CN102641347A - 一种赤芍提取物及其制备和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种赤芍提取物及其制备和应用方法；该提取物以中药赤芍为原料提取而成，其中含有芍药苷和芍药内酯苷分别为29%~42.05%、0.80%~15%。本发明提取物的制备方法以该提取物中的芍药苷和芍药内酯苷含量、水分含量、炽灼残渣量、重金属含量为指标进行优化得到。本发明可更好的控制赤芍提取物的质量，保证用药安全性，深度开发质量可控、物质基础明确的赤芍药物，以顺应中药现代化的要求。

Description

一种赤芍提取物及其制备和应用方法

技术领域

本发明涉及一种赤芍提取物，具体地，是以中药赤芍为原料的提取物及其制备方法和制备治疗慢性阻塞性肺疾病药剂的用途；属于药物领域。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是具有气流受限不完全可逆特征并呈进行性发展的肺部慢性炎症性疾病。COPD由于患病人数多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的公共卫生问题。在美国，COPD居当前慢性疾病死亡原因的第4位（Saetta M,Turato G,Maestrelli P,et al.Am J Respir Crit Care Med,2001,163(6):1304.）。近年来COPD在我国也日益引起重视，已成为严重危害我国人民健康的重要慢性呼吸系统疾病。COPD涉及小气道和肺实质的慢性炎症，但是现在还没有特效药物能遏制COPD病情的进行性进展，目前临床上常把治疗哮喘的药物用于治疗COPD，疗效不尽理想。随着对COPD发病机制的研究，中医药治疗慢性阻塞性肺疾病临床研究也不断深入，很多传统中药发挥着多靶点多途径的药理作用，已经表现出良好的治疗效果。文献表明，由黄芪、赤芍、补骨脂三味药组成的补肺活血胶囊具有改善COPD和哮喘症状的疗效（郭欢，张海文.中国全科医学,2007,10(8)：667.李彬，苏轮.实用心脑肺血管病杂志，2006,14(9)：728）。其中，赤芍是毛茛科植物芍药或川赤芍的干燥根，属于常用中药，具有清热凉血，散瘀止痛之功效，以往研究证明赤芍还具有抑制血小板和红细胞聚集、抗血栓、抗动脉粥样硬化、保护心脏和肝脏、抗肿瘤等多种药理作用（阮金兰等.中国药理学通报，2003，19（9）:965～970.）。对于赤芍活血化瘀有效成分的研究，主要针对水溶性成分进行研究，其中以单萜及单萜甙类化合物成分为主要的研究对象。因此，针对赤芍进行试验，可进一步发掘赤芍有效成分用于治疗慢性阻塞性肺疾病。

目前，药动学用于中药研究可为中药制剂生产工艺的设计、内在质量的评价与监控提供有效手段和方法。口服给药是中药治疗的主要方式，影响口服生物利用度的因素很多，研究药物的吸收对于指导药物给药系统研究有重要意义。评价药物吸收的模型有很多种，有离体法和在体法，目前较多采用大鼠在体单向肠灌流模型，这种模型以较低的流速某一肠道进行单向灌流，根据进出口处灌流液中的药物浓度差考察药物在该肠段的吸收，其实验条件与口服给药后药物接触的肠道环境较接近，吸收速率稳定，与人体有良好相关性（谭晓斌等.中成药，2007，29（11）：1665-1668）。而从药物动力学研究角度，采用相应分析手段对大鼠灌胃给药后收集的血液、尿液等生物样品进行分析，结合大鼠在体肠灌流实验技术，找出中药进入体内的成分，筛选出能反映赤芍物质作用基础的指标成分；可更好的控制该药物的质量，保证用药安全性，深度开发质量可控、物质基础明确的赤芍药物，以顺应中药现代化的要求。目前尚无针对本发明标准的赤芍提取物及其制备和应用方法的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种赤芍提取物及其制备和应用方法。

一种赤芍提取物，是以赤芍为原料提取得到的，所述的赤芍提取物含有芍药苷、芍药内酯苷，质量百分比分别相应为29%~42.05%、0.80%~15%。

所述的赤芍来源于毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall)或川赤芍（Paeoniaveitchii Lynch）的干燥根。

所述的赤芍提取物的水分不超过3%、炽灼残渣量不超过0.6%、重金属含量不超过10ppm。

所述的赤芍提取物用于制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药剂。包括以赤芍提取物为主要有效成分与多种医用辅料（赋型剂，稀释剂，香味剂、甜味剂、润滑剂等）配合，制成多种剂型的药物使用，如冻干粉针，注射液，大输液，片剂，胶囊，颗粒剂以及口服液等。

