为99.13%，符合含量测定要求，见图1。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备 取Herpetrione对照品10mg,精密称定,置10ml量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取1.0ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备 取实施例一制备所得的目的产物约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇振摇，使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45m)滤过，取续滤液即得。
2.3色谱条件
色谱柱：Alltima(C18 5 2504.6mm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(25:75)；流速1.0ml/min；检测波长240nm；柱温：30℃。此条件下Herpetrione能达到基线分离。
2.4测定结果
如表1所示，Herpetrione的含量在90%以上。
表1 原料药中herpetrione的含量
以下通过本发明制备的产物Herpetrione及Herpetrione胶囊的药效学试验来进一步阐述本发明产物Herpetrione及Herpetrione胶囊在治疗乙肝所具有的有益效果：
一、仪器、试剂与动物
1、仪器
BS-224生化分析测定仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。
2、药品与试剂
Herpetrione,按照实施例一方法制备所得。Herpetrione胶囊，按照实施例二的方法制备所得。联苯双酯，北京协和药厂(批号09048102)。拉米夫啶，英国葛兰素威康有限公司产(批号：00212010)。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）测定试剂盒，为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)测定试剂盒，均为北京中生生物工程高技术公司产品。环磷酰胺(Cy)粉针剂，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号：09048521。D-半乳糖胺(DGalN)，-萘异硫氰酸酯(ANIT1-Naphthlisothiocyanat，纯度95%，sigma产品)。卡介苗(BCG)，北京生物制品研究所生产，批号：090917。脂多糖(LPS)，Sigma公司产品，批号：L2688。植物血凝素(PHA)，Sigma公司产品，批号：L8754。Eagles MEM干粉、G-418(Geneticin)、酵母t-RNA、蛋白酶K，美国GIBCO公司产品。胎牛血清，美国Hyclone Lab公司产品。L-谷氨酰胺，京科化学试剂公司进口分装。HBsAg、HBeAg固相放免测定盒，中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品。卡那霉素，华北制药厂产品。其它试剂均为市售分析纯。
3、动物
Wistar大鼠，体重190-210g，雌雄各半，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK-(军)2007-004)；昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄各半，由军事医学科学院动物中心(动物合格证号：：SCXK-(军)2007-004)；1日龄北京鸭，80-100g,由北京医科院药植所动物饲养场提供。动物实验条件：贰级标准，合格证号：军医动字第B98006。
二、实验内容
1、抗乙肝病毒试验
采用抗鸭乙肝病毒试验，对以Herpetrione抗肝炎病毒药效学初筛评价。以DHBVDNA为观察指标，分析在同一水平下不同剂量的药效作用，并进行了重复验证试验。按原料药计，分别以0.03g/kg日、0.06g/kg日、0.1g/kg日三个剂量给予感染DHBVDNA的一日龄雏鸭，在给药后5天(T5)、10天(T10)、停药后3天(P3)取血，采用斑点杂交方法测定血清中DHBVDNA水平，判断药物对DHBVDNA的抑制作用。结果见表2,3：
表2原料药在鸭体内对DHBVDNA的抑制率(第1批)
表3原料药在鸭体内对DHBVDNA的抑制率(第2批)
以上药效学评价结果证明：原料药抗鸭乙肝病毒作用显著。
2、保肝降酶实验
2.1、对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响
取Wistar大鼠，按体重随机分为6组，每组10只，正常对照组、肝损伤模型组、Herpetrione低、中、高(0.045g、0.09g、0.18g/kg)三个剂量组。除正常对照组外，各组动物腹腔注射10%CCl4橄榄油溶液0.5ml/100g体重，每周两次,共12周，正常对照组ip生理盐水。造模同时每日ig给药一次(0.5ml/100g体重，正常对照组ig同体积的蒸馏水)。实验结束前，动物禁食12小时，取股动脉血，以3000转/分离心10分钟，分离血清，测定ALT、AST、TP、ALB，采血后将动物处死，取肝组织作羟脯氨酸测定，计算肝胶原蛋白含量(结果见表4、5)。
表4对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响(n=10)
与正常组比较#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较*p<0.05,**p<0.01
表5对大鼠肝胶原蛋白含量的影响(X±SD)
与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01
表4、5结果表明，Herpetrione可抑制多次注射CCl4引起的大鼠血清转氨酶的升高、总蛋白和白蛋白降低，减少肝胶原蛋白含量。
2.2、对D-GalN所致小鼠急性肝损伤的影响
取健康小鼠48只随机分为六组，即正常对照组、DGalN(800mg/kg)模型组、联苯双酯组0.029g/kg、Herpetrione三个剂量组，每组8只。每日ig给药2次，对照组及模型组给与相同容积的蒸馏水，给药7次后，除正常对照组外，小鼠ip D-GalN 0.2ml/10g，造模后20小时，小鼠眶静脉采血，测血清ALT、AST值如表6所示。
表6Herpetrione胶囊对D-GalN致小鼠急性肝损伤的影响(X±SD)
与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01
表6结果表明，各给药组小鼠血清ALT、AST值均低于模型对照组，Herpetrione高、中剂量组与模型组比较有显著性差异，说明Herpetrione对D-GalN所致小鼠急性肝损伤具有一定的治疗作用。
2.3、对CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响
取健康小鼠48只随机分为六组，即正常对照组、CCl4(0.02ml/kg)模型组、联苯双酯组0.029g/kg、Herpetrione(0.013、0.026、0.052g/kg)三个剂量组，每组8只。每日ig给药2次，对照组及模型组给与相同容积的蒸馏水，连续给药7次药后，除正常对照组外，小鼠ip 0.1%CCl4 0.2ml/10g，造模后40小时，小鼠眶静脉采血，测血清ALT、AST值如表7所示。
表7Herpetrione胶囊对CCl4致小鼠急性肝损伤的影响(X±SD)
与模型组相比,*p<0.05,**p<0.01;与正常对照组相比,#p<0.05,##p<0.01
表7结果表明,各给药组小鼠血清ALT、AST值均低于模型对照组，Herpetrione高、中、低剂量组与模型组相比有显著性差异,说明Herpetrione对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有明显的治疗作用。
2.4、对小鼠免疫性肝损伤的影响
健康小鼠48只，随机分为六组,正常对照组、模型组、联苯双酯组(0.029g/kg)、Herpetrione三个剂量组,每组8只,小鼠ig（灌胃）给药2次/日,共10天。给药前除正常对照组外,每鼠尾静脉注射0.25%BCG 2.5mg,10天后每鼠再尾静脉注射LPS 2.5μg攻击,12小时后眼球后静脉丛取血测血清ALT、AST，结果如表8所示。
表8对小鼠免疫性肝损伤的影响(X±SD)
与正常对照组比较,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
表8结果表明,Herpetrione对BCG+LPS所致免疫性肝损伤小鼠血清转氨酶的升高有明显的抑制作用,与模型组相比有显著性差异。