一种赤芍提取物的制备方法，包括如下步骤：

取赤芍饮片，先用其8~12倍体积量60%乙醇，再用其6~10倍体积量60%乙醇各浸泡提取1次，每次1h~1.5h，滤过，合并提取液，减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调节其浓度不超过0.3g/mL，即每1mL药液中含生药赤芍量不超过0.3g，滤过，然后通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比1∶4-1∶12，流速1-3ml/min，上样量不超过0.6g生药·ml^-1树脂，以1~2倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用4~8倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，继续浓缩得干膏，经干燥，得赤芍提取物。

优选包括如下步骤：

取赤芍饮片，先用其10倍体积量60%乙醇，再用其8倍体积量60%乙醇各提取1次，每次1.5h，滤过，合并提取液，减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调节其浓度为0.3g/mL，即每1mL药液中含生药赤芍量为0.3g，滤过，通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱；树脂柱径高比1∶8，吸附流速4倍柱体积/h，上样量2倍柱体积，以2倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用6倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，60℃继续浓缩得干膏，经60℃干燥，得赤芍提取物。

所述的赤芍提取物含有芍药苷、芍药内酯苷，质量百分比分别相应为29%~42.05%、0.80%~15%。

所述的赤芍来源于毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall)或川赤芍（Paeoniaveitchii Lynch）的干燥根。

所述的赤芍提取物的水分不超过3%、炽灼残渣量不超过0.6%、重金属含量不超过10ppm。

本发明提供了一种赤芍提取物，以中药材赤芍为原料提取而成。本发明采用大鼠在体肠单向灌流法，比较药材灌胃液灌流前后经小肠吸收减少的成分是否与灌胃给药吸收入血成分一致；灌流结束后采血，检测血浆样品，进一步确定赤芍药材吸收入血成分有芍药内酯苷和芍药苷，并以这些成分及其含量作为标准；根据其优化提取工艺和富集纯化工艺，最终获得精制而成的本发明提取物，同时水分含量、炽灼残渣量、重金属含量也作为标准，在优化提取工艺和富集纯化工艺时考虑。本发明可更好的控制该药物的质量，保证用药安全性，深度开发质量可控、物质基础明确的赤芍药物，以顺应中药现代化的要求。

附图说明

图1是赤芍灌胃液HPLC指纹图谱；

图2是大鼠灌胃赤芍后血浆HPLC典型图谱（A空白血浆，B含药血浆）；

图3是大鼠灌胃赤芍后尿液HPLC典型图谱（A空白尿样，B含药尿样）；

图4是大鼠灌胃赤芍后粪样HPLC典型图谱（A空白粪样，B含药粪样）。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1：赤芍药材中特征成分为主的色谱指纹图谱的建立以及赤芍入血成分的确定方法

1.1材料和仪器

1.1.1药品和试剂

赤芍饮片购自湖南省九旺医药有限公司，经鉴定为川赤芍的干燥根部。芍药内酯苷对照品购自上海尚宜科技有限公司，芍药苷和萘普生对照品购自中国药品生物制品检定所，没食子酸、苯甲酸、磷酸和盐酸为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。乙腈为色谱纯（Burdick& Jackson），水为纯净水。

1.1.2仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪-DAD，LD 3D系统化学工作站（安捷伦科技）；RE—5298A系列旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TGL16M型台式高速冷冻离心机（长沙英泰仪器有限公司）；XW—80A微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；shangping-JA2003N型千分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；Sartoriuos-BS224s万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；3700M071型代谢笼（Tecniplast）；MTN-2800D氮气吹干装置；艾柯超纯水机（成都艾柯）。

1.1.3实验动物

SD大鼠（清洁级），雄性，体重180-220g，购于中南大学湘雅医学院实验动物学部。

1.2给药方法和样品收集

1.2.1赤芍灌胃液的制备

参照文献（中国专利申请号02135035.3），取赤芍饮片适量，加入10倍量水，加热回流1h，过滤，再加入8倍量纯水，继续加热回流1h，滤液合并、浓缩至一定密度，再加入乙醇至含醇量约为60%，静置24h，过滤，挥去乙醇，浓缩得赤芍稠膏。稠膏用水溶解得赤芍灌胃液，每毫升赤芍灌胃液约相当于1.2克赤芍药材。

1.2.2单次给药

取9只大鼠，实验前大鼠禁食12h，先于眼眶静脉丛处采空白血，每只统一灌胃2.6ml赤芍灌胃液，灌胃后1h、2h、3h分别处死3只，采血后，分别置于肝素化管中离心分离出血浆。另取3只大鼠置三个代谢笼内，灌胃前分别收集空白尿样和粪样，并禁食12h，可自由饮水，每只统一灌胃2.6ml赤芍灌胃液，并收集灌胃后各代谢笼中大鼠0-3h、3-6h、6-9h、9-24h、24-36h、36-48h、48-72h的尿样，及0-24h、24-48h、48-72h的粪样。