3、对肝脏解毒和代谢作用的影响
小鼠随机分为六组,正常对照组、模型组、联苯双酯(0.029 g/kg)组、Herpetrione(0.065g、0.13g、0.26g/kg)三个剂量组,每组8只,灌胃给药，每次0.5ml/只，每天2次，对照组同法给蒸馏水，连续一周。于给药第6天，除正常对照组外，其余5组各组分别灌胃AAP 175mg/kg，24小时后，即第7天给药1小时后，摘除小鼠眼球取血，分离血清，测定ALP和TG，见表9。
表9 Herpetrione胶囊对AAP致小鼠肝损伤的影响
与空白组相比，##p<0.01, #p<0.05；与模型组相比,**p<0.01,*p<0.05
表9结果表明，AAP明显损害肝脏功能，使ALP活性显著升高，而Herpetrione可使AAP致肝损伤小鼠的碱性磷酸酶(ALP)活性显著下降，与模型组相比,有显著性差异，且大剂量组明显降低血中甘油三酯(TG)含量，提示Herpetrione胶囊具有一定的解毒作用。
试验例四、Herpetrione纯化工艺试验：
1、中压仪器色谱条件：
流动相：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（2：7：1）
检测波长240nm 辅助波长280nm
流速：120ml/min
固定相：硅胶柱，120g/根，3根串联
2、液相色谱检测条件：
色谱柱：HALOTM C18 2.1*50mm 2.7um
流动相：水：乙腈=77:23+0.1%磷酸
柱温：30℃
流速：0.4mL/min
进样量：2μL
色谱仪：SPD-10A
试验1、120g（cs）硅胶柱3根串联，40～60μm，
流速：120ml/min 检测器：检测波长240nm，辅助波长280nm；进样量：35g（235ml）；收集时间：19.5～28.6min，结果如图2所示。
试验2、使用试验1的条件重复进样35g（235ml），收集时间：18.4～25.9，结果如图3所示。
纯度测试
将以上两针（试验1和试验2）的收集液合并，混匀后，取1ml于小瓶中，40℃下氮气吹干，用2ml流动相溶解，按前述样品分析条件进样1ul，测试纯度。面积归一化法计算峰纯度为92%，色谱图如图4所示。
空白样品检测：取配好的流动相20ml，40℃下氮气吹干，2ml流动相溶解，进样2ul，图谱如图5所示。
试验3、重复试验1的条件上样40g（268ml），结果如图6所示，可以看出杂质峰和主峰连在一起，不能达到分离要求。
结论：
(1)、上样量为35g时，此色谱条件下能实现很好的分离，目标峰同杂质峰间拐点明显，便于收集，纯度达到要求。继续加大上样量，和杂质峰不能有效分开，纯度不能达到要求。因此最大上样量定为35g。
(2)、分析时间在30min内，从样品溶解到样品浓缩旋干，整个分离过程，最大可能的缩短周期。
(3)、从开始出现拐点至下一个拐点结束，收集目标峰组分，经HPLC测定，纯度达到91%以上，在保证纯度的基础上，实现最大范围的收集。
(4)、目标峰和两干扰杂质峰都可很好的分开且工艺具有很好的重复性，此工艺可作为最终的其制备工艺。
试验例五、Herpetrione胶囊的溶出度研究
一、仪器与材料
1、仪器：ZRS-6智能溶出仪（天津大学无线电厂）；高效液相色谱仪(配有DAD检测器，Agilent-1100型 美国)；色谱柱（Alltima C18 250
4.6mm 5μm瑞典)；微量进样器(25μl，Hamilton美国)；微量分析天平(Mettler AE163瑞士)等。
2、材料：Herpetrione对照品(供含量测定用，实验室自制，纯度超过98%)；Herpetrione纳米混悬剂胶囊（按照实施例二的制备方法制备所得3批样品）；普通胶囊（制备方法为：Herpetrione按照实施例二的方法，与辅料混匀后，未经超声探头和高压乳匀工艺，直接加辅料整粒灌装而成的未纳米混悬胶囊）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。
二、方法与结果
1、溶出介质的选择：
由Herpetrione结构分析得知，Herpetrione显酸性，其在氢氧化钠试液中溶解，在水中不溶。因此选用两种不同的溶出介质pH=6.8的磷酸盐缓冲液(A)和pH=7.5的磷酸盐缓冲液(B)为溶出介质进行试验，照溶出度测定项下方法，经不同时间取样（并同时补液）测定溶出量。结果见图7，故确定以pH=7.5的磷酸盐缓冲液作为溶出介质。
2、对照品溶液的制备：
取Herpetrione对照品10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
3、供试品溶液的制备：
取Herpetrione纳米混悬剂胶囊照溶出度测定法(《中国药典》2010年版附录XC第二法)，以磷酸盐缓冲液pH=7.5(0.05mol/L磷酸二氢钾与0.05mol/L磷酸二氢钠等量混合，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.5)900ml为溶出介质,转速为100r/min-1，依法操作，45min时，取溶液适量，滤过即得。
4、色谱条件：
色谱柱：Alltima(C18 5μ250
4.6mm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(25:75)；流速1.0ml/min；检测波长240nm；柱温：30℃。此条件下Herpetrione能达到基线分离。
5、溶出曲线的绘制：
照溶出度测定项下方法，取6粒Herpetrione纳米混悬剂胶囊，分别于10、20、30、45、60min时取样2ml（并同时补液），滤过，取续滤液作为供试品溶液，计算出每粒的溶出量，溶出曲线见图8。
6、溶出度的测定
取Herpetrione纳米混悬剂胶囊6粒，按2010年版《中国药典（二部）》附录XC溶出度测定法第二法，以磷酸盐缓冲溶液pH=7.5(0.05mol/L磷酸二氢钾与0.05mol/L磷酸二氢钠等量混合，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.5)900ml为溶出介质,转速为100r/min-1，依法操作，45min时分别取样2ml，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；分别吸取供试品溶液、对照品溶液各20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱峰峰面积，按外标法计算出供试品溶液的质量浓度，并计算出每粒的溶出度。药物溶出量限度为75%。
7、样品测定结果
取Herpetrione纳米混悬剂胶囊及Herpetrione普通胶囊，按溶出度测定项下方法进行测定，结果见表10、图8，可见Herpetrione胶囊的溶出速度及程度明显优于普通胶囊。
表10Herpetrione纳米混悬剂胶囊与普通胶囊累积溶出速率的比较
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种制备Herpetrione的方法，包括以下步骤：
(1)、对波棱瓜子粗粉进行醇提，得到煎煮液；
(2)、对步骤(1)获得的煎煮液采用板框抽滤法进行抽滤，滤液于60℃减压浓缩至2g生药/ml，放冷，高速离心，分去油层和水层，沉淀加入石油醚，脱去残留的脂肪油，静置，倾去上清液，重复操作至石油醚无色；沉淀物常温挥至无石油醚味，加入生药量1/16～1/4的浓度为10%的乙醇溶液持续搅拌10min，离心，弃上清液，重复操作2次；取沉淀，加入生药量1/5的乙酸乙酯，持续搅拌10min，离心，取上清液，沉淀重复洗涤4次；合并乙酸乙酯溶液，于50℃减压浓缩，干燥，得Herpetrione的含量达到15%以上的粗品；
(3)粗品以8倍量溶剂溶解，其中所述溶剂由石油醚和丙酮组成，石油醚和丙酮之间的质量比为2:3，上中压硅胶柱，其中所述中压硅胶柱由三支粒度为200～300目的120g硅胶柱串联组成，流动相由石油醚:乙酸乙酯:丙酮按2:7:1的质量比组成，检测波长240nm，流速120ml/min,收集馏分，回收干燥，即得目标产物Herpetrione。
2.根据权利要求1所述的制备Herpetrione的方法，其特征在于：所述步骤(1)的醇提过程是将波棱瓜子粗粉用6～10倍粗粉量的80%乙醇进行煎煮提取，提取2次，每次2小时，合并煎煮液。
3.根据权利要求1所述的制备Herpetrione的方法，其特征在于：所述步骤(2)中在沉淀中加入的石油醚的量为生药量的1/4，10%的乙醇的加入量为生药量的1/8。
4.根据权利要求1所述的制备Herpetrione的方法，其特征在于：所述步骤(3)中上中压硅胶柱的上样量为硅胶填料的1/5到1/20。
5.根据权利要求1所述的制备Herpetrione的方法，其特征在于：所述步骤(3)中上中压硅胶柱的上样量为35g。
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