1.2.3连续给药

取9只大鼠,实验前禁食12h，可自由饮水。每只统一灌胃2.6ml赤芍灌胃液，连续给药3天，每天两次。其中，6只大鼠给药前采集空白血，连续给药结束后分别于0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h各时间点于眼眶静脉丛处取血约0.5ml。另取3只大鼠置代谢笼内，给药前分别收集空白尿样和粪样，给药后每隔24h收集一次尿样和粪样，连续收集5天。收集到的血样、尿样和粪样的处理方法同单次给药。

1.3样品处理和色谱分析

1.3.1色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C₁₈(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸（含10mmol/L乙酸铵），梯度洗脱条件为：0~5min乙腈8%→12%；5~35min乙腈12%→22%；35~45min乙腈22%→80%；45~50min乙腈维持80%；后运行10min。流速：0.8ml/min；色谱峰光谱采集范围190nm-400nm；检测波长：230nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

1.3.2血浆的处理

取血浆450μl,分别加入等体积1mol/L盐酸，50μl 85μg/ml萘普生甲醇液（参照物），96℃水浴30min，按1：4（v/v）加乙酸乙酯萃取2次，每次涡旋2min后3000r/min离心5min，合并萃取液，氮气吹干，残渣用100μl流动相（水相：乙腈=92：8）复溶后进样。

1.3.3尿样的处理

取尿液450μl，分别加入等体积1mol/L盐酸，50μl 85μg/ml萘普生甲醇液（参照物），96℃水浴30min，按1：4（v/v）加乙酸乙酯萃取2次，每次涡旋2min后3000r/min离心5min，合并萃取液，氮气吹干，残渣用450μl流动相（水相：乙腈=92：8）复溶后进样。

1.3.4粪样的处理

粪样晾干后研细，称取1.0g，加入10ml水，50μl磷酸，超声30min，静置12h，13000r/min离心10min，取上清液1.0ml，加入50μl 85μg/ml萘普生甲醇液（参照物），按1：4（v/v）加乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，氮气吹干，残渣用100μl流动相（水相：乙腈=92：8）复溶后进样。

1.4结果

1.4.1赤芍灌胃液指纹图谱的建立

取1.2.1方法下制得赤芍灌胃液1ml，纯水稀释五倍后，230nm处赤芍灌胃液图谱色谱峰指纹信息最多，信号最强，色谱峰形状和各峰的分离度较好，并且杂质峰较少。故选230nm处所得色谱图进行比较。1.3.1色谱条件下进样，得到赤芍指纹图谱,共有16个特征峰(见图1)。根据对照品，可确定峰1、峰5、峰6和峰13分别为没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酸。取药材样品，按赤芍灌胃液制备方法进行制备，连续进样5次，检测指纹图谱。结果表明，测得各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，表明仪器精密度良好。取同一赤芍饮片5份，按赤芍灌胃液制备方法进行制备，检测指纹图谱，结果表明，测得各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，表明其重复性良好，符合指纹图谱要求。每隔24小时将稀释后的同一赤芍灌胃液进样一次，共进样三次，结果表明赤芍灌胃液三天内稳定性良好。

1.4.2血浆分析

血浆的预处理在预实验时曾使用甲醇蛋白沉淀法，高氯酸蛋白沉淀法，乙腈蛋白沉淀法离心后进样，与赤芍指纹图谱及空白血浆HPLC色谱图对比，发现血浆中含与赤芍灌胃液HPLC指纹图谱相同保留时间的峰很少且强度不高，考虑到赤芍提取物含有大部分盐，苷类成份，尝试用酸加热水解后乙酸乙酯萃取的方法处理血浆，结果发现效果较蛋白沉淀法好，故确定此方法为血样和尿样的处理方法。用1.3.2方法处理给药后不同时间段血浆与空白血浆和赤芍灌胃液HPLC指纹图谱对比，发现4个峰的保留时间与赤芍指纹图谱峰1、峰5、峰6、峰13的保留时间一致，可初步判断这些特征峰所代表的成分为赤芍灌胃液经胃肠道吸收后，以原型进入大鼠体内的成分，典型图见图2。

1.4.3尿样分析

用“1.3.3”项下方法处理给药后不同时间段尿样，其色谱图与赤芍灌胃液指纹图谱比较，发现4个峰的保留时间与赤芍指纹图谱峰1、峰5、峰6、峰13的保留时间一致，可初步推断这些成分为赤芍灌胃液进入大鼠体内经肾脏代谢后以原型排出的成分，典型图见图3。

1.4.4粪样分析

粪样的预处理比较了1：10（W/V）甲醇浸泡法和1：10（W/V）0.5%磷酸溶液超声30min两种方法，均静置12h后续处理步骤相同，结果发现用磷酸水溶液处理的粪样的色谱图峰形较好，确定此法为粪样处理方法。用1.3.4方法处理给药后不同时间段粪样，得到的HPLC图谱与赤芍灌胃液指纹图谱比较，发现4个峰的保留时间与赤芍指纹图谱峰1、峰5、峰6、峰13的保留时间一致，推测判断这些成分为赤芍灌胃液进入大鼠体内后通过胆汁排泄以原型排出体外，典型图见图4。

灌胃赤芍后不同时间的血浆、收集的尿样、粪样的HPLC图谱分别与赤芍灌胃液230nm下HPLC指纹图谱中的化学成分色谱峰比较，明确了没食子酸，芍药内酯苷、芍药苷，苯甲酸可以原型进入大鼠体内，给药后1小时血浆、3-6小时时间段的尿样、24小时内粪样中出现的色谱峰的数目多、信号强，是较好的取样时间。

实施例2：大鼠在体肠灌流方法研究赤芍吸收

本研究采用大鼠在体肠灌流的方法建立了赤芍提取物肠吸收模型，采用赤芍指纹图谱条件测定赤芍提取物，并对其吸收特性进行研究，为赤芍提取物的吸收研究提供生物药剂学依据。

2.1溶液的配制

（1）K氏液（Krebs－Ringer’s液）的配制：分别称取氯化钠7.8g、葡萄糖1.4g、碳酸氢钠1.37g、氯化钙0.37g、氯化钾0.35g、磷酸二氢钠0.32g、氯化镁0.02g，加适量蒸馏水溶解，加水稀释至1000mL，超声混匀即得K氏液。

（2）赤芍提取物K氏液的配制：赤芍灌胃液（1.2g/ml生药）按体积比1∶4加入K氏液，混和摇匀即可。

2.2大鼠在体肠吸收实验：

禁食12h的SD大鼠3只称重后，按0.3mL/100g腹腔注射10%的水合氯醛，麻醉后将大鼠分别固定在手术板上，沿腹中线剪开腹部，在十二指肠上部及回肠下部结扎，在结扎的两端开口后肠管插管，用37℃的生理盐水冲净肠内容物，经乳胶管接通蠕动泵，构成循环回路，并用经37℃生理盐水浸渍的纱布覆盖创口。

1只大鼠灌流空白K氏液，2只大鼠用K-R液配制成的赤芍供试药液灌流。先将药液快速泵入肠段，使肠段内充满药液，后将流速降至(0．2mL/min)，同时开始记时，进口处用已知质量的装有供试液的小瓶进行灌流，于出口处收集流出的灌流液直至实验结束，记录流出液质量并将所灌流的肠段内残液冲出。并从心脏采血，制备血浆。所取灌流液样品经0．45微米的微孔滤膜过滤，取续滤液进行HPLC分析，血浆样品经处理后进样分析，比较灌流液中药物减少成分是否与血浆中入血成分一致。

2.3结果

明显可见四个成分入血,保留时间分别为5.7min、17.38min、19.7min、34.0min，根据对照品比对，可初步判断分别是没食子酸、芍药内酯苷，芍药苷和苯甲酸。

实施例3：本发明赤芍提取物的制备

根据实施例1和2的结果用芍药苷和芍药内酯苷为指标成分作为赤芍提取物正交试验法优化提取工艺和考察大孔吸附树脂富集纯化最佳工艺的双指标。

3.1提取工艺的优化

赤芍中的活性部位通过大鼠体内研究以证明为赤芍总苷，其中以芍药苷、芍药内酯苷的含量最高，选择芍药苷和芍药内酯苷为含量测定的指标成分。

（1）HPLC色谱条件色谱柱：Agilent C18(2)（4.6×250mm，5μm），流动相：乙腈－0.1％磷酸溶液（含10mmol/L乙酸铵）梯度洗脱，流速：1.0ml/min,检测波长：230nm,柱温：30℃，进样量：10μl。

（2）对照品溶液的制备

分别取芍药苷10mg和芍药内酯苷5mg，精密称定，分别置10ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即分别得芍药苷对照品贮备液（1.018mg/ml）和芍药内酯苷对照品贮备液（0.490mg/ml）。

（3）标准曲线的制备

分别精密量取芍药苷和芍药内酯苷对照品贮备液，配制成浓度分别为含芍药苷7.953μg/ml、15.906μg/ml、31.81μg/ml、63.625μg/ml、127.25μg/ml和509μg/ml，以及含芍药内酯苷3.82μg/ml、7.64μg/ml、15.28μg/ml、30.56μg/ml、61.125μg/ml、122.25μg/ml和244.5μg/ml的混合标准系列甲醇溶液。取上述不同浓度系列溶液分别经HPLC分析，按前述色谱条件分别测定，以标准溶液浓度（C）对相应峰面积（Y），绘制标准曲线，并得芍药苷线性方程Y1=0.0823C1-0.8345，相关系数R=0.9999；芍药内酯苷线性方程Y2=0.0926C2-2.5474，相关系数R=0.9999。以上结果表明芍药苷和芍药内酯苷浓度分别在7.953~509μg/ml和3.82~244.5μg/ml范围内与峰面积有良好的线性关系。

（4）供试品溶液的制备及测定

取提取液，稀释至一定体积，滤过，即得供试品溶液。由外标法一点法计算即得芍药苷和芍药内酯苷含量。

3.2赤芍提取物提取工艺的正交试验考察：

赤芍提取物提取工艺正交因素水平表见表3-1，赤芍提取物提取工艺正交试验表见表3-2，通过做正交试验及正交验证实验，确定最佳提取条件。

表3-1赤芍提取物提取工艺正交因素水平表

表3-2赤芍提取物提取工艺正交试验表

将正交实验结果用SPSS10.0软件进行方差分析，结果见表3-3，结果表明芍药苷：ABC三个因素都有显著影响(P<0.05)，芍药内酯苷：C因素有显著影响(P<0.05)，AB因素无显著影响(P>0.05)；提取工艺最佳条件：A2B3C3组合，即用10倍量60％乙醇加热回流1次后再用8倍量回流1次，每次1.5h。

表3-3赤芍提取物正交实验方差分析表

芍药苷（％）

3.3赤芍提取物纯化条件研究

在优化好的提取工艺条件下，运用大孔吸附树脂进行分离精制工艺，其操作步骤为：大孔吸附树脂的预处理→树脂上柱→赤芍提取液上柱→大孔吸附树脂的解吸→大孔吸附树脂的清洗、再生。

3.3.1上柱液的制备

称取赤芍饮片适量，按所确定的优化工艺条件提取，回收乙醇至无醇味，加一定量水稀释，离心20min(2500r/min),取上清液定容至一定体积，即得上柱液（每1ml相当于原生药0.2g）.

3.3.2大孔吸附树脂的筛选

目前用于分离的大孔树脂种类很多，不同型号的树脂极性和官能团各有差异，对不同成分的吸附性能差别明显，因而根据具体的分离纯化目的，首先需要选择适宜的大孔吸附树脂，以保证大孔吸附树脂对待分离组分的高选择性和高吸附性，从而满足分离纯化的要求，提高分离纯化的效率。本实验以芍药苷和芍药内酯苷的吸附量与解析率为评价指标，考察了D101、D-130、AB-8三种不同极性的大孔树脂在纯化赤芍苷类成分的效果，以确定纯化赤芍总苷的的大孔吸附树脂类型。

3.3.3树脂预处理

取以上三种树脂适量，加95%乙醇浸泡至充分溶胀，湿法装柱，以95%乙醇洗脱至乙醇液与水混合（1：2）不呈白色浑浊，用纯水洗至无醇味，用2倍柱体积的5%的HCl洗脱，纯水洗至中性，用2倍柱体积的5%的NaOH洗脱，再用纯水洗至中性，备用。

3.3.4不同类型大孔吸附树脂静态吸附性能的考察

分别量取三种树脂各5ml,置100ml具塞三角瓶中，分别精密加入赤芍提取液30ml上样液（生药浓度为0.2g/ml），静置24h，每隔半小时振摇一次，测定各树脂在0.5h、1h、1.5h、2h、14h药液中指标成分的含量，静态吸附率=(原液浓度-吸附残液浓度)/原液浓度；结果见表3-4，由表2可知三种树脂中D101型对芍药内酯苷和芍药苷的吸附率比D130和AB-8型高。

表3-4三种吸附树脂的吸附性能

3.3.5不同类型大孔吸附树脂静态洗脱性能的考察

在上述吸附饱和的各种树脂中，分别加入30ml 95%乙醇，静置24h，前2h每隔半小时振摇一次，滤过，测定滤液中指标成分的浓度，根据吸附量计算解析率（%）。静态解析率=（解析液浓度×解析液体积）/〔（原液浓度-最终吸附残液浓度）×上样液体积〕。静态吸附实验和静态解析实验表明，考察的几种树脂中D101型树脂有最大的吸附率和最大解析率，分别为90.36%和83.79%。因而三种树脂中D101型树脂更适合赤芍总苷类成分的分离纯化（表3-5）。

表3-5三种吸附树脂的解吸附性能

3.3.6D101型树脂纯化工艺动态吸附研究

影响大孔树脂纯化工艺动态吸附效果的因素主要有上样液浓度及用量、径高比、吸附流速，因而在大孔树脂动态吸附阶段，本实验主要从以上四个因素方面考察D101大孔树脂纯化赤芍总苷的工艺。

3.3.6.1上样液浓度考察

精密称取120.0g赤芍饮片，按优化提取工艺提取，提取液回收乙醇至无醇味，加一定量水稀释(相当于生药浓度为0.5g/ml)，将此提取液依次稀释，得到相当于生药浓度分别为0.4、0.3、0.2、0.1、0.05g/ml的系列上样液。将不同浓度的上样液以不同的体积，分别加到已处理好的装有15ml D101型大孔吸附树脂的吸附柱（径高比为1∶8）中，以1.0ml/min流速进行吸附，计算指标成分的吸附率，结果见表3-6。

表3-6上样浓度的考察结果

由上表可知，上样液生药浓度为0.05~0.5g/ml范围内，D101型大孔吸附树脂对芍药苷和芍药内酯苷有较高的吸附率，在此范围内，上液浓度的变化对此树脂的吸附性能影响不大，但随着上样液生药浓度的提高，可吸附的物质也相应增多，当生药浓度超过0.3g/ml后，树脂吸附量随之减少，这可能是上样液中与之竞争吸附的其他物质相应增加的缘故。从节约时间上考虑选择上样液浓度为0.3g/ml为最佳浓度。

3.3.6.2上样液吸附流速考察

将0.3g/ml的上样液10ml，分别加到已处理好的装有15ml D101型大孔吸附树脂的吸附柱（径高比为1∶8）中，分别以1、2、3、4、5ml/min的流速进行动态吸附，计算指标成分的吸附率，结果见表3-7。

表3-7上样液吸附流速的考察结果

测定不同流速动态吸附后提取液浓度，结果见上表，结果表明，当吸附流速为1~3ml/min时D101型树脂对赤芍总苷吸附影响不大，并且吸附率都比较高，吸附流速1ml/min时最佳。

3.3.6.3径高比考察

大孔吸附树脂内径与其柱高的比例是影响大孔吸附树脂吸附效果的因素之一。合适的径高比可为分离提供较高的柱效，从而更有利于大孔树脂的吸附和分离。分别量取8、11、15、19、23ml D101型树脂（沉降后体积），分别湿法装柱于同一型号（内径1.34cm，长30.5cm）的柱子中，径高比分别为1︰4、1︰6、1︰8、1︰10、1︰12，取一定体积药液（生药浓度0.3g/ml）上样，在1.0ml/min流速下进行吸附，收集流出液，测定指标成分含量，结果见表3-8，从结果可知，径高比为1∶8时，D101型树脂对赤芍总苷的吸附最佳。

表3-8径高比的考察结果

3.3.6.4上样量的考察

按照上述确定的工艺参数，将总体积为165ml的药液（生药浓度为0.3g/ml）通过装有15ml D101型树脂柱（径高比1︰8），以1ml/min的吸附流速进行动态吸附，分段收集流出液，每10ml收集一次，测定流出液中指标成分，计算泄漏百分率。结果见表9。

表3-9最大上样量考察

结果分析：由测定结果可知上样至第3份时累积泄露百分率超过5%；从泄露曲线可看出第3份末吸附的芍药苷和芍药内酯苷明显增大，说明上样至第3份时开始出现明显泄露，说明树脂柱此时不能完全吸附提取液中的赤芍总苷。为了使赤芍总苷保留完全，不造成浪费，设定泄漏点在上样液浓度为0.3g/ml，20ml为最大上样量，相当于最大上样量以生药计0.6g/ml树脂。

3.3.6.5洗脱剂浓度的考察

取已吸附的树脂，经2倍柱体积的蒸馏水洗脱后，依次用10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液各6倍柱体积的进行解析，分别收集解析液，测定解析液中的芍药内酯苷和芍药苷的浓度，结果见表3-10。从表可知，50%乙醇洗脱效果最佳。

表3-10洗脱剂浓度的考察

3.3.6.6洗脱剂用量的考察

取上样液（其中芍药内酯苷浓度4.266mg/ml和芍药苷浓度8.533mg/ml）20ml进行上柱、吸附和2倍柱体积水洗除杂，再以120ml50%乙醇洗脱,以每10mL为一个流分，连续接取。HPLC测定流分中芍药内酯苷和芍药苷含量，计算洗脱率，洗脱率%=洗脱液中含量/上样液中含量×100，结果见表3-11。可知，在第9份即洗脱剂用量为90ml时，能将大部分芍药内酯苷和芍药苷解吸下来，故确定洗脱剂用量为6倍柱体积。

表3-1150%乙醇作为洗脱剂用量的考察

3.3.6.7验证实验

采用D101大孔吸附树脂，在上样浓度0.3g/ml（生药浓度），吸附流速4倍柱体积/h，上样量2倍柱体积，洗脱剂为50%乙醇6倍柱体积的条件下纯化赤芍总苷，计算纯度（纯度=(洗脱液中含量)/(干膏重量)×100%），按上述确定的工艺条件进行验证试验，结果见表3-12。从表可知芍药内酯苷和芍药苷平均收率分别为95.5%和91.7%，纯度分别为15.86%和28.54%，此工艺稳定性及分离纯化效果良好，适合赤芍总苷的分离纯化。

表3-12D101型树脂纯化赤芍提取物的工艺验证结果

赤芍提取物的最优选提取工艺和富集纯化工艺如下：取赤芍饮片，先用其10倍体积量60%乙醇，再用其8倍体积量60%乙醇各提取1次，每次1.5h，滤过，合并提取液，减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调节其浓度为0.3g/mL，即每1mL药液中含生药赤芍量为0.3g，滤过，通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱；树脂柱径高比1∶8；吸附流速4倍柱体积/h，上样量2倍柱体积，以2倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用6倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，60℃继续浓缩得干膏，经60℃干燥，得赤芍提取物。

实施例4：

采用色谱鉴别、指纹图谱、含量测定、水分、炽灼残渣、重金属含量等为指标。

4.1高效液相色谱鉴别

取赤芍提取物20mg，加甲醇10ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药内酯苷5mg，精密称定，加甲醇制成1ml含0.5mg的溶液，作为芍药内酯苷对照品储备液；另取芍药苷10mg，精密称定，加甲醇制成1ml含1mg的溶液，作为芍药苷对照品储备液。照赤芍提取物含量测定项下的方法试验，供试品与标准品主峰的保留时间一致。

4.2赤芍提取物指纹图谱研究

4.2.1供试品溶液的制备

取实验室小试样品赤芍提取物（批号20091002-1）约20mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

4.2.2对照品溶液的制备

分别取芍药内酯苷和芍药苷对照品，用甲醇溶解配成浓度分别为0.490mg/ml和1.001mg/ml的溶液，作为对照品储备液。

4.2.3色谱条件

赤芍总苷指纹图谱研究所用色谱条件如下，色谱柱:Agilent C18(2)（4.6×250mm，5μm）;流动相:乙腈(A)－0.1％磷酸(含10mmol/L乙酸铵)梯度洗脱，0-5minA:8%→12%,5-35min A:12%→22%,35-50min A:22%→70%；流速:1.0ml/min;检测波长:230nm;柱温:30℃;进样量:10μl。

4.2.4色谱指纹图谱试验的方法学验证

（1）稳定性试验

取同一供试品（批号：20091002-1）溶液，分别在0h、4h、8h、12h、20h等5个小时点进行检测，直观观察指纹图谱的轮廓无明显变化。

（2）重复性试验

取同一批号的供试品（批号：20091002-1）6份，按照供试品溶液的制备和检测方法进行检测，6份供试品溶液测得的色谱指纹图直观观察，表明指纹图谱的轮廓无明显变化。

（3）仪器精密度试验

取同一份供试品溶液（批号：20091002-1），连续进样6次，所得图谱比较，表明精密度良好。

（4）药材与赤芍总苷指纹图谱的比较

取赤芍总苷（批号）按前述方法制备供试液，分别进样分分析，得相应指纹图谱，赤芍总苷中各峰均可在药材指纹图谱中得到追踪。

4.3含量测定

（1）指标成分选择的依据

赤芍总苷中以芍药苷和芍药内酯苷含量最高，且为主要活性成分，选择二者为含量测定的指标成分能较好地控制赤芍总苷的质量。

（2）色谱条件

色谱柱:Agilent C18(2)（4.6×250mm，5μm）;流动相:乙腈(A)－0.1％磷酸(含10mmol/L乙酸铵)梯度洗脱，0-5minA:8%→12%,5-35min A:12%→22%,35-50min A:22%→70%；流速:1.0ml/min;检测波长:230nm;柱温:30℃;进样量:10μl。

（3）对照品溶液的制备

分别取芍药苷和芍药内酯苷对照品，精密称定，分别置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得芍药苷储备液（1.0018mg/ml）和芍药苷储备液（490μg/ml）。

（4）标准曲线的制备

分别精密量取芍药苷和芍药内酯苷对照品贮备液适量，分别置于同一量瓶中，得含芍药苷和芍药内酯苷的混合标准系列甲醇溶液，依次对半稀释得芍药苷浓度分别为15.65μg/ml、31.3μg/ml、62.61μg/ml、125.2μg/ml、250.45μg/ml和500.9μg/ml，以及芍药内酯苷浓度分别为7.4μg/ml、15.8μg/ml、31.625μg/ml、61.25μg/ml、122.5μg/ml和245μg/ml。取上述系列不同浓度溶液分别按前述色谱条件测定，以标准溶液浓度（C）对相应峰面积（Y），绘制标准曲线，并得芍药苷线性方程Y1=9.7981C1-12.127，相关系数R=1.0000；芍药内酯苷线性方程Y2=11.135C2+20.269，相关系数R=0.9999。以上结果表明芍药苷和芍药内酯苷浓度分别在15.653~500.9μg/ml和7.4~245μg/ml范围内与峰面积有良好的线性关系。

（5）供试品溶液的制备

取赤芍总苷约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取1ml该溶液置5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

（6）精密度试验

取同一份对照品溶液（含芍药苷浓度125.2μg/ml和芍药内酯苷61.25μg/ml），重复进样6次，测定二者峰面积，芍药苷RSD为0.55%、芍药内酯苷为0.84%（n=6），测定结果（见表4-1）表明精密度良好。

表4-1对照品精密度试验

（7）稳定性试验

取本品1份（批号20091002-1）19.59mg,照供试品溶液的制备方法制备供试液，在0、1、4、8、12、24h时进样，共5次，测定其峰面积积分值，芍药苷RSD为1.8%、芍药内酯苷为1.6%（n=6），测定数据见表4-2。结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

表4-2稳定性试验

（8）重复性试验

按供试品溶液的制备方法，取同一批样品（批号20091002-1）5份，制备样品溶液，分别进样测定，结果见表4-3，测得芍药苷峰面积RSD为2.33%、芍药内酯苷为2.89%（n=5），结果表明该方法重复性较好。

表4-3供试品重复性试验

（9）加样回收率试验

取已知芍药苷和芍药内酯苷含量的本品6份，每份各约10mg，精密称定，分别按样品中芍药苷和芍药内酯苷含量精密加入对照品溶液，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，测定芍药苷和芍药内酯苷含量，计算回收率，结果见表4-4.

表4-4加样回收率试验

（10）不同批次赤芍提取物中芍药苷和芍药内酯苷的含量测定

称取不同批次的赤芍提取物分别制备供试品溶液，测定含量，结果见表4-5。

表4-5三批赤芍总苷含量测定结果

由表可知三批供试品中四川赤芍中平均芍药苷和芍药内酯苷含量较高，内蒙古赤芍含量较低，表明不同来源的赤芍中芍药苷和芍药内酯苷含量差异较大。提示在进一步开发研究中应考虑规范药材来源。

4.4水分

按《中国药典》2010版一部附录IX H中的第一法项下操作，取本品粉末约1g，平铺于恒重的扁称量瓶中，厚度<5mm，精密称定，打开瓶盖在100~105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置于干燥器中，冷却30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止，根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。结果见表4-6。由表可知，三批样品平均含水量为2.31%。

表4-6水分测定结果

4.5炽灼残渣

取本品粉末约1g,置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温；加硫酸0.5ml使湿润，低温加热至硫酸蒸汽除尽后，在500~600℃炽灼使完全灰化，移置于干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500~600℃炽灼至恒重，结果见表4-7，由上表可知，三批样品平均炽灼残渣量为0.503%。

表4-7炽灼残渣检查结果

4.6重金属检查

取本品1.0g，按《中国药典》2010版一部附录IX E重金属检查法第二法炽灼破坏，检查三批样品，并同时做空白试验，标准管含Pb 10ppm。结果见表4-8。结果表明，三批小试样品重金属含量符合要求。

表4-8重金属检查结果

Claims (9)

1.一种赤芍提取物，其特征在于：是以赤芍为原料提取得到的，所述的赤芍提取物含有芍药苷、芍药内酯苷，质量百分比分别相应为29%~42.05%、0.80%~15%。

2.根据权利要求1所述的赤芍提取物，其特征在于：所述的赤芍来源于毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall)或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根。

3.根据权利要求1所述的赤芍提取物，其特征在于：所述的赤芍提取物的水分不超过3%、炽灼残渣量不超过0.6%、重金属含量不超过10ppm。

4.权利要求1-3任意一项所述的赤芍提取物的应用方法，其特征在于，用于制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药剂。

5.一种赤芍提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

取赤芍饮片，先用其8~12倍体积量60%乙醇，再用其6~10倍体积量60%乙醇各浸泡提取1次，每次1h~1.5h，滤过，合并提取液，减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调节其浓度不超过0.3g/mL，即每1mL药液中含生药赤芍量不超过0.3g，滤过，然后通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比1∶4-1∶12，流速1-3ml/min，上样量不超过0.6g生药·ml^-1树脂，以1~2倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用4~8倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，继续浓缩得干膏，经干燥，得赤芍提取物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

取赤芍饮片，先用其10倍体积量60%乙醇，再用其8倍体积量60%乙醇各提取1次，每次1.5h，滤过，合并提取液，减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调节其浓度为0.3g/mL，即每1mL药液中含生药赤芍量为0.3g，滤过，通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱；树脂柱径高比1∶8，吸附流速4倍柱体积/h，上样量2倍柱体积，以2倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用6倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，60℃继续浓缩得干膏，经60℃干燥，得赤芍提取物。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述的赤芍提取物含有芍药苷、芍药内酯苷，质量百分比分别相应为29%~42.05%、0.80%~15%。

8.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述的赤芍来源于毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall)或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根。

9.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述的赤芍提取物的水分不超过3%、炽灼残渣量不超过0.6%、重金属含量不超过10ppm。

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